CC BY
15
© Кайдашев I.П., Куценко Л.О., Боброва Н.О., Куценко Н.Л., Беркало Л.В., Кайдашева E.I. УДК 616. 379- 008. 64 - 092.9: 615. 25
ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНА ТЕРАП1Я РОЗИГЛТАЗОНОМ ПРИ 1НДУКЦЛ АЛОКСАНОВОГО ЦУКРОВОГО Д1АБЕТА
Кайдашев 1.П., Куценко Л.О., Боброва Н.О., Куценко Н.Л., Беркало Л.В., Кайдашева E.I.
Центральна науково-дослщна лаборатор1я Вищий державний навчальний заклад Украши «УкраТнська медична стоматолопчна академт», м. Полтава
В генезе многих заболеваний, в том числе, сахарного диабета, большую роль играет нарушение апоптоза, его активация или угнетение. Проведены исследования изменений процессов апоптоза Т клеток в суспензии спленоцитов на модели алоксанового диабета под влиянием препарата розиглитазон для углубления представлений о патогенезе сахарного диабета. Показано, что у животных с экспериментальным инсулинзависимым сахарным диабетом наблюдается тенденция к снижению CD4 + и CD8+ Т клеток суспензии спленоцитов с более вираженными изменениями CD8+ Т лимфоцитов. Виявлена способность препарата розиглитазон угнетать процесс апоптоза Т лимфоцитов.
Ключевые слова: апоптоз, алоксановый диабет, розиглитазон,
На сьогодншнм день в лкуваны цукрового д1абету II типу використовуються дектька основних груп цук-рознижуючих препарат1в. Група лазолщЫдюыв, до якоТ належить розигл1тазон - це новий клас антид1а-бетичних препарат1в, мехашзм ix дм реал1зуеться через ядерш гормональн1 рецептори PPAR-y (рецептор, активуючий прол1ферац1ю пероксисом) [1,2]. Зв'язування препарату з PPAR-y виб1рково активуе транскрипц1ю ген1в в кл1тинах-м1шенях i як насл1док цього, впливае на експрес1ю ген1в PEPCK, GLUT, ль попроте1нл1пази i TNFb, як1 вщ1грають важпиву роль в патогенез! цукрового д1абету [3].
В генез1 багатьох захворювань, в тому числ1, цукрового д1абету, велику роль Biflirpae порушення апоп-тозу, його активац1я або пригн1чення [4,5]. Концепц1я апоптозу являеться одним з найб1льш фундамента-льних та перспективних узагальнень сучасноТ меди-кобюлопчноТ науки. В даний момент не викпикае сум-н1ву, що апоптоз це фундаментальна генетична про-грама, яка забезпечуе ф1з1олог1чне сп1ввщношення таких процес1в, як прол1ферац1я, диференц1ровка або перебування кл1тин в споюйному стан1. Програмована кл1тинна загибель забезпечуе р1вновагу кп1тин в тканинах, вщмирання непотр1бних утворень в ембрюге-нез1, п1дтримуе генетичну стаб1льн1сть оргашзму за рахунок самознищення генетично ушкоджених кп1тин. Порушення гомеостазу орган1зму при багатьох пато-лог1ях, в тому числ1 ¡мунопатолог1чних реакц1ях, зв'язано з пригыченням або п1дсиленням апоптозу.
Отримаш нов1 дан1 про важпиву роль апоптозу ос-тр1вцевих кп1тин в патогенез! цукрового д1абету [17]. Важпиву роль в цьму питанн! врграють моноцитарн! кл!тини.
Метою роботи стало вивчення впливу розигл1тазо-ну на апоптоз спленоцилв при експериментальному цукровому д1абет1.
Матер1али та методи
Дослщи виконувались на 24 б1лих мишах niHii BALB/c, однаковоТ ваги. Лабораторш тварини утриму-вались в умовах в1вар1ю на типовому рац1он1 годуван-ня. Bei мантуляци з тваринами проводились за до-зволом бюетичноТ KOMicii УМСА.
