CC BY
84
Курский научно-практический вестник "Человек и его здоровье", 2014, № 4
УДК 616.8-008.61-085-092.9
ЭФФЕКТЫ ТРИПЕПТИДА GLY-HIS-LYS НА ПОВЕДЕНЧЕСКИЕ РЕАКЦИИ У КРЫС
В ТЕСТЕ ОТКРЫТОГО ПОЛЯ
© Чернышёва О.И., Бобынцев И.И., Долгинцев М.Е.
Кафедра патофизиологии Курского государственного медицинского университета, Курск
E-mail: bobig@mail.ru
Трипептид Gly-His-Lys (фактор роста гепатоцитов) при внутрибрюшинном введении за 12 минут до начала эксперимента в дозах 0,5; 5 и 50 мкг/кг в тесте «открытое поле» однократно со временем экспозиции 5 минут во всех использованных дозах вызывал у животных снижение проявлений страха и тревожности, которое выразилось в повышении ориентировочно-исследовательской активности и ослаблении реакции замирания как в периферических, так и в центральных частях «открытого поля». Показатели эмоциональности (груминг и дефекации) при этом существенно не изменялись. Характер полученных результатов позволяет предполагать наличие у пептида нейротропных эффектов, в том числе анксиолитического.
Ключевые слова: открытое поле, пептид Gly-His-Lys, тревожность, поведение, эмоциональность.
THE TRIPEPTIDE GLY-HIS-LYS INFLUENCE ON BEHAVIORAL REACTIONS OF RATS
IN THE TEST “OPEN FIELD”
Chernysheva O.I., Bobyntsev I.I., Dolgintsev M.E.
Pathophysiology Department of Kursk State Medical University, Kursk
The tripeptide Gly-His-Lys (hepatocyte growth factor) administered intraperitoneally 12 minutes before the experiment in singledoses of 0.5, 5 and 50 mg / kg in the test “open field” with exposure time of 5 minutes in all the doses caused a reduction of fear and anxiety manifested themselves in increasing the exploratory activity and decreasing the immobility reaction both in the peripheral and in the central parts of the “open field”. Emotionality indices (grooming and defecation) did not change significantly. The character of the obtained results suggests the presence of the peptide neurotropic effects, including anxiolytic one.
Keywords: open field, the peptide Gly-His-Lys, anxiety, behavior, emotionality.
Известно, что короткие пептиды участвуют в регуляции гомеостаза на различных уровнях организации живой материи и являются частью сложнейшей системы специализированных молекул-сигнализаторов и переносчиков информации между клетками организма [2, 9]. К коротким регуляторным пептидам можно отнести трипептид Gly-His-Lys, для которого известны модулирующее влияние на рост и дифференцировку клеток
[14], процессы ранозаживления за счет стимуляции синтеза коллагена фибробластами [11], стимулирующее влияние пептида на рост волос [15] и противовоспалительный эффект в поврежденных тканях [10]. Однако в литературе отсутствуют данные об исследовании нейротропных эффектов данного пептида. При этом вышеуказанная полифункциональность пептида и данные литературы о механизмах влияния коротких регуляторных пептидов на функции нервной системы
[9] позволяют предполагать наличие подобных эффектов и у данного трипептида.
Одним из наиболее распространенных методов изучения поведения животных является тест «открытое поле», который позволяет в новых условиях оценить ориентировочно-
исследовательские и защитно-оборонительные поведенческие реакции. Учитывая стрессогенное
воздействие условий эксперимента, данный тест используется и в качестве модели тревоги. Поэтому целью данного исследования являлось изучение влияния трипептида Gly-His-Lys на поведение крыс в тесте «открытое поле».
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Эксперименты выполнены на 40 крысах-самцах Вистар массой 180-220 г., полученных из питомника РАМН «Столбовая». Животных содержали в клетках по 10 особей в стандартных условиях вивария со свободным доступом к воде и пище при 12-часовом световом режиме и контролируемой температуре (22±2°С). Все исследования проводились с соблюдением принципов Хельсинкской декларации о гуманном отношении к животным и в соответствии с решением регионального этического комитета.
В работе использовали пептид Gly-His-Lys, синтезированный в НИИ химии Санкт-Петербургского государственного университета. Пептид растворяли в физиологическом растворе и вводили внутрибрюшинно за 12 мин до начала опыта в дозах 0,5; 5 и 50 мкг/кг. Контрольным животным вводили эквивалентные объемы фи-
25
Экспериментальная биология и медицина
зиологического раствора из расчета 1 мл на 1 кг массы.
