CC BY
64
УДК 663.15+ 57.083.13 582.84
ПРИЕМЫ СЕЛЕКЦИИ ОРГАНИЗМОВ-ПРОДУЦЕНТОВ ЦЕЛЛЮЛАЗ, ПЕРСПЕКТИВНЫХ В БИОКОНВЕРСИИ ОТХОДОВ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННОГО ПРОИЗВОДСТВА
Д. Ю. Ильин, канд. биол. наук, доцент; Г. В. Ильина, доктор биол. наук, профессор; С. А. Сашенкова, канд. биол. наук, доцент; А. А. Галиуллин, канд. с.-х. наук, доцент
ФГБОУ ВО Пензенский ГАУ, Россия, e-mail: g-ilyina@yandex.ru
Статья содержит информацию о возможностях и приемах селекции и скрининга штаммов грибов, перспективных деструкторов целлюлозы и лигнина. Исследования, положенные в основу работы, касались разработки и использования методов селекции штаммов культур грибов с учетом их экологических особенностей с целью наиболее полной реализации их ферментативного потенциала в процессах биоконверсии отходов растениеводства. Поскольку материалы, образующиеся в результате переработки продукции растениеводства, содержат достаточно большое количество источников углерода, их можно рассматривать в качестве основы для создания компостов, субстратов для выращивания хозяйственно ценных насекомых. Однако, преимущественная локализация углерода в составе целлюлозных и лигниновых компонентов нередко оказывается фактором, существенно снижающим питательную ценность этих материалов. В этой связи предварительная ферментация таких субстратов позволит обеспечить деградацию полимеров, прежде всего, лигнина. Это может способствовать образованию серии интермедиатов, оказывающих эффект, стимулирующий метаболизм как непосредственных деструкторов растительных материалов, так и организмов, инокулированных на полученный компост (субстрат) в качестве вторичного звена конверсионного каскада. В работе содержится информация о разработанной методике селекции штаммов грибов с использованием серии индуцированных мутаций химическим мутагеном метилметансульфонатом. Скрининг проводили при помощи селективной агаровой среды Гетчинсона (модифицированной). Определение целлюлазной активности производили на уровне качественной оценки. Отобрано по четыре мутантных штамма каждого вида, проведена оценка диапазона толерантности мутантов к действию таких экологических факторов, как температура и концентрация кислорода в среде. Установлено наличие среди мутантных штаммов культур с широкими диапазонами толерантности. Проведена оценка устойчивости культур к спонтанной диссоциации в серии из 12 пассажей. Отобраны два му-тантных штамма с расширенными спектрами выносливости к колебаниям факторов среды, устойчивые к спонтанной диссоциации, которые можно рассматривать как перспективные культуры для осуществления биоконверсии лигноцеллюлозных отходов.
В ходе селекции получены обладающие рядом экологических особенностей культуры грибов - перспективных деструкторов целлюлозы. Они могут использоваться для осуществления процессов биоконверсии, предварительной и параллельной ферментации компостов.
Ключевые слова: биоконверсия отходов, отходы растениеводства, селекция микроорганизмов, ферменты, целлюлоза.
Введение
На современном этапе особую значимость приобрели исследования, связанные с максимальной реализацией природного потенциала микроорганизмов в различных отраслях, в частности, в биотехнологии и сельскохозяйственном производстве. Особого внимания заслуживает способность ряда микроорганизмов к деструкции трудно разлагаемых растительных компонентов, ежегодно репродуцируемых в колоссальных масштабах. Утилизация значительных масс отходов, образуемых в сфере производства и переработки растениеводческой продукции, остается одной из актуальных
проблем сельского хозяйства. Использование этой массы как подстилочного и другого вспомогательного материала в животноводстве не решает до конца задачу утилизации и конверсии, а, зачастую, повышает токсичность данного вида отходов. В этой связи целесообразной представляется разработка путей конверсии целлюлозосо-держащих отходов путем их естественной деструкции ферментами соответствующих микроорганизмов. Это может способствовать мобилизации содержащегося в полимерах углерода в легко ассимилируемые формы, доступные для культивируемых, практически значимых организмов, и по-
Нива Поволжья № 3 (52) август 2019 97
зволяет рассматривать данный подход как способ технологической интеграции в порядок процессов биогенного круговорота. Известны конкретные представители микроорганизмов-деструкторов, которые с определенным успехом используются в технологических процессах ферментации растительных субстратов. При этом их потенциал может быть значительно лимитирован рядом факторов, таких как реакция и температура среды, чувствительность культуры к угнетающему развитие и ферментативную активность воздействию образующихся интермедиатов и т.п. В этой связи целесообразно ведение селекционной работы по получению штаммов деструкторов с выраженной экологической пластичностью, способных развиваться и реа-лизовывать продуктивный и ферментативный потенциал в системах с нестабильными параметрами[1-5].