спленоциты.
Досл1дн1 тварини були розд1лен1 на групп: I група -¡нтактн1 тварини;
II група - контрольна - введения одноразово пщ-шюрно алоксану в доз1 150 мг/кг. На 10 добу у тварин визначали р1вень глюкози в кров1 при допомоз1 фотометра "Глюкофот", використовуючи ¡ндикаторш стр1ч-ки "Гемоглан".
III група - дослщна - одноразове пщшфне введения алоксану, (тварини з п1двищеним bmíctom глюкози в KpoBi), пероральне введения тваринам спирту етилового по 0,05 мл 1 раз на добу протягом 6 тижыв; IV група - дослщна - одноразове пщшюрне введения алоксану (тварини, з п1двищеним bmíctom глюкози в кров1) пероральне введения 0,05 мл спиртового роз-чину розигл1тазону (аванд1я, Smith Kline Beecham Pharmaceuticals, Великобритаыя), вдоз1 10 мг/кг 1 раз на добу протягом 6 тижыв [6].
Апоксановий д1абет моделювали одноразовим niflrnKipHHM введениям 5% розчину алоксану ф1рми "Хемапол" в доз1 150 мг/кг маси Tina [7].
Bmíct глюкози, холестерину, тригл1церид1в в сиро-ватц1 KpoBi визначали за допомогою Ha6opiB "Оксох-ром глюкоза С", "Холестерин", "Триглщериди" ("La-chema a.s.", Чех1я). Вим1рювання проводили на MiKpo-колориметр1 МКМФ-1 в кювет1 з товщиною шару 1,0 см при вщповщних довжинах хвиль.
Для визначення субпопуляц1й Т л1мфоцит1в та piB-ня апоптозу Т кп1тин отримували суспенз1ю спленоци-tíb, вид1лених в асептичних умовах загальнов1домим методом [8].
При цьому, для визначення фенотипу л1мфоцилв були використан1 монокпональн1 антилла до поверх-невих антиген1в CD4 та CD8 MÍ4eHÍ флюорисце1н1зот1-оционатом (Caltag, США).
Оц1нку апоптозу визначали за piBHeM rinoflnnnoiflii Т кп1тин, обробляючи попередньо ф1ксован1 кл1тини nponifliyMOM йодидом [9].
PieeHb апоптозу та фенотип л1мфоцилв визначали на проточному цитофлюориметр1 EPIX LX - MCL (Beckman Coulter, USA), використовуючи програму System IITM software. Для збудження флюорисценц1Т використовували аргоновий лазер з довжиною хвил1 488 нм. Додатково до флюорисцентних параметр1в
Проблеми екологп та медицини
проводили реестрац1ю прямого та бокового свтороз-аювання кп1тини, що дозволило виключати з анал1зу конгломерати кл1тин та Тх уламки. Пщрахунок кл1тин проводили протягом 300 с при цьому ктькють про-анал1зованих кл1тин в проб1 складала вщ 15 до 20 тисяч.
Статистичну обробку математичних результатов експеременту проводили використовуючи стандартну програму БТАТ^ТЮА з обчисленням середньоТ ари-фметичноТ (М), середньоквадратичного вщхилення
(т), в1рогщносл отриманих результалв Т-тестом для попарно зв'язаних та для незалежних величин (t).
Результати та 1х обговорення
Л1тературы дат показують, що алоксановий д1абет у тварин викпикае тяжку форму цукрового д1абету з характерно вираженою гипергл1кем1ею [10]. Наш1 до-сл1дження показали, що на 10 добу ¡ндукцп алоксано-вого д1абету спостер1гались виражеы змЫи вуглевод-ного обмшу, про що свщчить в1рогщне зростання вмн сту глюкози в кров1 експериментальних тварин (табл.1).
