CC BY
99
УДК 612.13:54-414+612.1
ЭФФЕКТЫ МАЛООБЪЕМНОЙ ПЕРФУЗИИ КРОВИ, АКТИВИРОВАННОЙ ГЕМОСОРБЕНТАМИ
Н.В. Буркова 1, С.И. Кузнецов2, А.И. Тюкавин 1 2 1 Санкт-Петербургская государственная химико-фармацевтическая академия, Россия 2 Федеральный центр сердца, крови и эндокринологии им. В.А. Алмазова,
Санкт-Петербург, Россия
EFFECTS OF SMALL VOLUME BLOOD PERFUSION ACTIVATED BY HEMOSORBENTS
N.V. Burkova 1, S.I. Kuznetsov2, A.I. Tyukavin1 2 1 State Educational Institution of Higher Professional Education «Saint-Petersburg State Chemical-Pharmaceutical Academy, Ministry of Public Health and Social Development of RF», Saint-Petersburg, Russia 2 Federal State Institution «V.A. Almazov Center of Heart, Blood and Endocrinology», Saint-Petersburg, Russia
© Н.В. Буркова, С.И. Кузнецов, А.И. Тюкавин, 2011
В комплексном исследовании in vitro, в опытах на животных, а также в результате обследования пациентов с критической ишемией и гнойно-некротическими заболеваниями конечностей установлено, что при контакте крови с гемосорбентом происходит активация гуморальных и клеточных систем организма. Наблюдается изменение функциональных характеристик клеток крови: усиление адгезивных свойств лейкоцитов и тромбоцитов, увеличение миграционной активности нейтрофилов и индукции активных форм кислорода. После малообъемной гемоперфузии пораженного региона выявлено усиление кровоснабжения конечности, повышение концентрации лактоферрина и миелопероксидазы в плазме венозной крови. Кроме того, отмечено преобладание эйкозаноидов с вазодилятационными и антиагрегантными свойствами (простагландин Е2, простациклин). Происходит изменение спектра цитокинов, характерное для противовоспалительной реакции организма.
Малообъемная гемоперфузия в комплексной терапии больных с критической ишемией нижних конечностей, воспалительными и гнойно-некротическими заболеваниями пальцев и кисти позволяет повысить эффективность лечения тяжелой категории пациентов, качественно улучшить общее состояние больных, оптимизировать раневой процесс и корригировать нарушения основных звеньев гомеостаза.
Ключевые слова: малообъемная перфузия крови, активация крови сорбентами,
гемосорбенты.
The complex investigation in vitro, animal experiments and also the examination of the patients with critical ischemia and suppurative necrotic diseases of the extremities have shown that when blood contacts with hemosorbent, the humoral and cellular systems of the organism are activated. The changes in functional characteristics of blood cells are observed: enhanced adhesive properties of leukocytes and thrombocytes, increased migration activity of neutrophils and induction of active oxygen forms. Intensified blood supply of the extremity, increased concentration of lactoferrin and myeloperoxidase in venous blood plasma are revealed after small volume hemoperfusion of an affected region. Besides that, predominance of eicosanoids with vasodilatation and anti-aggregant properties (prostaglandin E2, prostacyclin) is revealed.
There takes place the change in cytokine spectrum typical of anti-inflammatory reaction of the organism.
Small volume hemoperfusion used in the complex therapy of the patients with critical ischemia of the lower extremities and inflammatory and suppurative necrotic diseases of the fingers and hand makes it possible to enhance the effectiveness of the treatment of the patients with severe pathology, to improve qualitatively the patients’ general condition, optimize the wound process and correct disturbances in the main homeostasis components.
Key words: small volume hemoperfusion, blood activation by sorbents, hemosorbents.
Введение
Среди методов физико-химической коррекции нарушений гомеостаза при различных видах патологии важная роль принадлежит эфферентной терапии. Эфферентные технологии позволя-
ют извлекать из крови экзогенные и эндогенные токсины, моделировать внутри и вне организма естественные процессы его очищения или существенно дополнять их в случае нарушения функций систем детоксикации организма [1-6].