Целью настоящей работы являлась разработка приемов селекции и практическое получение штаммов микроорганизмов (микромицетов) с выраженной целлюлаз-ной активностью, одновременно характеризующихся экологической пластичностью.
Для достижения поставленной цели были поставлены следующие задачи:
- отработать методику индуцированного мутагенеза культур микромицетов родов Myceliophthora и ТЫе^а;
- осуществить скрининг наиболее продуктивных штаммов;
- провести оценку диапазона толерантности культур к варьированию основных параметров среды, таких как температура и водородный потенциал;
- оценить степень стабильности качеств культур по отношению к спонтанной диссоциации в ряду поколений.
Методы и материалы
Исследования были проведены на базе кафедры биологии, биотехнологий и вете-ринарно-санитарной экспертизы ФГБОУ ВО Пензенский ГАУ, располагающей коллекцией мицелиальных культур.
В ходе экспериментов были изучены штаммы видов Myceliophthorathermophila (штамм F-244) и Thielaviaterrestris (штамм F-308) [6-9]. Культивирование штаммов осуществлялось по общепринятым мето-дикам[10,11]. Для осуществления процедуры индуцированного мутагенеза мицели-альную биомассу суспендировали в физиологическом растворе, затем отфильтровывали через слой стерильной минеральной ваты с целью отделения массы гиф от спор. С помощью камеры Горяева производили подсчет спор в 1 мл фильтрата и путем серии разведений стерильным
физраствором получали титр спор на уровне 106 единиц на 1 см3. В полученный фильтрат, содержащий преимущественно споры, вносили химический мутаген - ме-тилметансульфонат (ММБ) в концентрации, которая была отобрана в ходе предварительных испытаний и составляла 0,001 г/л среды. Смесь экспонировали при комнатной температуре в течение 24 ча-сов.Параллельно экспонировали в физиологическом растворе без добавления мутагена контрольные споровые суспензии тех же видов микромицетов (контроль). По истечению указанного времени производили рассев по 2,0 мл опытной и контрольной споровых суспензий в серии разведений 1:10 и 1:100 на среду Гетчинсона[12].Среда была модифицирована добавлением в качестве единственного источника углерода карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ). Чашки Петри с инокулюмом инкубировали в термостате в течение четырех суток при температуре 42°С, поскольку испытуемые культуры являются выраженными термофилами. Производили подсчет выросших колоний на плотной питательной среде в опытных и контрольных вариантах по методу Коха.
На выросшие, по истечению указанного времени, на плотной среде Гетчинсона с добавлением карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ) в качестве единственного источника углерода, культуры наносили0,1 % водный раствор красителя конго красного. Экспонировали 15 минут при комнатной температуре, после чего краситель смывали 1М раствором №С1, затем выдерживали в указанном растворе десять минут. По величине зоны просветления вокруг колонии судили о степени целлюлозолитической активности штамма [13]. Колонии с максимально выраженной активностью отвивали на скошенный агар с целью выделения чистой культуры. На следующем этапе осуществлялось исследование экологической пластичности отобранных мутантов. Для этого производили культивирование штаммов в условиях варьирования факторов внешней среды (температуры и концентрации кислорода). Для достижения максимально гомогенного распределения и исключения явления межфазного распределения растущей биомассы испытуемых штаммов в качестве метода выращивания использовалась глубинная культура. Температуру глубинной среды моделировали при помощи тепловой пушки, определения температуры проводили термометром марки ТТЖ-М. Концентрацию кислорода варьировали при помощи изменения объема питательной среды и скорости враще-
& 100 с
Й
ю о
о
о с
и X
s
W ц
о
п
so
60
40
20
CR
1 8 У I /
у* V
щ р
1 1 | 18 \
V 1 ■ 1 Il —г- —г- —1—-tbe—
0,0001 0,001 0,01 0,1
Концентрация мутагена (MMS), г/л среды
14 13 12 11 10 9
5
6 5
4
3 ~>
1
о
и э
и и
р
о ?
