CC BY
29
УДК 611.428-013.66-092.9-076
ОСОБЕННОСТИ СТАНОВЛЕНИЯ Т- И В-ЗОН БРЫЖЕЕЧНЫХ ЛИМФАТИЧЕСКИХ УЗЛОВ КРЫС В ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКОМ АСПЕКТЕ
П.В. Пугач, Н.Н. Сысоева, С.В. Круглов Северо-Западный государственный медицинский университет им. И.И. Мечникова,
Санкт-Петербург, Россия
FEATURES OF T- AND B-ZONES OF THE OF RATS MESENTERIAL LYMPH NODES FORMATION IN IMMUNOHISTOCHEMICAL ASPECT
P.V. Pugach, N.N. N.N. Sysoeva, S.V. Kruglov North-West State Medical University named after I.I. Mechnikov, Saint-Petersburg, Russia
© П.В. Пугач, Н.Н. Сысоева, С.В. Круглов, 2014
У новорожденных крыс брыжеечные лимфатические узлы - самая многочисленная группа лимфоузлов у человека и млекопитающих - находятся на разных этапах дифференцировки паренхимы. При этом данные о структурно-функциональной организации этих лимфатических узлов в раннем постнатальном онтогенезе крыс противоречивы. С началом энтерального питания лимфоузлы этой группы одними из первых подвергается мощной антигенной стимуляции, что приводит к их структурной, а, следовательно, и функциональной перестройке. В работе с использованием гистологических и иммуногистохимических методов исследования показана стадийность заселения паренхимы брыжеечных лимфатических узлов СD3-иммунореактивными клетками у крыс в раннем постнатальном периоде онтогенеза (от 0 до 21 суток постнатальной жизни). Эти клетки несут поверхностный маркер, специфичный для всех клеток субпопуляции Т-лимфоцитов. Первоначально наблюдается равномерное распределение CD3+ клеток по всей паренхиме лимфатических узлов, затем происходит накопление этих клеток в периферических отделах узлов, далее указанные клетки концентрируются в формирующихся первичных узелках и, наконец, CD3-иммунореактивные клетки выселяются из первичных узелков в диффузную часть коркового вещества и происходит формирование герминативных центров.
Ключевые слова: брыжеечные лимфатические узлы, CD3-клетки, иммуногистохимия
The most numerous group of lymph nodes at human and mammalians is represented by the mesenterial lymph nodes. They have different degree of parenchyma differentiation at newborn rats. But data of the structural and functional organization of this group of lymph nodes during early postnatal ontogeny are inconsistent. The result of the powerful antigen stimulation on this group of lymph nodes after enteral nutrition beginning is the structural and functional reorganization. The staging of CD3+ cells populating of mesenterial lymph nodes at rats during early postnatal ontogeny (from 0 till 21 day) is represented with using of histological and immune histological methods. These cells bring the specific superficial marker for whole population of the T-cells. Firstly the uniform placement of CD3+ cells on the lymph nodes parenchyma is observed, then accumulation of these cells occurs in peripheral parts of lymph nodes, further the indicate cells concentrate in the forming primary nodules and finally CD3+ cells migrate to diffuse part of lymph node cortex, forming of germinal centers take place.
Key words: mesenterial lymph nodes, CD3 cells, immunohistochemistry.
Введение
Брыжеечные лимфатические узлы у человека и большинства млекопитающих животных - это наиболее многочисленная группа лимфоузлов [1-5]. Недавние исследования показали, что у новорожденных крыс краниальные брыжеечные лимфатические узлы (КБЛУ) характеризуются выраженным полиморфизмом по степени дифференцировки своей паренхимы. В этой группе лимфоузлов встречаются как относи-
тельно «незрелые» КБЛУ с гомогенной паренхимой, так и узлы с первичными узелками (ПУ) [6-8]. Вместе с тем, определяя степень зрелости КБЛУ, необходимо учитывать и переходные состояния в организации паренхимы, которые практически невозможно выявить рутинными гистологическими методами исследования. Одним из современных методов исследования в арсенале иммунологии является иммуноги-стохимический (ИГХМ). Применение ИГХМ
для морфологических исследований лимфатических узлов с целью выявления отдельных популяций лимфоцитов в первую очередь дает возможность адекватно оценить их иммунопо-этические потенции как в норме, так и при экспериментальных воздействиях.
Давно известно, что паренхима лимфатических узлов делится на корковое и мозговое вещество (КВ и МВ). В современной редакции международной гистологической номенклатуры в КВ различают узелковую и диффузную части, а последняя, в свою очередь, подразделяется на межузелковую и глубокую части. Эти зоны различаются как по структурному, так функциональному компонентам. В лимфоузлах выделяют В- (герминативные центры и мозговые тяжи) и Т- (межузелковая и глубокая части коры) домены.