В основе лечебного эффекта метода гемосорбции лежат два процесса - адсорбция, которая определяется силами молекулярного сцепления и обусловлена образованием связей различной природы между токсическими продуктами и сорбентом, и контактная активация крови. Опыт эфферентной терапии показал, что гемосорбенты связывают и удаляют из кровотока определенные, в том числе токсические, соединения в соответствии с их емкостными характеристиками [7-8]. Однако реакции организма на удаление веществ, с которыми связывают патогенез эндогенной интоксикации, при гемосорбции неоднозначные. Показано, что содержание удаляемого эндогенного вещества после гемосорб-ционной процедуры может быстро восстанавливаться и даже превышать исходные значения, но лечебный эффект при этом все равно сохраняется длительное время. В некоторых случаях корреляция между количеством удаленной субстанции, рассматриваемой как патогенный фактор, и положительным эффектом сорбционной процедуры вообще отсутствует. Установлено, что при гемосорбции происходит активация клеточных элементов крови как непосредственно при их контакте с поверхностью гранул сорбента, так и опосредованно через воздействие гуморальных факторов. При контакте крови с сорбционной поверхностью активируются гуморальные и клеточные системы крови с передачей информации на клетки и межклеточную среду организма. Эти процессы развертываются за короткий промежуток времени и носят тран-зиторный характер [9-10]. Какую роль в лечебных эффектах гемосорбции играют механизмы, опосредованные активацией клеточных систем организма, во многом остается неясным.
Для выяснения роли активационных механизмов в лечебных эффектах гемосорбции следовало разработать технологию гемосорбции, при которой адсорбционный эффект был бы минимальным, а активационный механизм - главенствующим. Местные и системные активационные механизмы при гемосорбции можно инициировать перфузией через сорбенты малого объема крови, а выраженность активации гуморальных и клеточных систем крови изменять, применяя твердофазные препараты с различными физикохимическими свойствами. Представляется, что для верификации лечебного эффекта активированную контактным способом кровь было бы целесообразно направлять непосредственно в сосудистый регион, где расположены патологически измененные органы и ткани.
Цель исследования - оценить роль активации клеточных и гуморальных механизмов организма, опосредованных малообъемной перфузией крови через сорбенты, в клиническом эффекте при лечении воспалительных и гнойнонекротических заболеваний.
Материал и методы
В исследовании использованы основные методы анализа реакций клеточных и гуморальных систем организма на контакт крови с различными по физико-химической природе гемосорбентами, используемыми в эфферентной терапии: эксперименты in vitro, эксперименты на лабораторных животных, клинические исследования. В качестве гемокон-тактных препаратов использовали: угольный поливалентный, деминерализованный и дополнительно очищенный сорбент СКТ-6А-ВЧ (СПбМАПО); четырехпроцентную попереч-носшитую гранулированную крупнозернистую агарозу (Агароза-4Б, НИИ химии АНЭР).
Эксперименты in vitro выполнены с использованием проб крови здоровых доноров. В колонки забирали кровь, пропуская через сорбент, и устанавливали в ротационное устройство, осуществлявшее вращение проб с постоянной скоростью. Общее время контакта крови с гемосорбентом составляло 120 мин. Анализ количества клеточных элементов проводили на гемоцитоме-тре Hemoscreen-13. Исследования спонтанной и индуцированной хемилюминесценции проводили методом люминолзависимой хемилюми-несценции (ХЛ) (LKB-Wallac 1251, Швеция). Постановку реакции на спонтанную миграцию осуществляли по методу А.Г. Артемовой.