и
t S?
3 и S о
Ф о
S «
Ь %
о с
о Р
г>
о M
МусеНорИЙшга йшторййа (штамм Р-244) ^™Т1пе1а\ча1епей1пй (штамм Р-308)
» МусеЬорЬЙюга йшторййа (штамм Р-244) —■- ТЬ1 е1 а \ т а 1 ел'е>Л11 * (штамм Р -3 08)
Рис. 1.Эффект воздействия химического мутагена (MMS) на фенотипическую диссоциацию изолятов родительских штаммов микромицетов: столбцы - доля жизнеспособных спор в мутантном поколении; линии графика - количество полученных фенотипических классов (повторность трехкратная, р<0,05, планки погрешностей - ошибка средней)
ния шейкера. Определение концентрации растворенного кислорода в среде определяли при помощи лабораторного оксимет-ра марки HANNA HI 9146.
Все эксперименты проводились в трехкратной повторности. Статистическая обработка проводилась с помощью программы для обработки и анализа данных «Sta-tistica 6.0». Оценка достоверности влияния на продуктивные параметры со стороны различных факторов осуществлялась с помощью дисперсионного анализа полученного массива данных (ANOVA). Для оценки значимости полученных данных использовался t-критерий Стьюдента при уровне значимости 0,95 [14].
Результаты
Селекционная работа в сфере биотехнологии направлена на преобразование генетической программы организмов продуцентов, что в итоге обеспечит материал для отбора наиболее перспективных культур [9, 15]. С этой целью, прежде всего, осуществляется соответствующее воздействие на генетический аппарат клетки, причем основными приемами являются гибридизация, мутагенез и трансгенез. В нашей работе в качестве приема использовался индуцированный мутагенез, осуществляемый химическим агентом - метилметан-
сульфонатом (MMS, CAS No. 66-27-3). Вещество представляет собой монофункциональный алкилирующий агент (осуществляет перенос только одной группы СН3-). Действие метилметансульфоната приводит к алкилированию пуриновых оснований и затем к транзициям [15]. С его помощью было получено существенное увеличение генетической гетерогенности популяции клеток микроорганизма-продуцента, что непосредственно обеспечило материал для проведения отбора потенциально перспективных форм. Следует отметить, что получение устойчивого генетического изменения является непростой задачей. С одной стороны это может быть обусловлено тем, что в клетках живых объектов естественным образом функционируют различные репарационные механизмы, нивелирующие возникающие мутационные эффекты. С другой стороны (особенно при использовании больших доз мутагенов), возможна гибель клеток. По этой причине поиск оптимальных концентраций и доз имеет первостепенное значение. Установление эффективных концентраций или доз мутагена констатируется по соотношению между относительной величиной выживших клеток и количеством полученных фе-нотипических классов [16].Было изучено
Нива Поволжья № 3 (52) август 2019 99
Характеристика мутантных штаммов Myceliophthorathermophila и Thielaviaterrestris, отобранных для исследований (повторность трехкратная, р<0,05)
Штамм Скорость роста, мм/сут Ширина зоны просветления, мм
M. thermophila, F-244(исходный) 4,03±0,05 3,5±0,09
M. thermophila, mut-1(M.244) 3,45±0,1 4,4±0,07
M. thermophila, mut-4(M.244) 3,08±0,07 5,3±0,04
M. thermophila, mut-7(M.244) 3,07±0,03 3,8±0,1
M. thermophila, mut-8(M.244) 2,09±0,02 4,3±0,1
T. terrestris, F-308 (исходный) 3,62±0,4 2,1 ±0,01
T. terrestris, mut-2(T.308) 4,01±0,6 3,6±0,3
T. terrestris, mut-3(T.308) 2,94±0,3 4,5±0,09
T. terrestris, mut-6(T.308) 3,33±0,7 4,2±0,07
T. terrestris,mut-9(T.308) 2,77±0,5 3,8±0,1
влияние мутагена при его содержании в среде от 1,0до 0,001 г/л среды. В нашей работе установленное оптимальное содержание вещества находилась на уровне 0,01 г/л среды. Под воздействием химического мутагена получали гетерогенный споровый материал, причем степень гетерогенности различалась в зависимости от концентрации мутагена, но для обоих изученных видов оптимальной дозой вещества, определившей максимальную гетерогенность при высокой выживаемости спор явилась указанная выше концентрация (рис. 1).Доля проросших спор обоих изученных видов в контрольных вариантах составила от 92 до 100%, отмечено по одному фенотипическому классу, морфологически соответствующему родительской форме.
