CC BY
28
УДК663.15 + 57.083.13 582.84 DOI 10.36461^.2022.61.1.013
ЭКОЛОГИЧЕСКИ ОБОСНОВАННЫЕ ПРИЕМЫ СЕЛЕКЦИОННОГО ОТБОРА ШТАММОВ МИКРОМИЦЕТОВ С ВЫСОКОЙ ЦЕЛЛЮЛАЗНОЙ АКТИВНОСТЬЮ
Г.В. Ильина, доктор биол. наук, профессор; С.А. Сашенкова, канд. биол. наук, доцент; Д.Ю. Ильин, канд. биол. наук, доцент; А.Р. Дашкина, студент
Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Пензенский государственный аграрный университет», г. Пенза, Россия, e-maiL: ILyina.g.v@pgau.ru
В статье приводятся сведения, касающиеся установленных взаимосвязей между рядом эколого-фи-зиологических параметров культур почвенных мицелиальных грибов и их продуктивной способностью. Установленные связи могут быть положены в основу индивидуального отбора штаммов с высоким лиг-ноцеллюлазным потенциалом. Технологический смысл расширения спектра культур, обладающих богатым ферментативным потенциалом, заключается в создании резерва штаммов для включения их в комплексы микроорганизмов-деструкторов целлюлозы в целях деструкции целлюлозосодержащих отходов, а также использующихся в процессах компостирования растительных остатков. В работе содержится информация об оригинальных подходах к индивидуальному отбору и селекции культур мицелиальных грибов, полученных на основе природных штаммов, выделенных из вытяжки серой лесной почвы. Критериями отбора являлись устойчивость к повышенным температурам и ферментативная активность. Культуры выделяли на среду Сабуро, отвивали индивидуальные колонии и по наступлению спороноше-ния проводили определение родовой, а затем видовой принадлежности культур. Затем осуществляли моноспоровый рассев и культивировали моноспоровые культуры, параметры которых оценивали. Скрининг проводили при помощи селективной агаровой среды Гетчинсона (модифицированной). Определение целлюлазной активности производили на уровне качественной оценки (с использованием индикатора «конго красный»). Степень пигментации колоний при спороношении оценивали визуально. Установлены положительные корреляции между интенсивностью пигментации колонии, ее термостабильностью и ферментативной активностью. Отобрано несколько перспективных штаммов трех видов, количественно изучена их ферментативная активность. Проведена оценка устойчивости физиолого-морфоло-гических характеристик и ферментативной активности культур к спонтанной диссоциации в серии из 10 пассажей. В результате исследований разработаны приемы экспресс-отбора перспективных штаммов, получены четыре культуры, перспективные для включения в комплекс деструкторов для осуществления компостирования целлюлозосодержащих отходов и растительных остатков.
Ключевые слова: селекция микроорганизмов, индивидуальный отбор, экология мицелиальных грибов, биоконверсия отходов, ферменты, целлюлоза.
Для цитирования: Ильина Г.В., Сашенкова С.А., Ильин Д.Ю., Дашкина А.Р. Экологически обоснованные приемы селекционного отбора штаммов микромицетов с высокой целлюлазной активностью. Нива Поволжья, 2022, 1 (61), с. 01010. DOI 10.36461^Р.2022.61.1.013.
Введение
Естественный деструктивный потенциал почвенных мицелиальных грибов обеспечивает масштабные биосферные процессы разложения значительных масс отмершей растительной органики. Эти организмы эволюционно пришли к уникальной способности обеспечивать круговорот вещества, обеспечивающего воспроизводство компонентов биосферы, ежегодно репродуцируемых в колоссальных масштабах. Природные процессы деградации целлюлозосодержа-щих материалов представляются каскадным процессом, связанным со специфической деятельностью интегрированных между собой
почвенных микроорганизмов, находящихся, помимо прочего, в сложной системе разнообразных взаимодействий. Изучение экологических особенностей микроорганизмов-деструкторов, извлеченных из такого масштабного природного резервата, как почва, позволит обеспечить фонд перспективных для биотехнологического использования культур. В этих целях целесообразно изучение связи между морфолого-физио-логическими и адаптационными свойствами культур и их биотехнологического потенциала. Это позволит осуществлять эффективный скрининг и разработать приемы индивидуального отбора культур [1].