Эксперименты на животных выполнены на 360 нелинейных белых крысах-самцах массой 180-200 г («Рапполово» РАМН). Для оценки регионарных перераспределений фракции сердечного выброса использовали макроагрегаты сывороточного альбумина (МАА) диаметром 10-30 мкм, меченые 131I (г. Обнинск), активностью 10 мкКи.Оценку регионарных изменений микроциркуляторной части сосудистого русла проводили с помощью регистрации распределения в тканях и органах водорастворимого 86RbCl. Эффективность малообъемной гемоперфузии региона оценивали по реакции сердечнососудистой системы через 15 и 30 мин от начала процедуры. В качестве контроля I рассматривали животных, фиксированных на станке в течение 30 мин. Крысам II контрольной и опытных групп (I и II) катетеризировали бедренную артерию
через общую сонную артерию и перфузировали регион без сорбента - контроль II или с сорбентом (0,3 мл) - опыт. В опыте I использовали угольный сорбент СКТ-6А-ВЧ, а в опыте II -Агарозу-4Б. Из бассейна бедренной артерии забирали
1 мл крови (7% ОЦК), пропуская ее через сорбент, и сразу возвращали в циркулирующую кровь.
В клинике использовали метод малообъёмной гемоперфузии (МОГ), который заключался в пункции бедренной артерии или вены (под жгутом) пораженной конечности, заборе крови в специальную колонку, содержащую гемоконтактный препарат (СКТ-6А-ВЧ), активации крови путём ротации колонки и возврате активированной крови. Процедура занимала 3-5 мин. Объём перфузируемой крови - до 50 мл. Курс составлял 3-4 процедуры МОГ с интервалом 1-2 дня (Патент РФ №2203098, 2003; Патент РФ №2210391, 2003; Патент РФ № 2233178, 2004; Патент РФ №2282466, 2006).
Метод малообъемной гемоперфузии использовали в комплексной терапии на отделении сердечно-сосудистой хирургии СПб НИИСП им. И.И. Джанелидзе. В исследования включен 131 пациент, находившийся на обследовании и лечении. Все пациенты были разделены на основную и контрольную группы. Длительность заболевания в обеих группах составила 4,8±1,09 года, возраст - от 35 до 83 лет. В основную группу вошли пациенты с облитерирую-щими заболеваниями артерий нижних конечностей в стадии критической ишемии. Пациентам основной группы (56 больных) проводили курс малообъемной гемоперфузии. В контрольную группу вошли 75 больных с критической ишемией нижних конечностей (КИНК) на фоне об-литерирующего атеросклероза сосудов нижних конечностей, сахарного диабета, эндартериита, которым проводили традиционную терапию. Кроме того, были проанализированы результаты обследования 440 больных с воспалительными и гнойно-некротическими заболеваниями пальцев и кисти, получавших специализированное лечение в Центре по лечению хирургических инфекций (Городская больница № 14, СПб). Из них 80 пациентам проведены курсы МОГ на фоне стандартной для каждого вида патологии терапии. Клинический эффект курса оценивали по критериям: 1) субъективная оценка больного, включающая в себя болевой синдром, улучшение или ухудшение самочувствия; 2) объективная оценка местного процесса - скорость очищения раны, скорость формирования грануляций и стихания острых воспалительных явлений.
Биохимический анализ крови выполняли на многопрофильном анализаторе «Stat Profile Ultra» (США). Исследование флуоресценции плазмы крови проводили на анализаторе «СТЭМ» (ГОИ им. С.И. Вавилова, Россия). Определение нитратов и нитритов проводили в пробах плазмы крови методом Грисса. Определение концентрации цитокинов проводили с помощью тест-систем (НИИОЧБ, СПб) сэндвич-методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА). Концентрации лактоферрина и миелопероксидазы определяли в плазме крови с помощью твердофазного иммунофермент-ного анализа (ИФА). Использовали: наборы для ИФА (СПб ИЭМРАМН), наборы фирмы «Вектор-Бест» (Новосибирск). Концентрацию эйкозаноидов регистрировали в плазме венозной крови больных с помощью иммунофер-ментного анализа (наборы фирмы «Amersham», Великобритания).