В дальнейших исследованиях использовалась установленная оптимальная концентрация мутагена, составляющая 0,001 г/л питательной среды. Первое поколение мутантов было получено на среде Гетчинсона, с добавлением КМЦ в качестве единственного источника углерода и мутагена (MMS) в указанной выше концентрации. После инкубирования в термостате в течение четырех суток при температуре +42°С на выросшие колонии наносили 0,1% раствор красителя конго красного для выявления целлюлазной активности.
В разной степени выраженная целлю-лазная активность качественно установлена у всех полученных мутантных штаммов, причем некоторые из них проявили относительно более низкую, другие - заметно ярко выраженную целлюлазную активность по сравнению с контролем, о чем судили по линейным размерам зон просветления вокруг колоний. С использованием такого критерия, как степень целлюлазной активности не ниже контрольной, для дальней-
ших исследований были отобраны по четыре штамма M. thermoph'a T. terrestris (табл. 1).
На основании результатов теста на степень целлюлазной активности, таким образом, были отобраны и выделены в чистые культуры восемь мутантных штаммов двух видов.
На следующем этапе осуществлялось исследование экологической пластичности отобранных мутантов. Для этого производили культивирование штаммов в условиях варьирования факторов внешней среды. С этой целью выращивали испытуемые штаммы в условиях чистой культуры на среде Чапека при температурах, отличных от оптимальных для данного вида: как пониженных, так и повышенных. Установлено, что температурный диапазон толерантности мутатных штаммов существенно расширен, относительно контрольного, за счет межштаммовой вариабельности. Так, в пределах каждого вида получены как устойчивые к понижению температуры культивирования, так и устойчивые к повышению таковой (рис. 2, 3). Особого внимания заслуживает факт фиксации эвритермных мутантных штаммов у обоих изученных видов, к которым можно отнести штамм mut-4(M.244) вида M. thermophila и штамм mut-6(T.308) вида T. terrestris. Надо отметить, что для указанных штаммов характерна и более выраженная, относительно контрольных показателей, целлюлазная активность. Установленные показатели говорят о возможности целевого использования данных культур (как продуцентов целлюлаз, в процессах биоконверсии растительных остатков и т.д.) в расширенном диапазоне температур окружающей среды, что немаловажно с практических позиций и расширяет сферу применения данных культур.