В современный период еще более актуальными становятся вопросы разработки новых технологий, в том числе связанных с процессами микробного синтеза. Мицелиальные грибы давно известны как продуценты ценных метаболитов, в том числе антибиотиков, лимонной кислоты, ферментов. Последние традиционно используются для деструкции целлюлозы (отбеливание бумажного сырья, тканей и т.д.), а также компостирования органических масс, обеспечивающего экологический путь утилизации отходов и биоконверсию питательных веществ. Существуют коллекционные промышленные штаммы известных представителей микроорганизмов-деструкторов, которые с успехом используются в технологических процессах ферментации растительных субстратов. При этом их потенциал может быть значительно лимитирован рядом факторов, таких как реакция и температура среды, чувствительность культуры к угнетающему развитие и ферментативную активность воздействию образующихся интермедиатов и т.п. В этой связи, целесообразно ведение селекционной работы по получению и изучению штаммов деструкторов из природных резерватов, где они в течение длительного времени развивались и реа-лизовывали имеющийся ферментативный потенциал в системах с нестабильными параметрами и в присутствии массы конкурентов [2, 13].
Целью настоящей работы являлась разработка приемов моноспоровой селекции и индивидуального отбора штаммов с перспективными технологическими свойствами для биоконверсии целлюлозосодержащих отходов в удобрение на основе культур мицелиальных грибов, выделенных из естественной среды обитания.
Для достижения поставленной цели были поставлены следующие задачи:
- осуществить рассев культур мицелиальных грибов из образцов серой лесной почвы;
- осуществить предварительный отбор культур на основе качественной оценки целлюлазной активности;
- выделить перспективные штаммы в чистую культуру и определить их систематическую принадлежность;
- осуществить моноспоровый рассев и индивидуальные отбор штаммов на основе качественной и количественной оценки целлюлазной активности;
- оценить связь морфолого-физиологиче-ских параметров изолятов с уровнем их ферментативной активности.
Методы и материалы
Исследования были проведены на базе кафедры биологии, биотехнологий и ветеринарно-санитарной экспертизы ФГБОУ ВО Пензенский ГАУ.
В ходе экспериментов были изучены 18 вариантов почвенных вытяжек из серых лесных почв, которые в разведении 1:10 высевались на плотную агаризованную среду Сабуро для роста почвенных грибов [9, 12]. Культивирование штаммов осуществлялось по общепринятым методикам [4, 7]. Затем мицелиальные культуры отвивались на агаризованную среду Гетчинсона. Среда была модифицирована добавлением в качестве единственного источника углерода карбокси-метилцеллюлозы (КМЦ). После 72 часов инкубирования производили изучение целлюлазной активности полученных колоний. Для этого на выросшие на плотной среде Гетчинсона с добавлением карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ) в качестве единственного источника углерода культуры наносили 0,1 % водный раствор красителя конго красного. Экспонировали 15 минут при комнатной температуре, после чего краситель смывали одномолярным раствором №С1. По величине зоны просветления вокруг колонии судили о степени целлюлозолитической активности штамма [14]. Колонии с максимально выраженной активностью отвивали на скошенный агар с целью выделения чистой культуры. По достижении культурами этапа спороношения производили определение их видовой принадлежности [5, 8].