Данные о структурной организации брыжеечных лимфатических узлов в раннем постна-тальном периоде онтогенеза крыс до сих пор остаются противоречивыми [9, 8]. Однако с началом энтерального питания эта группа КБЛУ одной из первых подвергается мощной функциональной нагрузке, что приводит к их значительной структурно-функциональной перестройке.
Цель исследования - определить с применением иммуногистохимического метода исследования стадии становления Т- и В-зон в краниальных брыжеечных лимфатических узлах в раннем постнатальном периоде онтогенеза у крыс.
Материал и методы
Исследование краниальных брыжеечных узлов выполнено на 110 крысах в возрасте от 0 до 21 суток постнатальной жизни. Животных выводили из опыта в весенний период с марта по июнь. Исследования проводились с соблюдением приказа МЗ СССР № 755 от 12.08.1977 г. и приказа Министерства высшего и среднего специального образования СССР от 13.11.1984 года «О правилах проведения работ с использованием экспериментальных животных». Животных декапитировали под наркозом (пары хлороформа). КБЛУ выделяли под бинокулярной лупой МБС-2 в комплексе из брыжейки тонкой и толстой кишок, брыжеечных сосудов и нервов, а также жировой и лимфоидной ткани. Комплекс размещали на плотной бумаге и фиксировали в течение 24 часов в 10% растворе формалина, приготовленного на фосфатном буфере. После этого материал обезвоживали в спиртах возрас-
тающей концентрации и заливали в парафин. Затем на микротоме «Accu-Cut» изготовлялись серийные гистологические срезы толщиной 2-3 мкм. Для объективной морфологической оценки полученных срезов, выделенные комплексы резали в трёх взаимно перпендикулярных плоскостях. Срезы окрашивали гематоксилином и эозином, азуром II и эозином; маркеры зрелых тимоцитов выявлялись иммуногисто-химическим окрашиванием срезов мышиными анти-крысиными антителами к CD3 с последующей доокраской гематоксилином. CD3+ клетки несут поверхностный маркер, специфичный для всех клеток субпопуляции Т-лимфоцитов [10, 11]. Структуру КБЛУ изучали при помощи светового микроскопа «МИКРОМЕД-№ 3» со съемной камерой.
Полученные цифровые показатели обрабатывались с использованием статистического пакета Microsoft Excel, рассчитывали среднюю арифметическую и ее стандартную ошибку, значимость различий определяли по t-критерию Стьюдента; различия считали значимыми при Р<0,05.
Результаты и их обсуждение
У новорождённых крыс на обзорных препаратах при окраске гематоксилином и эозином КБЛУ имеют разную степень дифференциров-ки паренхимы - от гомогенной структуры до узлов с первичными узелками.
В группе КБЛУ без признаков корково-моз-говой дифференцировки с помощью ИГХМ дополнительно можно выделить узлы с единичными CD3-иммунореактивными клетками, количество которых колеблется от 2 до 5, а так же узлы с относительно равномерным распределением CD3+ клеток в паренхиме (рис. 1). Подсчет отдельных клеточных элементов в таких узлах показал, что в них значительно преобладают ретикулярные клетки. При этом в КБЛУ с единичными CD3+ клетками их процентное содержание составляет 85,5±7,3%, а в узлах с равномерным их распределением - 58,2±4,0%; содержание клеток лимфоидного ряда составляет 14,1±0,3% и 41,0±3,2 соответственно.
КБЛУ с начинающимся разделением паренхимы на КВ и МВ характеризуются увеличением плотности лимфоидных клеток в периферической части узла. Плотность CD3+ клеток больше, чем в лимфоузлах предыдущей группы, а их преимущественная локализация -в зоне формирующегося коркового вещества (рис. 2).
А Б В
Рис. 1. Краниальные брыжеечные лимфатические узлы с гомогенной паренхимой у новорожденной крысы:
А - окраска: гематоксилин и эозин, ув.: об. 10. ок. 10; Б - единичные CD3+ клетки, окраска на CD3+ клетки, ув.: об. 10. ок. 40; В - равномерное распределение СD3+ клеток, окраска на CD3+ клетки, ув.: об. 10. ок. 40
АБ
Рис. 2. Краниальный брыжеечный лимфатический узел с начинающейся корково-мозговой дифференцировкой паренхимы у новорожденной крысы: А - окраска гематоксилином и эозином, ув.: об. 40, ок. 10; Б - окраска на CD3+ клетки. ув.: об. 10, ок. 10
В таких узлах преобладают клетки лимфо-идного ряда, доля которых в формирующемся КВ больше, чем в МВ (73,0±5,8% и 58,6±4,7%); в таких узлах впервые регистрируются нейтро-фильные и базофильные гранулоциты.