Рис. 2.Диапазоны толерантности мутантных шаммовMyceliophthora thermophila (повторность трехкратная, р<0,05, планки погрешностей - ошибка средней)
На следующем этапе было изучена толерантность мутантных штаммов к изменению концентрации кислорода в глубинных условиях. Известно, что растворимость кислорода в жидкой среде сравнительно низка и зависит от температуры, давления, концентрации растворенных, эмульгированных и диспергированных компонентов. Справочные данные свидетельствуют, что при давлении 0,1 МПа (1 кгс/см2) и температуре 30°С в одном л дистиллированной воды максимальное количество рас-
творенного кислорода составляет 7,5 мг, а в реальной питательной среде максимальная растворимость кислорода 2-5 мг/л. При глубинном культивировании запасы кислорода в питательной среде возобновляются при подаче аэрирующего воздуха. Скорость адсорбции кислорода увеличивается с ростом интенсивности перемешивания среды. В ходе эксперимента отношение объема культуральной жидкости к объему колбы составляло 1:10, скорость вращения качалки была 220 об/мин. Содержание
Рис. 3. Диапазоны толерантности мутантных шаммов Thielaviaterrestris (повторность трехкратная, р<0,05, планки погрешностей - ошибка средней)
Нива Поволжья № 3 (52) август 2019 101
Воздушно-сухая биомасса мицелия мутантных штаммовMyceliophthorathermophila и Thielaviaterrestris, отобранных для исследований, при различном содержании кислорода в культуральной жидкости при 42°С, на 5 сутки культивирования (г/л) (повторность трехкратная, р<0,05)
Вид Штамм Содержание рО2, мг/л культуральной жидкости
3,07±0,04 4,09±0,05 5,04±0,03 7,05±0,04 9,06±0,03
М. Шег-mophila F-244 (исходный) 1,50±0,01 13,90±0,16 22,36±0,12 16,31±0,11 0,31±0,11
тиМ(М.244) 2,85±0,03 14,48±0,11 18,97±0,09 12,39±0,09 0,39±0,09
тиМ(М.244) 3,75±0,03 14,47±0,13 22,72±0,03 11,88±0,08 5,88±0,08
тиЬ7(М.244) 0,89±0,01 14,86±0,05 11,57±0,04 11,16±0,03 0,16±0,03
тиЬ8(М.244) 4,11 ±0,01 15,94±0,02 23,75±0,04 14,37±0,07 0,37±0,07
Т. ter- F-308 (исходный) 5,78±0,02 9,19±0,07 10,39±0,11 11,06±0,09 1,06±0,09
т^-2(Т.308) 4,08±0,03 14,64±0,19 14,20±0,10 19,10±0,12 4,10±0,12
т^-3(Т.308) 3,96±0,04 14,17±0,08 14,11 ±0,07 21,64±0,14 1,64±0,14
т^-6(Т.308) 5,10±0,04 12,72±0,16 13,96±0,04 21,98±0,05 3,98±0,05
т^-9(Т.308) 4,61 ±0,16 9,10±0,04 12,72±0,16 31,96±0,04 11,98±0,05
растворенного кислорода в культуральной жидкости при таких условиях культивирования находилось в пределах 4,0-4,2 мг/л. В контрольной колбе, содержащей не ино-кулированную питательную среду, содержание кислорода находилось на том же уровне. Изменения соотношения культу-ральной жидкости и объема колбы, а также скорости вращения качалки изменяли концентрацию растворенного кислорода в питательной среде. Благодаря серии комбинаций подобных приемов получен размах величин от 1,0 до 7,0 мг/л растворенного кислорода. Эти возможности, несомненно, следует учитывать при выборе режимов культивирования в условиях качалок. Однако, при таком подходе нельзя избежать возможных артефактов, обусловленных различием гидродинамических условий и механических воздействий. В связи с этим, для обеспечения точности эксперимента использовали специально сконструированный нагнетатель кислорода, снабженный расходомером. Частота вращения качалки была снижена до 150 об./мин.
В результате стало возможным поддержание концентраций растворенного кислорода во вращающихся колбах на желаемом уровне при сохранении единых гидродинамических параметров. При помощи подачи кислорода из баллона получили варианты, соответствующие 3,07± 0,04; 4,09±0,05; 5,04±0,03; 7,05±0,04; 9,06± 0,03 г/л. Минимальная концентрация кислорода, фиксируемая в колбах без подачи газа, находилась на уровне 2,0±0,2 мг/л. Измерения содержания кислорода производилось трижды в сутки в течение всего периода культивирования и поддерживалось на постоянном уровне.
В результате проведенных исследований было установлено, что отношение к
содержанию растворенного кислорода в среде неоднозначно как на уровне видовой принадлежности штаммов, так и в пределах разнообразия мутантных штаммов. В целом, штаммы вида Т. terrestris тяготеют к относительно более высокому содержанию кислорода в среде, что может быть связано с их ростовыми особенностями.
Заслуживает внимания факт наиболее широкого диапазона толерантности по отношению к указанному фактору у следующих мутантных штаммов: тиМ(М.244) М. thermophila, т^-6(Т.308) и т^-9(Т.308)Т. terrestris. Расширенный диапазон толерантности может объясняться с позиций активации у мутантных штаммов антиокси-дантных ферментных систем, в связи с чем целесообразным представляется исследование биохимических особенностей селекционированных штаммов в дальнейшем. Тем не менее, расширение диапазона толерантности к колебаниям в действии такого фактора, как концентрация кислорода в среде (на фоне установленной эвритерм-ности для штаммов тиМ(М.244) М. thermophila и т^-6(Т.308) и Т. terrestris), также свидетельствует о перспективах практического использования полученных мутантов.