Для осуществления моноспорового рассева мицелиальную биомассу суспендировали в физиологическом растворе, затем отфильтровывали через слой стерильной минеральной ваты с целью отделения массы гиф от спор. С помощью камеры Горяева производили подсчет спор в 1 мл фильтрата и путем серии разведений стерильным физраствором получали титр спор на уровне 106 единиц на 1 см3. Полученный фильтрат, содержащий преимущественно споры, высевали вновь на модифицированную внесением КМЦ среду Гет-чинсона и инкубировали до пяти суток, до получения единичных изолированных моноспоровых колоний. На выросшие колонии наносили 0,1 % водный раствор красителя конго красного способом, указанным выше. Экспонировали 15 минут при комнатной температуре, после чего краситель смывали одномолярным раствором №С1. Затем отбирали колонии, по периметру которых формировались зоны просветления с достоверно превышающими средние значения диаметрами.
Колонии с максимально выраженной активностью отвивали на скошенный агар с целью дальнейшего изучения. На следующем этапе осуществлялось исследование целлюлазной активности отобранных изолятов и их толерантности к повышенным температурам среды. Для определения целлюлазной активности использовали методику определения ферментативной активности целлюлазы с субстратом натриевой соли карбоксиметилцеллюлозы [3].
Данный метод основан на количественном определении редуцирующих (восстанавливающих) сахаров, образующихся в результате действия фермента целлюлазы на субстрат натриевой соли карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ) при температуре 50 °С. За единицу целлюлазной активности (1 ед.ЦлС) принимают количество фермента, которое гидролизует КМЦ с высвобождением 1 мкмоля восстанавливающих сахаров (в глюкозном эквиваленте), образующихся за 1 мин при стандартных условиях (температура 50 °С и 5,0 ед. рН).
Содержание редуцирующих сахаров, образующихся в результате ферментативной реакции, определяют колориметрическим методом, основанным на взаимодействии сахаров с реактивом Шомоди-Нельсона [10, 11].
Для изучения температурной толерантности культур оценивали интенсивность накопления биомассы мицелия при различных температурах. Для достижения максимально гомогенного распределения и исключения явления межфазного разделения растущей биомассы испытуемых штаммов в качестве метода выращивания использовалась глубинная культура. Температуру глубинной среды моделировали в условиях не отапливаемого помещения при помощи тепловой пушки, определение температуры проводили термометром марки ТТЖ-М.
Все эксперименты проводились в трехкратной повторности. Статистическая обработка проводилась с помощью программы для обработки и анализа данных «Statistica 6.0». Оценка достоверности влияния на продуктивные параметры со стороны различных факторов осуществлялась с помощью дисперсионного анализа полученного массива данных (ANOVA). Для оценки значимости полученных данных использовался t-критерий Стьюдента при уровне значимости 0,95 [15].
Результаты и их обсуждение
Серые лесные почвы служат естественным резерватом целлюлозолитических и лигнолити-ческих микроорганизмов, обладающих значительным видовым разнообразием и сравнительно высокой экологической пластичностью. Видное
место в указанном функциональном комплексе занимают мицелиальные грибы, вносящие существенный вклад в процессы деструкции и гумификации лесной подстилки. В этой связи целесообразно изучение целлюлозолитических изоля-тов природных штаммов грибов, обладающих выраженным деструктивным потенциалом с перспективой практического использования последнего в интересах биотехнологии.
В ходе исследований отобрано и изучено 18 образцов серой лесной почвы из разных районов и типов леса Пензенской области. При культивировании на среде Гетчинсона с КМЦ был проведен массовый скрининг культур по критерию наличия целлюлазной активности (по наличию зон просветления после реакции с красителем конго красным) (рис. 1).
Рис. 1. Характерные зоны просветления вокруг колоний, обладающих целлюлазной активностью
В итоге были отобраны 12 изолятов, которые были отвиты на среду Сабуро. После пяти-семи суток инкубации вегетативного мицелия было отмечено наступление пигментации культур и спороношения (рис. 2). На данном этапе проводилось определение видовой принадлежности изолятов. Установлена родовая и видовая принадлежность штаммов, наиболее ярко продемонстрировавших наличие целлюлазной активности (грибы родов Trichoderma, Aspergillus и Penici LLium).