В КБЛУ с ПУ СБ3 иммунореактивные клетки локализуются преимущественно в зоне узел-
ков. Однако плотность размещения СБ3+ может существенно варьировать даже в пределах одного узла (рис. 3). В ПУ таких КБЛУ отмечается наибольшее количество лимфоидных клеток, макрофагов, а также митотическая активность; появляются эозинофильные гранулоциты. В мозговых тяжах появляются плазматические клетки.
АБ
Рис. 3. Краниальные брыжеечные лимфатические узлы с первичными узелками (стрелки)
у новорождённой крысы в норме: МВ - мозговое вещество; А - окраска гематоксилин-эозином, ув.: об. 10, ок. 10; Б - окраска на CD3+ клетки, ув.: об. 10, ок. 10
Таким образом, наличие у новорожденных крыс КБЛУ с разной степенью дифференцировки их паренхимы свидетельствует о их гетерохрон-ном развитии в пренатальном онтогенезе. Так, в литературе неоднократно описано, что в течение внутриутробного развития в пределах одной топографической группы лимфоузлов можно видеть как сформированные узлы, так и узлы в стадии закладки [12-16]. Это, в свою очередь, подтверждает, что основные закономерности развития лимфатических узлов человека в большей или меньшей мере характерны и для крыс.
У крыс в возрасте 7 суток КБЛУ представлены преимущественно узлами с начинающейся корково-мозговой дифференцировкой и узлами с ПУ. В лимфоузлах узлах с начинающимся разделением паренхимы на КВ и МВ увеличивается плотность содержания CD3+ клеток в периферических отделах узла, по сравнению с новорожденными животными (рис. 4). Отмечается увеличение доли клеток лимфоидного ряда, повышается митотическая активность. В КБЛУ с ПУ увеличивается концентрация CD3+ клеток в узелках, а со стороны клеточного состава отмечается такая же тенденция, как и в узлах с начинающейся корково-мозговой диф-ференцировкой (рис. 5).
У животных в возрасте 14 суток во всех без исключения лимфоузлах регистрируются ПУ, в которых отмечается наибольшая плотность содержания CD3+ клеток. В клеточном составе продолжается увеличение числа лим-фоидных клеток при некотором снижении ми-тотической активности и усилении макрофа-гальной реакции.
На 21 сутки жизни у крыс встречаются как узлы с ПУ, так и со сформированными в них герминативными центрами. CD3+ клетки отсутствуют в центрах размножения и локализуются в межузелковой и глубокой частях КВ (рис. 6). Для клеточного состава герминативных центров характерно небольшое количества клеток лимфоидного ряда, отсутствие грануло-цитов и выраженная митотическая активность. В ряде узлов с ПУ иммуногистохимическая характеристика свидетельствует о начале появления в них герминативных центров, что проявляется резким снижением содержания в них СD3+ клеток.
Таким образом, становление Т- и В- зон в КБЛУ проходит четыре последовательные стадии: 1 стадия - постепенное заселение паренхимы брыжеечных лимфоузлов без корко-во-мозговой дифференцировки и равномерное распределение в ней CD3+ клеток; 2 стадия -накопление CD3+ в периферических (субкапсу-лярных) отделах узлов; 3 стадия - концентрация CD3+ клеток в первичных узелках; 4 стадия -выселение CD3+ из первичных узелков в диффузную часть коркового вещества и формирование герминативных центров.
Т.Н. Савицкая (1985) [9] в своем фундаментальном исследовании, посвященном развитию лимфатических узлов на разных этапах пре- и постнатального онтогенеза крыс, в целом приводит сходные данные о стадийности их становления, не учитывая, однако, вариабельность дифференцировки паренхимы КБЛУ у новорожденных животных и особенности дальнейшего их развития.