Заключение.
На заключительном этапе исследований была проведена оценка устойчивости мутантов к спонтанной диссоциации в ряду поколений. Путем серии последовательных 12 пассажей получены поколения культур, для каждого из которых была проведена оценка макроскопических, микроскопических, ростовых показателей, а также цел-люлазной активности на уровне качественной оценки. Установлена значительная устойчивость на уровне неизменных характеристик у мутантов М. thermophila на
уровне 78,5-94% и у мутантов Т. terrestris на уровне 67,9-92%. В результате отобраны наиболее устойчивые в спонтанной диссоциации штаммы с широким диапазоном толерантности к действию основных факторов среды: тиМ(М.244) М. Шегто-phila и т^-6(Т.308), которые будут служить
объектами для цикла исследований особенностей биохимических параметров мутантов. В дальнейшем планируется оценка их биотехнологического потенциала как деструкторов лигноцеллюлозных материалов с целью биоконверсии.
Литература
1. Остроух, О.В. Обогащение белком лигноцеллюлозных субстратов в процессе прямой биоконверсии микроорганизмами/О.В. Остроух, Т.П. Цедрик, В.С. Болтовский // Весц Нацыянальнай акадэмп навук Беларусь Серыя хiмiчных навук. - 2002. - № 2. - С. 94-98.
2. Последовательная биоконверсия лигноцеллюлозных субстратов как способ реализации биотехнологического потенциала грибов / Д.Ю. Ильин, Г.В. Ильина, Л.В. Гарибова[и др.] // Микология и фитопатология. - 2017. - Т. 51. - № 2. - С. 90-98.
3. Сашенкова, С.А. Использование базидиальных макромицетов для рециклизации отходов сельскохозяйственного производства/С.А. Сашенкова, Г.В. Ильина // Животновъдни науки. -2005. -Т. 42. - № 5. - С. 264-267.
4. Сашенкова, С.А. Оценка активности лигнолитических и целлюлазолитических ферментов базидиальных грибов разных трофических групп в лабораторных условиях / С.А. Сашенкова, Г.В. Ильина, Д.Ю. Ильин // XXI век: итоги прошлого и проблемы настоящего плюс. - 2016. - № 02(30).
- С. 197-203.
5. Шмидт, К.Н. Выделение новых штаммов-деструкторов целлюлозы, их роль в снижении антропогенной нагрузки на экосистему / К.Н.Шмидт, Г.Г. Худайгулов // Вестник Южно-Уральского государственного университета. Серия Пищевые и биотехнологии. - 2016. - Т. 4. - № 4. - С. 5463.
6. Ильина, Г.В. Биологические и экологические особенности термофильного гриба ThielaviaTerrestris, определяющие его биотехнологический потенциал / Г.В. Ильина, Д.Ю. Ильин, С.А. Сашенкова // Сурский вестник. - 2018. - №4 (4). - С. 10-15.
7. Характеристика грибных штаммов-продуцентов термостабильных ксилоглюканаз из Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов / И.Н. Крестьянова, Л.Ф. Сахибгараева, О.В. Березина [и др.] // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. - 2016. - Т. 34. -№ 3. - С. 109-114.
8. Singh, B. Myceliophthorathermophila syn. Sporotrichum thermophile: a thermophilicmould of bio-technological potential / B. Singh // Critical Reviews in Biotechnology. - 2016. - V. 36. - № 1.- С. 5969.
9. Влияние лигнина и кислорода на рост и липидообразованиеLentinustigrinus / А.А. Ивашеч-кин, Я.Э. Сергеева, В.В. Лунин [и др.] // Прикладная биохимия и микробиология. - 2014. - Т. 50. -№ 3.- С. 318-324.
10. Дудка, И.А. Методы экспериментальной микологии (справочник) / И.А. Дудка, С.П. Вассер.
- Киев: Наукова думка, 1982. - 552 с.