Рис. 2. Спороношение выделенных изолятов, слева направо: Trichoderma viride Pers., Aspergillus terreus Thom, Pénicillium chrysogenum Thom.
По мере развития изолированных моноспоровых колоний был осуществлен второй этап
скрининга штаммов с наиболее высокой целлюлазной активностью (по максимально выраженным зонам просветления). При проведении данного этапа эксперимента было отмечено, что штаммы всех изученных видов с относительно более ранним спороношением и наиболее яркой пигментацией мицелия формируют зоны
просветления с наибольшим диаметром. На рисунке 3 показана корреляционная зависимость, установленная для штаммов Aspergillus terreus, обладающих наибольшей вариабельностью пигментации, однако подобная тенденция отмечена и для штаммов двух других видов.
Рис. 3. Корреляционная зависимость между степенью пигментации мицелия Aspergillus terreus и шириной зон просветления вокруг колоний (Varl - степень пигментации мицелия (в баллах, от 1 до 7), Var2 - ширина зоны просветления, мм), повторность трехкратная (р < 0,05)
Для дальнейших экспериментов были отобраны изоляты, ширина зон просветления вокруг колоний которых составила не менее 5 мм. Таким образом, на следующем этапе исследований объектами изучения стали пять штаммов T. viride, пять штаммов P. chrysogenum и три штамма A. terreus.
Была проведена оценка количественных показателей целлюлазной активности отобранных штаммов, а также изучены диапазоны их толерантности по отношению к повышенным температурам культивирования. На данном этапе исследований культуры выращивали в глубинных
условиях на среде, содержащей КМЦ. Культивирование проводили в колбах Эрленмейера на микробиологической качалке в течение семи суток. Полученную биомассу отделяли фильтрованием, а культуральную жидкость использовали для анализов. Для оценки целлюлазной активности культуральной жидкости был применен колориметрический метод [6], основанный на определении редуцирующих сахаров, образующихся при взаимодействии ферментов с субстратом (КМЦ). Результаты определения активности эк-зоферментов целлюлаз приведены в таблице.
Таблица
Целлюлозолитическая активность культуральной жидкости изученных штаммов грибов (температура 25 °С, повторность трехкратная, р< 0,05)
Вид Активность целлюлаз, ед/мл
Штамм № 1 Штамм № 2 Штамм № 3 Штамм № 4 Штамм № 5
Trichoderma viride 0,72±0,04 0,79±0,02 0,77±0,03 0,85±0,03 0,69±0,01
Aspergillus terreus 0,52±0,01 0,46±0,01 0,62±0,02 - -
Pénicillium hrysogenum 0,64±0,02 0,74±0,02 0,84±0,02 0,61±0,02 0,77±0,02
Наличие достоверных межштаммовых отличий целлюлазной активности свидетельствует о целесообразности получения моноспоровых изо-лятов. На следующем этапе исследований изучены диапазоны толерантности штаммов к повышенным температурам культивирования. Резуль-
таты глубинного культивирования штаммов изученных видов в глубинных условиях при разных температурах среды позволили установить, что большинство культур относится к мезофильным, однако, для каждого вида обнаружены и относительно термофильные штаммы (рис. 4, 5, 6).