Ближайшие результаты лечения оценивали по времени, в течение которого пациентам с критической ишемией нижних конечностей удавалось сохранить пораженную конечность, и отдаленные - по уровню летальности в течение 5 лет после лечения.
Статистический анализ полученных результатов проводили с использованием прикладных пакетов SPSS 11.5 и Statistica 6.0 for Windows. Достоверность изменения показателей внутри групп в ходе лечения оценивали с помощью t-критерия Стьюдента для попарно связанных выборок и критерия Вилкоксона для парных сравнений, достоверность различий показателей между группами - с помощью t-критерия Стьюдента для независимых выборок и U-критерия Манна - Уитни. Для анализа непараметрических показателей применяли метод Фишера, тест х2 Пирсона. Анализ летальности и частоты ампутаций конечностей основан на построении таблиц времен жизни, графической модели функции выживания по методу Каплана - Мейера, оценки рисков. Статистически достоверными считали различия при p < 0,05.
Результаты и их обсуждение
Проведение экспериментов in vitro позволило исследовать особенности клеточного состава крови при различной длительности малообъемной гемоперфузии (50 мл) через углеродный сорбент СКТ-6А-ВЧ и Агарозу-4Б. Известно, что большинство клеточных элементов крови может служить источником регуляторных и эффекторных молекул, влияющих на функ-
циональное состояние перфузируемого органа или региона. Кратковременный (5 мин) контакт крови с углеродным сорбентом СКТ-6А-ВЧ in vitro приводил к снижению количества лейкоцитов и тромбоцитов, но не влиял на количество эритроцитов в перфузируемой крови (табл. 1). Помимо снижения общего количества лейкоцитов в пробах после контакта с сорбентом СКТ-6А-ВЧ, происходило изменение лейкоцитарной формулы крови за счет преобладания монону-клеаров, что свидетельствовало об удалении полиморфноядерных клеток в ходе малообъемной гемоперфузии. Уменьшение количества лейкоцитов, основную массу которых составляют нейтрофилы, может быть обусловлено несколькими причинами: а) разрушением клеточных элементов при контакте крови с гемосорбентом; б) включением лейкоцитов в формирующиеся тромбоцитарные и фибриновые тромбы; в) адгезией лейкоцитов на поверхности гемо-контактных препаратов.
Показано, что основным фактором, приводящим к существенной лейко- и нейтропении при контакте крови с твердофазным препаратом, является адгезия клеток на чужеродной поверхности. Следует отметить, что проба крови до контакта содержит исключительно циркулирующий пул лейкоцитов, т. е. клетки, на которых в наименьшей степени экспрессированы адгезионные молекулы. Однако в процессе контакта лейкоцитов с гранулами гемосорбента возрастает экспрессия адгезионных структур на мембране клеток, что обеспечивает их фиксацию. В связи с тем, что адгезия клеточных элементов является процессом энергозависимым, увеличение времени контакта сочеталось с уменьшением количества лейкоцитов, фиксированных на гемосорбенте.
Нейтрофильные гранулоциты обладают специализированными системами генерации активных форм кислорода (NADPH-оксидаза, миелопероксидаза), которые начинают функционировать при активации клеток. Методом люминолзависимой хемилюминесценции (ХЛ) детектировали и количественно оценивали суммарный пул активных кислородных радикалов, который является продуктом всех оксидатив-ных систем. Результаты учитывали по удельной хемолюминистенции (ХЛ), отражающей реакцию индивидуальной клетки крови на контакт с гранулами гемосорбента. Контакт крови с СКТ-6А-ВЧ in vitro вызывал активацию нейтрофи-лов и усиление удельной ХЛ в пробах крови с колонки, по сравнению с пробами из артерии и вены, что свидетельствовало о запуске ферментативных систем, генерирующих АФК. Контакт крови с гемосорбентом СКТ-6А-ВЧ в течение 20 мин приводил к увеличению показателей удельной спонтанной и индуцированной ХЛ, а их величины максимально превышал исходные значения в 100-мин пробах в 7,8 и 4,3 раза соответственно (табл. 2).