Исследования проводили в промежуток времени с 9 до 14 часов. До начала исследования животные были приучены к рукам экспериментатора. «Открытое» поле представляло собой квадратную площадку размером 90 x 90 см с непрозрачными бортиками высотой 30 см, разделенную на 36 квадратов, со сторонами 15 см.
Время каждой экспозиции составляло 5 минут. В ходе эксперимента регистрировали следующие показатели: число пересеченных квадратов (центральных и периферических), а также продолжительность движения и замирания в них, число и продолжительность вертикальных стоек (вставания), замирание в периферических квадратах, число проявлений реакции груминга и ее продолжительность, количество фекальных болюсов. Для оценки достоверность результатов использовали однофакторный дисперсионный анализ и t-критерий Стьюдента для множественных выборок.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Трипептид Gly-His-Lys оказывал значительное влияние на исследованные формы поведения животных (таблица 1). В частности, число пересеченных центральных квадратов и время движения в них при использовании всех доз пептида значительно превышало показатели контрольной группы. При этом продолжительность движения в группе животных, получавших пептид в дозе 0,5 мкг/кг, была в 6,8 раза (p<0,05) больше контрольных значений, в дозе 5 мкг/кг - в 4 раза (p<0,05), 50 мкг/кг - в 9,5 раз (p<0,05). Число пересеченных квадратов после введения пептида в дозе 0,5 мкг/кг возрастало в 3,5 раза (p<0,05), в дозе 5 мкг/кг - в 2,8 раза (p<0,01), в дозе 50 мкг/кг - в 5,5 раз (p<0,01). Увеличение данных показателей происходило на фоне уменьшения продолжительности реакции неподвижности (замирания), достигавшего достоверных различий с контрольной группой после введения наименьшей использованной дозы 0,5 мкг/кг. Характер изменения исследованных поведенческих реакций в центральной части экспериментальной установки предполагает наличие у животных снижения проявлений реакции страха после введения пептида.
Во всех подопытных группах животных после введения пептида наблюдалось уменьшение длительности реакции неподвижности в периферических квадратах открытого поля. Так, наиболее выраженное изменение данной реакции (на 91%, p<0,05) отмечалось при введении Gly-His-Lys
в дозе 0,5 мкг/кг. С увеличением вводимой дозы пептида эти изменения носили менее выраженный характер - на 83% (p<0,05) в обеих группах.
Характер изменения реакции движения на месте под действием Gly-His-Lys также имел однонаправленный характер. Использование пептида в наименьшей дозе 0,5 мкг/кг приводило к наиболее значительному снижению данного показателя (на 71 %, p<0,001). Дальнейшее увеличение дозы вводимого препарата также вызывало уменьшение длительности реакции движения на месте: в группе животных, получавших Gly-His-Lys в дозе 5 мкг/кг, на 48% (p<0,05), а в дозе 50 мкг/кг - на 51% (p<0,05).
Горизонтальная двигательная активность, характеризующаяся временем движения животного и числом пересеченных квадратов, находилась в обратной зависимости от значений реакции неподвижности. Во всех подопытных группах отмечалось увеличение длительности реакции движения по сравнению с контрольными животными. Применение пептида в дозе 0,5 мкг/кг приводило к росту продолжительности данной поведенческой реакции на 106% (p<0,001), в дозе 5 мкг/кг - на 66% (p<0,05), в дозе 50 мкг/кг - на 87% (p<0,001).
Сходные изменения отмечались и при оценке числа пересеченных периферических квадратов. Использование пептида в заданном диапазоне доз приводило к выраженному и достоверному увеличению указанного показателя на 93% (p<0,001) при дозе 0,5 мкг/кг; на 69% (p<0,05) при дозе 5 мкг/кг и на 90% (p<0,01) при дозе 50 мкг/кг (табл. 1).
Эффекты пептида на уровень вертикальной ориентировочно-исследовательской активности имели выраженный характер. Так, в минимальной использованной дозе 0,5 мкг/кг Gly-His-Lys увеличивал количество вставаний в арене на 112% (p<0,01). В подопытной группе, получавшей препарат в дозе 5 мкг/кг, уровень вертикальной активности превышал контрольные значения на 76% (p<0,05). Дальнейшее увеличение вводимой дозы до 50 мкг/кг сопровождалось активацией данной формы поведения, которая достигала достоверных различий с контрольными значениями (на 106%, p<0,05). Данный факт, свидетельствующий в пользу повышения уровня исследовательской активности и одновременно уменьшения тревожности, является очередным подтверждением предполагаемой анксиолитической направленности действия пептида Gly-His-Lys.
Известно, что важным компонентом поведенческой реакции, отражающим эмоциональность, является изменение количества фекальных болюсов. Применение пептида в дозе 0,5 мкг/кг вызывало увеличение данного показателя на 33%.