Л-^Ч \
• \ • \
/ Vе ---- \
у г 4s.....\ Z * I - • \ X
- - / s = Vx \
10
15
20
40
45
50
25 30 35 Температура, С
--Штамм№1 •••• Штамм№2-----Штамм№3 -Штамм№4— •• Штамм№5
Рис. 4. Диапазоны температурной толерантности штаммов Trichoderma viride (повторность трехкратная, р < 0,05, планки погрешностей - ошибка средней)
Температура, С
--Штамм№1 -----Штамм№2 Штамм№3
Рис. 5. Диапазоны температурной толерантности штаммов Aspergillus terreus (повторность трехкратная, р < 0,05, планки погрешностей - ошибка средней)
10 15 20 25 30 35 40 45 50
Температура, С
......Штамм№1---Штамм№2 Штамм№3 -----Штамм№4 Штамм№5
Рис. 6. Диапазоны температурной толерантности штаммов Pénicillium chrysogenum (повторность трехкратная, р < 0,05, планки погрешностей - ошибка средней)
Таким образом, в ходе оценки температурной толерантности культур изученных видов обнаружен ряд термофильных штаммов: это штамм № 4 Tviride, штамм № 3 A. terreus и штаммы № 3 и № 5 P. chrysogenum. Следует отметить, что данные штаммы характеризовались относительно выраженной целлюлазной активностью, наиболее яркой (не менее 6-7 баллов по 7-балльной шкале) пигментацией зрелого мицелия и значительными (5-7 мм) зонами просветления среды при реакции с красителем конго красным. Отдельным этапом исследований стала оценка устойчивости физиолого-морфо-логических характеристик и ферментативной активности культур к спонтанной диссоциации. Для этого проведено изучение динамики целлюлазной активности и накопления биомассы при повышенной температуре среды в серии из 10 пассажей. Результаты позволили установить стабильность оцениваемых параметров, все обнаруженные отклонения находились в пределах ошибки опыта. Отобранные культуры депонированы в коллекции
мицелиальных культур и станут объектами исследования о перспективах их включения в микробные комплексы, предназначенные для компостирования и биоконверсии органических отходов, содержащих источники целлюлозы в органомине-ральные удобрения.
Заключение
В ходе проведенных исследований установлены положительные корреляции между интенсивностью пигментации колоний почвенных ми-целиальных грибов родов Trichoderma, Aspergillus и Penicillium, их термостабильностью и целлюлазной активностью. Использованные приемы можно рекомендовать для экспресс-отбора перспективных штаммов. Отобраны четыре культуры моноспоровых изолятов мицелиальных грибов, полученных из природных резерватов, перспективные для включения в комплекс деструкторов для осуществления компостирования целлюлозосодержащих отходов и растительных остатков.
Литература
1. Александрова А.В. Почвообитающие микроскопические грибы (география и экология). Автореф. дис. ... докт. биол. наук. Москва, 2013, 48 с
2. Балабанова Л.А., Пивкин М.В., Худякова Ю.В., Киричук Н.Н., Подволоцкая А.Б., Сон О.М., Те-кутьева Л.А. Скрининг мицелиальных грибов как потенциальных продуцентов кормового белка. Современные проблемы науки и образования, 2017, № 6. [Электронный ресурс] URL: https://science-education.ru/ru/articLe/view?id=27195.
3. ГОСТ Р 55293-2012 Ферментные препараты для пищевой промышленности. Метод определения целлюлазной активности. Enzyme preparations for food industry. Method for determination of ceLLuLase activity*. [Электронный ресурс] URL: https://docs.cntd.ru/document/1200100977
4. Звягинцев Д.Г. Методы почвенной микробиологии и биохимии. Москва: МГУ, 1991, с. 60
5. Литвинов М.А. Определитель микроскопических почвенных грибов. Ленинград: Наука, 1967, 302 с.
6. Маслак Д.В., Феклистова И.Н., Гринева И.А., Скакун Т.Л., Садовская Л.Е., Максимова Н.П. Активность целлюлолитического комплекса индуцированных мутантов Bacillus subtiLis. Труды Белорусского государственного университета. Т. 10. Часть 1. Минск, 2015, с. 82-89.
7. Методы эксперниментальной микологии: справочник. Отв. ред. В.И. Билай. Киев: Наукова думка, 1982, 550 с.
8. Микромицеты почв. Под общ. ред. В.И. Билай. Киев: Наукова думка, 1984, 263 с.
9. Мирчинк Т.Г. Почвенная микология. Москва: МГУ, 1988, 220 с.
10. Полыгалина Г.В., Чередниченко В.С., Римарева Л.В. Определение активности ферментов: справочник. Москва: ДеЛи принт, 2003, 372 с.