Для оценки запуска NADPH-оксидазы и МПО при контакте клеток крови с сорбентами СКТ-6А-ВЧ и Агарозой-4Б проведены эксперименты с использованием фракции нейтрофилов, выделенных на градиенте плотности фиколл-верографина. В опытных и контрольных группах регистрировали OCl- продукт жизнедеятельности МПО и O2- - продукт функционирования NADPH-оксидазы. При контакте нейтрофилов с гранулами гемосорбентов запускались обе системы генерации АФК в клетке (NADPH-оксидаза и МПО) (табл. 3). По сравнению с контрольными пробами, в опытных шло достоверное
Таблица 1
Динамика количества клеточных элементов крови при контакте с СКТ-6А-ВЧ
Время забора крови Эритроциты, х1012/л Лейкоциты, х109/л Тромбоциты, х109/л
До контакта 5,01±0,43 5,51±0,64 305±45
5 мин 4,82±0,37 4,36±0,29 280±37
20 мин 4,50±0,47 3,43±0,44* 218±26
40 мин 4,43±0,72 3,30±0,37* 188±24*
60 мин 4,36±0,53 2,56±0,33* 168±30*
80 мин 4,24±0,28 2,75±0,14* 167±28*
100 мин 4,38±0,49 2,00±0,21* 160±26*
120 мин 4,17±0,43 1,78±0,24* 153±21*
Примечание: n = 16; * - различия достоверны по сравнению с группой «до контакта» (p < 0,05).
увеличение концентрации как 02-, так и ОС1-на обоих видах гемосорбентов. Реактивность Агарозы-4Б в отношении индукции 02- в 4 раза выше по сравнению с углеродным гемосорбентом. Следует отметить, что соотношение продукции 02/0С1- в контрольных пробах - 4,12, что отражало естественное соотношение АФК-продук-ции двумя специализированными системами. Такое соотношение интермедиатов сохранялось и при контакте нейтрофилов с СКТ-6А-ВЧ - 4,17. При контакте с гранулами полисахарида соотношение 02/0С1- составляло 13,57, что свидетельствовало о предпочтительном варианте активации клетки по NADPH-оксидазному пути.
Таким образом, анализ спектра АФК, образующихся в результате контакта клеток крови с твердофазными гемосорбционными композитами, свидетельствует о возможности запуска обоих или преимущественно того или иного пути активации клеток в зависимости от химической структуры гемосорбентов или фиксированных на них активных лигандов. Это дает основание подходить дифференцированно к выбору гемо-сорбционных материалов в зависимости от того, какой эффект требуется получить для лечения конкретного патологического процесса - цито-цидный или регуляторный.
Генерацию АФК нейтрофилами можно рассматривать как начальный этап перекисного
окисления липидов (ПОЛ), а увеличение концентрации продуктов ПОЛ - как индикатор универсального механизма повреждения биологических мембран. Интегральное состояние процессов ПОЛ оценивали в плазме крови доноров в процессе контакта крови с СКН-6А-ВЧ in vitro при использовании метода флуоресценции. Исходя из данных об усилении генерации АФК в процессе контакта, можно было бы ожидать увеличения концентрации ПОЛ в исследуемых образцах плазмы. Однако уже с 40 мин инкубации крови с гемосорбентом показатели флюоресценции плазмы, отражающие степень выраженности ПОЛ, достоверно снизились и были ниже, чем в пробе до начала контакта на 40%. Уменьшение концентрации ПОЛ в плазме в процессе гемо-контактной процедуры можно связать с реализацией сорбционных свойств СКН-6А-ВЧ.