Таблиця 1
Вплив препарату розигл/тазон на вуглеводний та л/п/дний обм/н досл/дних тварин при /ндукцп цукрового диабету (М±т)
Показники, яга вивчались 1нтактна група п = 6 Тварини з алоксановим д1абетом
Контрольна група -алоксановий д1абет, п = 6 Досл1дна група -введенння спирту по 0,05 мл, п = 6 Дослщна група - введения препарату розигл1тазон в доз1 10 мг/кг, п = 6
Глюкоза, ммоль/л 5,80 ± 0,53 10,00 ± 0,54* 9,46 ± 0,30* 8,06 ± 0,88*#
Холестерин, ммоль/л 2,65 ± 0,37 2,61 ± 0,41 2,60 ± 0,66 2,65 ± 0,43
Триглщериди, ммоль/л 1,25 ± 0,09 1,30 ± 0,18 1,38 ± 0,07 1,36 ± 0,09
Прим/тка: * пор/вняння показник/в з ¡нтактною групою (р < 0,05);
# пор/вняння показник/в з контрольною групою (р < 0,05).
роль в метабол1зм1 вуглевод1в та жир1в, викпикаючи понижения р1вня глюкози.
Результатом активаци Т л1мфоцилв е не ттьки прол1ферац1я кл1тин але \ Тх апоптоз [11]. Очевидно, що слщством нер1вном1рного вступу в апоптоз акти-вованих Т кп1тин, як1 вщносяться до р1зних субпопу-ляцм, е р1зниця стввщношення С04+ та С08+ кп1тин у фракци Т л1мфоцилв, що приймають участь в ¡мун-шй вщповщк Ф1зюлопчна роль такоТ змЫи р1вноваги субпопуляцм Т кл1тин до кшця не визначена [12,13].
Тому, актуапьним на наш погляд стало вивчення змш р1вня основних субпопуляцм Т л1мфоцилв (С04+, С08+ Т кп1тин) в суспензп спленоцилв у тварин з екс-периментальним ¡нсулшзалежним цукровим д1абетом [13ЦД] п1д впливом препарату розигл1тазон.
Отже, результати отриманих даних свщчить, що у тварин з 13ЦД спостер1гаеться тенденц1я до зниження С04+ та С08+ Т кп1тин суспензи спленоцилв з бтьш вираженими змЫами С08+ Т л1мфоцилв. При цьому на фоы введения препарату розигл1тазон тваринам дослщноТ групи викпикало в1рогщне зниження С08+ Т л1мфоцилв, що супроводжувалось зростанням в 1,5 раза стввщношення С04+/С08+ Т кл1тин суспензи спленоцилв (табл. 2).
Таблиця 2
Вплив препарату розигл/тазон на процеси апоптозу та загальну юльк'ють Ой4+, Сй8+ Т л/мфоцит/в досл/дних тварин при
¡ндукцп цукрового диабету (М±т)
Введения препарату розигл1тазон на тл1 експери-ментального д1абету сприяло в1рогщному зниженню вмюту глюкози в сироватц1 кров1 досл1джених тварин в пор1вняны з контрольною групою (8,06 ± 0,88 проти 10,00 ± 0,54 ммоль/л). У груп1 тварин з алоксановим д1абетом, яким вводили спирт етиловий вмют глюкози залишався без значнихзмЫ.
Досл1дження р1вня холестерину та триглщерид1в вказало, що введения препарату розигл1тазон не ви-плинуло на лтщний обмш в оргашзм1 дослщних тварин.
Отримаш нами експериментальы дат корекцп ву-глеводного обмЫу пщ впливом розигл1тазону у тварин з алоксановим д1абетом узгоджуються з л1тературни-ми даними, як1 свщчать про ппогл1кем1чну д1ю препарату [6].