11. Рашидова Н.Т., Ахмедова З.Р., Гулямова И.Т. Целлюлолитические активности почвенных сапро-трофных грибов и их специфичности к целлюлозным субстратам. Universum: технические науки, 2020, № 122 (81). [Электронный ресурс] URL: https://cyberLeninka.ru/articLe/nAseLLyuLoLiticheskie-aktivnosti-pochvennyh-i-saprotrofnyh-gribov-i-ih-spetsifichnosti-k-tseLLoLoznym-substratam (дата обращения: 17.04.2022).
12. Хабирова С.Р., Шуралев Э.А., Мукминов М.Н. Методы исследования почвенных микромицетов при оценке биологических эффектов загрязнения среды: учебное пособие. Казань: Казан. Ун-т, 2022, 128 с. [Электронный ресурс] URL https://docs.yandex.ru/docs/view?tm=1650215899&tLd=ru&Lang=ru&name= Khabirova_ UchebPosobie.pdf&text (дата обращения: 16.04.2022).
13. Цзя-Сян Ли, Фей Джан и др. Разнообразие продуцирующих целлюлазу нитчатых грибов из Тибета и транскриптомный анализ превосходного продуцента целлюлаз Trichoderma harzianum LZ117. Микробиол., 14 июля 2020 г. [Электронный ресурс] URL:https://doi.org/10.3389/fmicb.2020.01617 (дата обращения: 16.04.2022).
14. Teather R.M., Wood P.J. Use of congo-red poLysaccharide interaction in enumerationand characterization of ceLLuLozaLytic bacteria the bovine rumen. AppL. Environ MicrobioL, 1982, v. 43, р. 777-780.
15. HaLafyan A.A. STATISTICA 6 [StatisticaL anaLysis of data. 3 edition. Textbook]. М.: ООО «BinomPress», 2007,512 p.
UDC663.15 + 57.083.13 582.84 DOI 10.36461/NP.2022.61.1.013
ECOLOGICALLY JUSTIFIED METHODS OF SELECTION OF STRAINS OF MICROMYCETES WITH HIGH CELLULASE ACTIVITY
G.V. Ilyina, Doctor of Biological Sciences, professor; S.A. Sashenkova, Candidate of Biological Sciences, associate professor; D.Yu. Ilyin, Candidate of Biological Sciences, associate professor; A.R. Dashkina, student
Federal State Budgetary Educational Institution oh Higher Education "Penza State Agrarian University",
Penza, Russia, e-mail: Ilyina.g.v@pgau.ru
The article presents information concerning the established interrelations between a number of ecological and physiological parameters of cultures of soil mycelial fungi and their productive capacity. These interrelations can be used as a basis for individual selection of strains with high lignocellulasic potential. The technological point of expanding the range of cultures with rich enzymatic potential is to create a reserve of strains to be included in complexes of cellulose-degrading microorganisms. This can be used for the destruction of cellulose-containing wastes, as well as for composting processes of crop residues. The paper contains information about original approaches to individual selection and selection of cultures of mycelial fungi obtained on the basis of natural strains collected from gray forest soil extract. The selection criteria were resistance to elevated temperature and enzymatic activity. Cultures were allocated to the Sabouraud medium, and individual colonies were divided. After the sporulation, the generic assignment and then the species of the cultures were determined. Later, monosporous sifting was carried out, and the monosporous cultures were risen, the parameters of which were evaluated. Screening was performed using modified Getchinson's medium. Cellulase activity was determined at the level of qualitative assessment (using the Congo red indicator). The pigmentation degree of colonies during sporulation was estimated visually. We established positive correlations between the pigmentation intensity of the colony, its thermal stability and enzymatic activity. Having selected three species of promising strains, we studied their enzymatic activity. We assessed the stability of physiological and morphological characteristics and enzymatic activity of cultures to spontaneous dissociation in a series of ten passages. As a result of the research, we developed methods of express selection of promising strains and obtained four promising cultures for inclusion in a complex of decomposers for composting cellulose-containing wastes and crop residues.