26
Курский научно-практический вестник "Человек и его здоровье", 2014, № 4
Таблица 1
Показатели поведения крыс в тесте «открытое поле» после введения Gly-His-Lys (M±m)
———Группа Показатель —— Контроль 0,5 мкг/кг 5 мкг/кг 50 мкг/кг
Центральные квадраты
Замирание (сек) 3,0±0,8 2,1±0,1 * 2,6±0,3 2,3±0,4
Движение (сек) 1,2±0,3 8,1±2,7* 4,9±1,3* 11,4±4,2*
Число пересеченных квадратов 1,1±0,1 3,9±1,3* 3,1±0,7* 6,1±1,6*
Периферические квадраты
Замирание (сек) 47,6±15,8 4,5±2,5* 7,8±4,8* 7,9±5,8*
Движение (сек) 91,6±14,8 189,1±7,9* 151,9±17,8* 170,8±10,7*
Число пересеченных квадратов 64,6±12,3 124,8±5,9* 109,0±12,2* 122,6± 11,8*
Вставания (сек) 37,5±7,6 48,0±4,7 43,4±4,4 41,2±6,8
Число вставаний 10,9±2,7 23,1±2,1* 19,2±2,9* 22,4±4,6*
Число фекальных болюсов 1,5±0,6 2,0±0,6 0,9±0,4 1,1±0,6
Груминг (сек). 21,6±5,1 15,4±3,9 28,4±6,5 17,9±4,4
Число проявлений груминга 1,6±0,4 1,7±0,5 1,9±0,2 1,4±0,3
Примечание: * - p<0,05-0,001 по сравнению с показателями контрольной группы.
Вместе с тем, с дальнейшим увеличением вводимой дозы пептида, напротив, отмечалось снижение числа болюсов в группе, получавшей препарат в дозе 5 мкг/кг (на 40%) и в дозе 50 мкг/кг (на 27%). Однако данные изменения не имели статистически значимых различий с показателями контрольной группы.
Изменения продолжительности и числа проявлений реакции груминга во всех подопытных группах не имели определенной направленности и различия в сравнении с показателями контрольной группы. Так, при использовании пептида в дозе 0,5 мкг/кг длительность указанной реакции снижалась на 29% при незначительном увеличении числа вставаний. Дальнейшее повышение дозы Gly-His-Lys до 5 мкг/кг сопровождалось увеличением длительности реакции (на 32%) и числа проявлений (на 19%). Однако введение трипептида в наибольшей из используемых доз 50 мкг/кг приводило к противоположному эффекту и снижало продолжительность реакции гру-минга (на 17%) и количество проявлений этой реакции (на 12%).
На основании полученных результатов можно заключить, что применение трипептида Gly-His-Lys способствовало достоверному повышению горизонтальной и вертикальной двигательной активности при отсутствии существенных изменений эмоциональности, оцениваемой по реакциям дефекации и груминга.
Известно, что помещение животного в новую обстановку ведет к возникновению исследовательского поведения, которому препятствует возникающий при этом страх. Наиболее стрессор-ными являются первые 4-5 минут, в течение которых двигательная активность связана с чув-
ством страха, а в последующем - с исследовательским поведением [8]. Однако проявление тревожности может заключаться как в усилении активности, так и в противоположной ему реакции замирания [6].
Одним из наиболее важных признаков снижения уровня страха является активация исследования животным центральных квадратов [4]. Обычно данная ситуация постепенно развивается при исследовании поведения на протяжении нескольких дней за счет угасания страха. В условиях нашей работы ослабление страха достигалось за счет влияния пептида, что, в свою очередь, могло способствовать усилению ориентировочноисследовательской реакции в виде вертикальной и горизонтальной двигательной активности.
В пользу ослабления страха свидетельствует и ослабление реакции замирания как в центральных, так и периферических квадратах. Необходимо отметить, что тревожность животных в первые минуты пребывания в новой обстановке может проявляться как в усилении двигательной активности, так и в противоположной реакции замирания. Поэтому отмеченное нами на фоне угнетения реакции замирания усиление двигательной активности, вероятно, именно вследствие усиления исследовательского поведения и не является проявлением панической реакцией животных в условиях стресса. При этом нами не было установлено различий с контрольной группой по уровню эмоциональности, которую оценивали по реакциям дефекации и груминга. Данную реакцию относят к «категории комфортного поведения», однако груминг у грызунов является специфической общепризнанной реакцией на стресс [5, 12, 13]. Существенными факторами, определяющими состо-
27
Экспериментальная биология и медицина
яние страха и тревожности, являются и показатели дефекации [4, 5, 16]. Поэтому отсутствие изменения данных показателей эмоционального состояния животных после введения Gly-His-Lys на фоне других проявлений ослабления реакции страха требует проведения дальнейших исследований в данном направлении.