Таким чином, вщтворена нами на бтих мишах лшп ВА1_В/с модель алоксанового д1абету характеризува-лась пщвищеним вмютом глюкози в сироватц1 кров1 та не супроводжувапась порушенням лтщного обмЫу. Пероральне ведения препарату розигл1тазон, який с високоселективним агонютом л1гандактивующих яде-рних гормональних рецептор1в, вщ1гравав важпиву
Показники, як1 вивчались 1нтактна група Тварини з алоксановим д1абетом
Контрольна група -алоксановий д1абет, п = 6 Досл1дна група -введения спирту по 0,05 мл, п = 6 Досл1дна група - введения препарату розигл1тазон в доз1 10 мг/кг, п = 6
Ой4+, % 28,88 ± 3,72 27,54 ± 1,59 27,47 ± 5,14 27,24 ± 2,91
Ой8+, % 41,58 ± 7,85 36,40 ± 7,08 32,37 ± 3,70 25,54 ± 5,46 #
Сп1вв1дно-шення Ой4/Ой8 0,69 0,76 0,85 1,07
Г1подип-лоТдн1 кл1тини, % 0,98± 0,21 0,24 ± 0,08* 0,17 ± 0,06* 0,15 ± 0,04 * #
Прим/тка: * пор/вняння показник/в з ¡нтактною групою (р < 0,05);
# пор/вняння показник/в з контрольною групою (р < 0,05).
Таким чином, препарат розигл1тазон у тварин з 13ЦД викпикае зменшення ктькосл С08+ Т кп1тин суспензп спленоцилв, змЫюючи р1вень стввщношен-ня С04+/С08+ Т кп1тин.
Вщомий той факт, що баланс м1ж популяц1ями кпн тин залежить вщ процеав прол1фераци та апоптозу. Неодноразово було показано, що одним ¡з патогене-тичних мехашзм1в розвитку алерпчних, аутсимунних, ¡нфекцмних захворювань с порушення процеав апоптозу серед р1зних популяцм л1мфоцилв [14, 15,16].
Результати, як1 представлен! в табл. 2 свщчать про те, що пщ час ¡ндукци цукрового д1абету у експе-риментальних тварин спостер1галось зменшення р1в-ня апоптозу Т л1мфоцилв суспензп спленоцилв. П1д час введения препарату розигл1тазон тваринам до-слщноТ групи спостер1галась тенденц1я до зниження ктькосл кл1тин спленоцилв, що знаходяться в апоптоз!.
Таким чином, незважаючи на пригычення процеав апоптозу Т л1мфоцит1в при ¡ндукцп алоксанового д1а-бету, розигл1тазон продовжус пригшчувати даний процес.
Отже, в процес1 ¡мунноТ вщповщ здмснюсться ко-рещя стввщношення функцюнальних субкпаав Т кп1тин \ в якосл ¡нструменту ц1еТ корекцп використову-сться нер1вном1рнютъ залучення С04+ та С08+ Т кль тин в прол1фераци та апоптозк
Л1тература
5. Панфилова Т.В., Штиль А.А., Полосухина Е.Р. и др. / Влияние тритерпеноида милиацина на чувствительность лимфоцитов тимуса и селезенки к апоптозу индуцированному дексаметазоном // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2003. - Т. 136. №10.- С.382-385.
6. IB-Cell Mass Dynamics in Zucker Diabetic Fatty Rats / Diane T. Finegood, M. Dawn McArthur, David Kojwang at al. // Diabetes. - Vol. 50. - P. 1021-1029.
7. ЕфимовА.С., Гордиенко B.M., Ткачук Ю.В. Экспериментальное моделирование диабетических ангиопа-тий // Физиологический журнал.- 1981.- № 1.- С.88-94.
8. Методи клЫмних та експериментальних досл1джень в медицин1 / БеркалоЛ.В., Бобович О.В., Боброва Н.О. i др.; nifl ред. Кайдашева 1.П. - Полтава: Пол1мед, 2003.
- 320 с.
9. Use of a cytometric assay to quantitate apoptosis in human lymphocytes / T. McCloskey, N. Oyaixu, M. Coronesi et al. // Clin. Immunol. Immunopathol. -1994. -Vol.71. -P. 14-18.
10. Древаль A.B., Садикова P.E., Мазо В.К. Влияние несбалансированности пищевого рациона на индуцирование и течение алоксанового сахарного диабета у крыс // Проблемы эндокринологии. - 1991. - Т.37, № 6.