Keywords: selection of microorganisms, individual selection, ecology of mycelial fungi, bioconversion of wastes, enzymes, cellulose.
References
1. ALeksandrova A.V. Soil-inhabiting microfungi: geography and ecology. Dr. Sci. Thesis. Moscow, 2013,
48 p.
2. Balabanova L.A., Pivkin M.V., Khudyakova Yu.V., Kirichuk N.N., Podvolotskaya A.B., Son O.M., Tekut'eva L.A. Screening of mycelia fungi as potential producersof feed protein. Modern problems of science and education, 2017, No. 6. [Electronic source] URL: https://science-education.ru/ru/article/view?id=27195 .
3. GOST R 55293-2012 Enzyme preparations for food industry. Method for determination of cellulase activity. Enzyme preparations for food industry. Method for determination of cellulase activity*. [Electronic source] URL: https://docs.cntd.ru/document/1200100977
4. Zvyagintsev D.G. Methods of soil microbiology and biochemistry. Moscow: MSU, 1991, p. 60
5. Litvinov M.A. The determinant of microscopic soil fungi. Leningrad: Nauka, 1967, 302 p.
6. Maslak D.V., Feklistova I.N., Grineva I.A., Skakun T.L., Sadovskaya L.E., Maksimova N.P. Activity of cellulolytic complex of induced mutants of Bacillus subtilis. Proceedings of the Belarusian State University. Vol. 10. Part 1. Minsk, 2015, p. 82-89.
7. Methods of experimental mycology: a reference book. Editor-in-chief V.I. Bilay. Kiev: Naukova dumka, 1982, 550 p.
8. Soil micromycetes. Under the general editorship of V.I. Bilay. Kiev: Naukova dumka, 1984, 263 p.
9. Mirchink T.G. Soil mycology. Moscow: MSU, 1988, 220 p.
10. Polygalina G.V., Cherednichenko V.S., Rimareva L.V. Determination of enzyme activity: reference book. Moscow: DeLi print, 2003, 372 p.
11. Rashidova N.T., Akhmedova Z.R., Gulyamova I.T. Cellulolytic activities of soil and saprotrophic fungi and their specificity to cellulosic substrates Universum: Technical Sciences, 2020, № 12-2 (81). [Electronic
source] URL: https://cyberLeninka.ru/articLe/n/tseLLyuLoLiticheskie-aktivnosti-pochvennyh-i-saprotrofnyh-gri-bov-i-ih-spetsifichnosti-k-tseLLoLoznym-substratam (accessed: 04/17/2022).
12. Khabirova S.R., ShuraLev E.A., Mukminov M.N. Methods of studying soil micromycetes in assessing the biological effects of environmental pollution: textbook. Kazan: Kazan University, 2022, 128 p. [Electronic resource] URL https://docs.yandex.ru/docs/view?tm=1650215899&tLd=ru&Lang=ru&name=Khabirova_ UchebPosobie.pdf&text (accessed: 04/16/2022).
13. Jiaxiang Li, Fei Zhang, et aL. Variety of ceLLuLase-producing filamentous fungi from Tibet and tran-scriptomic analysis of the highly effective ceLLuLase producer Trichoderma harzianum LZ117. Microbiol., July 14, 2020 [Electronic resource] URL:https://doi.org/10.3389/fmicb.2020.01617 (accessed: 04/16/2022).
14. Teather R.M., Wood P.J. Use of congo-red polysaccharide interaction in enumerationand characterization of ceLLuLozaLytic bacteria the bovine rumen. AppL. Environ Microbiol, 1982, v. 43, р. 777-780.
15. HaLafyan A.A. STATISTICA 6 [Statistical analysis of data. 3 edition. Textbook]. М.: ООО «BinomPress», 2007,512 p.