Исследовали влияние контакта крови и твердофазного препарата на базисные гомеостатические параметры крови. Следует обратить внимание на то, что такие фундаментальные параметры гомеостаза, как рН, осмоляльность (Osm), содержание гемоглобина (Hb) и парциальное давление кислорода (pO2) изменились в пределах физиологической нормы. В отличие от тенденции к снижению pO2, парциальное давление CO2 в исследуемых образцах снижалось достоверно (р < 0,05). При анализе изменений
Таблица 2
Изменение спонтанной и индуцированной хемилюминесценции крови здоровых волонтеров
при контакте крови с СКТ-6А-ВЧ (в усл. ед.)
Время контакта (мин)
ХЛ До контакта 5 20 40 60 80 100 120
Спонтанная 3,2±0,33 4,0±0,21 5,4±0,22* 7,2±0,37* 12,2±0,58* 15,8±0,56* 25,1±0,26* 19,4±0,38*
Индуцированная 6,0±0,48 6,9±0,33 7,9±0,31* 8,4±0,25 13,0±0,67* 16,0±0,43* 26,0±0,30* 19,4±0,62*
Примечание: И-С - разность между показателями индуцированной и спонтанной хемилюминесценцией (ХЛ) в пробе; п =20; * - различия достоверны по сравнению с предыдущей пробой (р < 0,05); ** - различия достоверны между спонтанной и индуцированной реакцией (р < 0,05).
Таблица 3
Уровень продукции OCl и O2 нейтрофильными лейкоцитами при их контакте
с гемосорбентами
АФК Контроль Гемосорбенты
СКТ-6А-ВЧ Агароза-4Б
O2- (цМ/Кл) OCl- (цМ/Кл) 4,56x10-7±0,326x10-7 1,11 x 10-7±0,112 x 10 -7 8,67x10-7±0,700x10-7* 2,08x10-7±0,380x10-7* 36,63x10-7±6,105x10-7** * 2,76x10-7±0,316 x10-7*
Примечание: п = 17; * - различия достоверны по сравнению с контрольной группой (р < 0,05); ** - различия достоверны по сравнению с пробами на СКТ-6А-ВЧ (р < 0,05).
в электролитном составе крови обращала на себя внимание неизменность концентраций ионов Na+. Содержание других исследуемых ионов достоверно снижалось. Во-первых, возможным механизмом этого процесса является непосредственная адсорбция ионов на углеродном сорбенте, учитывая сопоставимые объемы крови и сорбента, задействованных в эксперименте. Во-вторых, это опосредованная адсорбция положительно заряженных ионов через отрицательно заряженный сульфатированый муко-полисахарид - гепарин. В-третьих, вовлечение двухвалентных ионов Ca+2 и Mg+2 в реализацию ферментативного катализа гуморальных каскадных систем плазмы, что требовало их обязательного участия и исключения из растворов. И, в-четвертых, - возможное поступление Ca+2 в цитозоль клетки при ее прямой (контактной) или опосредованной (активированными макромолекулами) цитомодуляции, что косвенно может свидетельствовать об активации клеток.
В процессе контакта крови и твердофазного препарата отмечали усиленную утилизацию глюкозы: через 60 мин после начала эксперимента ее содержание в крови составило 5% от исходного значения. Большинство процессов, запускающихся в активированной клетке, являются энергозависимыми. К ним относится и клеточная адгезия, которая требует для своего развития определенного времени, связанного с индукцией и экспрессией на клеточной мембране необходимых адгезионных структур. Поэтому с увеличением времени контакта крови с гемосорбентом наблюдали усиление хемилюми-несценции крови и увеличение адгезии клеток на гемоконтактном препарате, проявляющееся «исключением» их из жидкой фазы крови. Параллельно с этим шло снижение концентрации глюкозы в плазме как основного энергетического субстрата описанных выше процессов.
Доказательством выраженной активации клеток крови при контакте с гемосорбентами является изменение миграционной активности лейкоцитов в экспериментах in vitro с использованием гепаринизированной крови здоровых волонтеров (табл. 4).