- С. 56-58.
11. Никонова М.Ф., Литвина М.М., Варфоломеева М.И. и др. Апоптоз и пролиферация как альтернативные формы ответа Т-лимфоцитов на стимуляцию // Иммунология. - 1999. - № 2. - С. 20-23.
12. Григорьева Т.Ю., Никонова М.Ф., Ярилин А.А. Различная чувствительность к индукции апоптоза Т лимфоцитов субклассов CD4+ и CD8+ // Иммунология.-2002.- №4.- С. 200-205.
13. Григорьева Т.Ю., Никонова М.Ф., Варфоломеева М.И. и др. Неравномерное вовлечение в активационный апоптоз Т-лимфоцитов субклассов CD4+ и CD8+ и высокая чувствительность к нему CD30+ -клеток крови здоровых лиц и больных с иммунопатологией // Иммунология. - 2002. - № 5. - С. 262-267. Минеев В.Н., Нестерович И.И., Оранская Е.С., Тафеев А.Л. / Апоптоз и активность рибосомальных цистронов клетокпериферической крови при бронхиальной астме // Аллергология. - 2003. - №1. - С.15-19. Зигангирова Н.А., Гинцбург А.Л. / Роль апоптоза в регуляции инфекционного процеса // Журн. Микроби-ол. - 2004, №6.- С.106-113.
Alexandra E., Butler, Janson J. et al. / T-cell deficit and increased T-cell apoptosis in humans with type 2 diabetes // Diabetes.- 2003. - Vol.52. - P. 102-110. 17. Ф1зюлопчна активнють пептидного екстракту п1дшлунковоТ залози / nifl ред. Кайдашева 1.П. - 2005. Пол1мет. - 119 с.
14.
15.
16.
1. Activation provides enhanced improvement of insulin sensitivity and glycemic control in zDf rats/ C. L. Brand, J. Sturis, C.F. Godfredsen et al. // Am J Physiol Endocrinol Metab.- 2003.- Vol.284.- P. 841-854.
2. Rosiglitazone, a ligand of the peroxisome proliferator-activated receptor-gamma, reduces the development of nonseptic shock induced by zymosan in mice/ S. Cuz-zocrea, B. Pisano, L. Dugo et al.// Medline.- 2004.-Vol.32.- P. 457-466.
3. Lupi R., Del Guerra S., Marselli L. Rosiglitasone prevents the impairment of human islet function induced by fatty acids: evidence for a role of PPARg in the modulation of insulin secretion// Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab.-2004.- Vol.- 286.- P. 560-567.
4. Кайдашев И.П, БеркалоЛ.В, Боброва H.A, Рябенко B.B. / Антиапоптическое действие пептидного комплекса поджелудочной железы при аллоксановом диабете // Лки. - 2003. №10. - С.75-77.
Summary
THE EXPERIMENTAL THERAPY BY ROSIGLITAZONE OF INDUCTION OF ALLOXCAN DIABETES Kaidashev I.P., Kutsenko L.O., Bobrova N.O., Kutsenko N.L., Berkalo L.V., Kaidasheva E.I.
Key words: apoptosis, alloxcan diabets, rosiglitazone, splenocytes.
Many pathological processes, including diabetes, are associated with activation or suppression of apoptosis T cells.
The influence of rosiglitazone on apoptosis Tcells in suspenzion of splenocytes by alloxcan diabets was studied for the assessment of the role of rosiglitazone-modulated apoptosis Tcells in the pathogenesis of diabetes.
It was suggested decrease the amount of CD4+ and CD8+ T cells with most significant difference of CD8+ cells in animals by alloxcan diabetes.
The administration of rosiglitazone led to the inhibition of apoptosis T lymphocytes. Ukrainian Ministry of the Health Public Service, Ukrainian Medical Stomatological Academia, Shevchenko Str., 23, Poltava, 36024
Mamepian надшшов до редакци 19.06.06.