11. Kumar, A.K.Production of Lipid and Fatty Acids during Growth ofAspergillusterreuson Hydrocarbon Substrates / A.K. Kumar, P.Vatsyayan, P.Goswami// Applied Biochemistry and Biotechnology.-2010. - V. 160. - № 5.-Р. 1293-1300.
12.ГОСТР 54653-2011 Удобрения органические. Методы микробиологического анализа: введ. 2013-01-01. - Москва: Стандартинформ, 2012. - 27 с.
13. Teather, R. M.Use of congo-red polysaccharide interaction in enumerationand characterization of cellulozalytic bacteria the bovine rumen / R. M.Teather, P. J.Wood // Appl. EnvironMicrobiol. - 1982.-№ 43 (4). - P. 777-780.
14.Халафян, А.А. Statistica 6. Статистический анализ данных / А.А. Халафян. - Москва: Бином-Пресс, 2007. - 512 с.
15. Органическая химия нуклеиновых кислот / Н.К. Кочетков, Э.И. Будовский, Е.Д. Свердлов [и др.]. - Москва: Химия, 1970. - 717 с.
16. The influence of hydrological processing of vegetable material as the basic component of substrate, on the conversion of substances by mycelium and the yield of fungus GanodermaLucidum (Curt.:fr.) p. Karst/G.V. Ilyina, D.Yu. Ilyin, A.A. Galiullinet al.//Research Journal of Pharmaceutical, Biological and Chemical Sciences. - 2018. - V. 9. - № 3.- С. 1303-1307.
Нива Поволжья № 3 (52) август 2019 103
UDK 663.15+ 57.083.13 582.84
METHODS OF THE SELECTION OF PRODUCERS-ORGANISMS CELLULASE PERSPECTIVE FOR THE BIOCONVERSION OF FARM PRODUCTION WASTES
D. Yu. Ilyin, cand. biol. sciences, associate professor; G. V. Ilyina, doctor of biol. sciences, professor;
S. A. Sashenkova, cand. biol. sciences, associate professor;
A. A. Galiullin, cand. agriculturalsciences, associate professor
FSBEE HE Penza state agrarian university, Russia, e-mail: ilyina.g.v@pgau.ru
The article deals with the information about the possibilities and methods of selection and screening of strains of fungi, promising destructors of cellulose and lignin. The research were connected with the development and use of methods for breeding strains of cultures of fungi, taking into account their ecological peculiarities, with the aim of fully realizing their enzymatic potential in the processes of byconversion of farm production wastes. As the materials resulting from the processing of crop production products contain a sufficiently large number of carbon sources, they can be considered as the basis for the creation of composts, substrates for the cultivation of economically valuable insects. However, the dominant localization of carbon in the composition of cellulosic and lignin components is often a factor that significantly reduces the nutritional value of such materials. In this regard, the preliminary fermentation of these substrates will provide the degradation of polymers, primarily lignin. This can contribute to the formation of a series of intermediates that have an effect that stimulates the metabolism of both direct destructors of plant materials and organisms inoculated on the resulting compost (substrate) as a secondary component of the conversion cascade. The paper contains information on the developed method of breeding strains of fungi using a series of induced mutations by the chemical mutagen methyl methanesulfonate. The screening was conducted using Getchinson selective medium (modified). Determination of cellulase activity was conducted at the level of quality assessment. Four mutant strains of each species were selected, and the range of tolerance of mutants to the action of such environmental factors as temperature and oxygen concentration in the medium was evaluated. The presence among mutant strains of cultures with wide ranges of tolerance has been established. An assessment of the resistance of cultures to spontaneous dissociation in a series of 12 passages was carried out. Two mutant strains with extended endurance spectra to fluctuations of environmental factors resistant to spontaneous dissociation were selected, which can be considered as promising cultures for bioconversion of lignocellulosic wastes.
In the course of selection the culture of fungi-promising cellulose destructors having a number of environmental features were obtained. They can be used for bioconversion processes, preliminary and parallel fermentation of compost.
Key words: waste bioconversion, crop production wastes, selection of microorganisms, enzymes, cellulose.
References:
1. Ostroukh O. V. Protein enrichment of lignocellulosic substrates in the process of bioconversion by microorganisms / O.V. Ostroukh, T.P. Tsedrik, V. S. Boltovsky // Vestnik of National Academy of sciences of Belarussia. Grey Hmong of Navy. - 2002. - № 2. - P. 94-98.