Также важно отметить, что полученные данные об анксиолитическом действии пептида Gly-His-Lys являются очередным подтверждением существующих взглядов о полифункциональном характере эффектов регуляторных пептидов
[3, 7].
Таким образом, трипептид Gly-His-Lys при внутрибрюшинном введении у крыс по результатам теста «открытое поле» вызывал снижение проявлений страха и тревожности, которое выразилось в повышении ориентировочноисследовательской активности и ослаблении реакции замирания, в том числе и в центральной части экспериментальной установки. Характер полученных результатов позволяет предполагать наличие у пептида нейротропных эффектов, в том числе анксиолитического.
ЛИТЕРАТУРА
1. Акмаев И.Г., Гриневич В.В. От нейроэндокринологии к нейроиммуноэндокринологии // Бюл. экспе-рим. биологии и медицины. - 2001. - Т. 131, № 1. - С. 22-32.
2. Ашмарин И.П. Гормоны и регуляторные пептиды: различия и сходство понятий и функций. Место гормонов среди других межклеточных сигнализаторов // Российский химический журнал. - 2002. -Т. 49, № 1. - С. 4-7
3. Ашмарин И.П., Каразеева Е.П. Новые роли высокостабильных олигопептидов, нейротрофинов и иммуномодуляторов в регуляторном континууме // Успехи физиол. наук. - 2003. - Т. 34, № 1. -С. 14-19.
4. Буреш Я., Бурешова О., Хьюстон Дж. П. Методики и основные эксперименты по изучению мозга и поведения. - М. : Высшая школа, 1991. - 399 с.
5. Зайченко М.И., Ванециан Г.Л., Мержанова Г.Х. Различия в поведении импульсивных и самокон-толирующих крыс при исследовании их в тестах
открытого поля и светло-темной камеры // Журнал высшей нервной деятельности. - 2011. - Т. 61, № 3. - С. 340-350.
6. Калуев А.В. Стресс, тревожность поведение (ак-тульные проблемы моделирования тревожного поведения у животных) - Киев : CSF, 1998. - 17 с.
7. Королева С.В., Мясоедов Н.Ф. // Успехи физиол. наук. - 2012. - Т. 43, № 3. - С. 38-47.
8. Маркель А.Л. К оценке основных характеристик поведения крыс в тесте открытого поля. Журнал высшей нервной деятельности. - 1981. - Т. 31, № 2. - С. 301-306.
9. Хавинсон В.Х., Соловьев А.Ю., Тарновская С.И., Линькова Н.С. Механизм биологической активности пептидов: проникновение в клетку и эпигенетическая регуляция экспрессии генов // Успехи современной биологии. - 2013. - Т. 133, № 3. -С. 310-316
10. Ahmed M.R., Basha S.H., Gopinath D., Muthusamy R., Jayakumar R. Initial upregulation of growth factors and inflammatory mediators during nerve regeneration in the presence of cell adhesive peptide-incorporated collagen tubes // J Peripher Nerv Syst. -
2005. - Vol. 10, N 1. - P. 17-30.
11. Arul V., Kartha R., Jayakumar R. A therapeutic approach for diabetic wound healing using biotinylated GHK incorporated collagen matrices // Life Sci. -2007. - Vol. 80, N 4. - P. 275-284.
12. Barros H.M., Tannhauser S.L., Tannhauser M.A., Tannhauser M. The effect of GABAergic drugs on grooming behavior in the open field // Pharmacol. Toxicol. - 1994. - Vol. 74, N 6. - P. 339-344.
13. Celis E. M., Torne E. Measurement of grooming behavior. Methods in Neurosciences // Paradigms for the study of Behavior. - 1993. - Vol. 14. - P. 359-378.
14. Pickart L. The human tri-peptide GHK and tissue remodeling// J Biomater Sci Polym Ed. - 2008. -Vol. 19, N 8. - P. 969-988.
15. Pyo H.K., Yoo H.G., Won C.H., Lee S.H., Kang Y.J., Eun H.C., Cho K.H., Kim K.H. The effect of tripeptide-copper complex on human hair growth in vitro // Arch Pharm Res. - 2007. - Vol. 30, N 7. -P. 834-839.
16. Rodgers R.J., Cole J.C., Aboualfa K., Stephenson L.H. Ethopharmacological analysis of the effects of putative ‘anxiogenic’ agents in the mouse elevated plus maze. // Pharmacol. Biochem. - 1995. - Vol. 52, N 3. - P. 1-9.
28