Рис. 4. Распределение СОЭ+ клеток в паренхиме брыжеечного лимфатического узла у крысы на 7 сутки жизни: КВ - корковое вещество; МВ - мозговое вещество. Окраска на СОЭ+ клетки, ув.: об. 40, ок. 10
Рис. 5. Первичный узелок брыжеечного лимфатического узла с высоким содержанием СОЭ+ клеток у крысы на 7 сутки жизни. Окраска на СОЭ+ клетки, ув.: об. 40, ок. 10
А Б
Рис. 6. Герминативные центры (1) в краниальных брыжеечных лимфатических узлах у крысы на 21 сутки жизни в норме. Окраска: А - гематоксилин-эозин; Б - окраска на СОЭ+
клетки; ув.: об. 4, ок. 10
Заключение
Таким образом, процесс становления Ти В-зон в краниальных брыжеечных лимфатических узлах состоит из 4 последовательных стадий:
- 1 стадия - заселение паренхимы CD3+ клетками и равномерное их распределение по всей паренхиме узлов без корково-мозговой дифференцировки;
- 2 стадия - накопление CD3+ в периферических отделах узлов;
- 3 стадия - концентрация CD3+ клеток в первичных узелках;
- 4 стадия - выселение CD3+ из первичных узелков в диффузную часть коркового вещества и формирование герминативных центров. При воздействии этанола происходит замедление темпов формирования герминативных центров и снижение плотности содержания CD3+ клеток на всех стадиях их формирования.
Литература
1. Иосифов, И.М. Лимфатическая система серой крысы / И.М. Иосифов // Труды Ереванского зооветеринарного института. - Ереван, 1944. - Вып. 8. - С. 227-255.
2. Григорьев, В.С. Возрастные изменения ретикулярной ткани и клеточного состава брыжеечных лимфатических узлов у плодов крупного рогатого скота / В.С. Григорьев // Уч. записки Казанского ветер. института. - Казань, 1975. -Т. 120. - С. 170-174.
3. Сапин, М.Р. Внеорганные пути транспорта лимфы / М.Р. Сапин, Э.И. Борзяк. - М. : Медицина, 1982. - 246 с.
4. Бородин, Ю.И. Функциональная анатомия лимфатического узла / Ю.И. Бородин [и др.]. -Новосибирск : Наука, 1992. - 257 с.
5. Ноздрачев, А.Д. Анатомия крысы / А.Д. Ноздрачев, Е.Л. Поляков. - СПб. : Лань, 2001. - 464 с.
6. Свирин, С.В. Строение брыжеечных лимфатических узлов у новорождённых крыс при воздействии алкоголя на систему «мать - плод» (экспериментально-морфологическое исследование) : автореф. дисс. ... канд. мед. наук / С.В. Свирин. - СПб., 2010. - 22 с.
7. Пугач, П.В. Строение брыжеечных лимфатических узлов новорожденных крыс в норме и после пренатального воздействия этанола / П.В. Пугач // Морфология. - 2010. - Т. 138, № 6. - С. 32-36.
8. Сысоева, Н.Н. Строение брыжеечных лимфатических узлов крыс в раннем постнатально онтогенезе при воздействии этанола (экспериментально-морфологическое исследование) : автореф. дисс. ... канд. мед. наук / Н.Н. Сысоева. -СПб., 2012. - 19 с.
9. Савицкая, Т.Н. Строение трахеобронхи-альных и брыжеечных лимфатических узлов в антенатальном и постнатальном периодах онтогенеза (анатомо-экспериментальное исследование) : дисс. . канд. мед. наук / Т.Н. Савицкая. -Л., 1985. - 251 с.
10. Цыплаков, Д.Э. Алгоритм иммуногисто-химического исследования лимфатических узлов: Принципы иммуномечения, характеристика антител и совр. классиф. CD-антигенов) / Д.Э Цыплаков, С.В. Петров. - Казань, 1998. -31 с.
11. Wurch, A. Reduced generation but efficient TCR beta-chain selection of CD4+8+ doublepositive thymocytes in mice with compromised CD3 complex signaling // A. Wurch // J. Immunol. - 1999. - Vol. 162, № 5. - Р. 2741-2747.
12. Сушко, А.А. Некоторые особенности функциональной анатомии лимфатической системы / А.А. Сушко, Л.В. Чернышенко. - Киев : Здоров'я, 1966. - 288 с.
13. Жарикова, Н.А. Периферические органы системы иммунитета (развитие, строение, функции) / Н.А. Жарикова. - Минск : Беларусь, 1979. - 205 с.
14. Угримова, В.Е. Сроки закладки и способы формирования лимфатических узлов в брыжейках различных отделов толстой кишки человека /
В.Е. Угримова // Арх. анат., гистол. и эмбриол. -1981. -Т . 81, № 9. - С. 31-34.
15. Хлыстова, З.С. Становление системы иммуногенеза плода человека / З.С. Хлыстова. -М. : Медицина, 1987. - 256 с.
16. Шурку с, В.Э. Генез, топография и связи лимфопроводящих путей брюшной полости (теоретический и прикладной аспект) / В.Э Шуркус [и др.]. - СПб. : Ленинградский областной онкологический диспансер, 2002. -277 с.
П.В. Пугач
Тел.:+7-921-755-22-19; e-mail: Petr.Pugach@spbmapo.ru