2. Sequential bioconversion of lignocellulose substrates as a method to realize the biotechnological potential of fungi / D. Yu. Ilyin, G. V. Ilyina, L. V. Garibova [et al.] / / Mycology and Phytopathology. -2017. - Vol. 51. - № 2. - P. 90-98.
3. Sashenkova, S. A. Using basidiomycetes macromycetes for recycling wastes of agricultural production / S. A. Sachenkova, G. V. Ilyina // Zivotnosti nauki. - 2005. -Vol. 42. - № 5. - P. 264-267.
4. Sashenkova, S. A. Evaluation of activity and legalities cellulosolytic enzymes bazi fungi of different trophic groups in laboratory conditions / S. A. Sashenkova, G. V. Ilyina, D. Yu. Ilyin / / XXI century: the results of the past and challenges of the present plus. - 2016. - № 02(30). - P. 197-203.
5. Schmidt, K. N. The selection of new strains-destructors of cellulose and their role in reducing an-thropo-genic load on the ecosystem / K. N. Schmidt, G. G. Hudaigulov // Vestnik of the South Ural state university. Food and biotechnology series. - 2016. - Vol. 4. - № 4. - P. 54-63.
6. Ilyina, G. V. Biological and ecological characteristics of the thermophilic fungus ThielaviaTer-restris determining its biotechnological potential / G. V. Ilyina, D. Yu. Ilyin, S. A. Sashenkova // Sursky Vestnik. - 2018. - № 4 (4). - P. 10-15.
7. Characterization of fungal strains-producers of thermo-stable xyloglucans from All-Russian collection of industrial microorganisms / I. N. Krestyanova, L.F. Sakhibgarayeva, O.V. Berezina [et al. ] // Molecular genetics, Microbiology and Virusology. - 2016. - Vol. 34. - № 3. - P. 109-114.
8. Singh, B. Myceliophthorathermophila syn. Sporotrichum thermophile: a thermophilicmould of bio-technological potential / B. Singh // Critical Reviews in Biotechnology. - 2016. - V. 36. - No. 1.- S. 5969.
9. The effect of lignin and oxygen on the growth and lipid formation Lentinustigrinus / A. A. Ivashechkin, J. E. Sergeyeva, V. V. Lunin [et al.] // Applied biochemistry and microbiology. - 2014. -Vol. 50. - № 3.- P. 318-324.
10. Dudka, I. A. Methods of experimental mycology (Handbook) / I. A. Dudka, S. P. Wasser. - Kiev: Naukova Dumka, 1982. - 552 p.
11. Kumar, A.K.Production of Lipid and Fatty Acids during Growth ofAspergillusterreuson Hydrocarbon Substrates / A.K. Kumar, P.Vatsyayan, P.Goswami// Applied Biochemistry and Biotechnology.-2010. - V. 160. - № 5.- P. 1293-1300.
12.GOSTR 54653-2011 Organic fertilizers. Methods of microbiological analysis: introduction. 201301-01. - Moscow: Standartinform, 2012. - 27 p.
13. Teather, R. M.Use of congo-red polysaccharide interaction in enumerationand characterization of cellu-lozalytic bacteria the bovine rumen / R. M.Teather, P. J.Wood // Appl. EnvironMicrobiol. -1982.- № 43 (4). - P. 777-780.
14.Khalafyan, A. A. Statistics 6. Statistical data analysis / A. A. Khalafyan. - Moscow: Binom-Press, 2007. - 512 p.
15. Organic chemistry of nucleic acids / N. K. Kochetkov, E. I. Budovsky, Ye. D. Sverdlov [et al.]. -Moscow: Chemistry, 1970. - 717 p.
16. The influence of hydrological processing of vegetable material as the basic component of substrate, on the conversion of substances by mycelium and the yield of fungus GanodermaLucidum (Curt.:fr.) p. Karst/G.V. Ilyina, D.Yu. Ilyin, A.A. Galiullinet al.//Research Journal of Pharmaceutical, Biological and Chemical Sciences. - 2018. - V. 9. - № 3.- P. 1303-1307.
Нива Поволжья № 3 (52) август 2019 105