Спонтанная миграция лейкоцитов крови здоровых доноров была выражена незначительно. Контакт крови с гемосорбентами менял спектр биоактивных молекул, в сторону преобладания факторов, тормозящих миграцию лейкоцитов. Наиболее отчетливо это наблюдалось при использовании углеродного гемосорбента СКТ-6А-ВЧ. Уже через 5 мин контакта спонтанная
миграция лейкоцитов снижалась на 60% (p < 0,05) от исходной величины активности клеток. Через 30 мин после контакта in vitro спонтанная миграция составила 50% от ее начального значения. При контакте крови с Агарозой 4-Б торможение миграции лейкоцитов было менее выражено. Спонтанная миграция клеток в этом случае также снизилась, но ее активность колебалась от 75,0 до 80,0 % по сравнению со значениями до контакта. Обращает на себя внимание, что показатели спонтанной миграции лейкоцитов и индукция генерации ими АФК зависели от физико-химических свойств гемосорбентов.
Таблица 4
Изменение спонтанной миграции лейкоцитов при контакте крови с гемосорбентами in vitro (в усл. ед.)
Время (мин) Гемосорбент
СКТ-6А-ВЧ Агароза-4Б
До контакта 1,40±0,221
5 0,58±0,171* 1,06±0,263
30 0,68±0,262 1,10±0,210
Примечание: n = 20; * - различия достоверны по сравнению с пробой до контакта (р < 0,05).
Эксперименты на лабораторных
животных
Результаты стендовых исследований стали фундаментальными для разработки экспериментальной технологии целевой доставки активированных лейкоцитов и тромбоцитов в сосудистый регион. Механизмы действия целевой малообъемной гемоперфузии были изучены в экспериментах на крысах. Для выявления эффективности малообъемной гемоперфузии региона (7% ОЦК) регистрировали перераспределение фракции сердечного выброса (МАА1311) и изменение показателей микроциркуляции (86ИЬС1) перфузируемой и неперфузируемой конечности крысы. Отмечено, что малообъемная гемоперфузия без сорбента не вызывала усиления кровотока в обеих задних конечностях. При использовании сорбента независимо от химической структуры (СКТ-6А-ВЧ и Агароза-4Б) кровоток в тканях перфузируемой конечности животного значительно возрастал (р < 0,05), а в контралатеральной области - имел тенденцию к увеличению. Таким образом, активированная твердофазным сорбентом кровь при целевой доставке в сосудистый регион задней конечности
крысы увеличивает тканевой кровоток за счет усиления капиллярного кровообращения.
Клинические исследования
В клинике метод малообъемной гемоперфузии был включен в стандартную схему лечения больных с различными видами патологии (критическая ишемия нижних конечностей, гнойнонекротические заболевания пальцев и кисти).
У больных с критической ишемией нижних конечностей малообъемная гемоперфузия проводилась через бедренную артерию пораженной конечности. По результатам ультразвуковой допплерографии в основной группе больных после курса малообъемной гемоперфузии линейная скорость дистального кровотока увеличилась по сравнению с изначальными значениями и приблизилась к норме, показатели лодыжечно-плечевого индекса также достоверно выросли (табл. 5). Величина индекса микроциркуляции, определенная до и после лечения МОГ, показала повышение данного показателя, что свидетельствовало об усилении микроциркуляции в пораженной конечности и улучшении трофики тканей.
Для оценки температурной реакции кожи пораженной и контралатеральной конечности применяли метод многоточечной термометрии, позволяющий определять абсолютную температуру в стандартных точках. Были обследованы 39 больных. Исходная температура больной конеч-
ности была несколько ниже, чем здоровой. После МОГ температура кожи пораженной конечности через 30 мин возрастала на 0,25°С, в то время как температура контралатеральной, находящейся в тех же условиях, снижалась на 0,5°С.
Исследование генерации активных форм кислорода (АФК) нейтрофилами методом лю-минолзависимой хемилюминесценции показала, что прямая (на гемоконтактной колонке) и опосредованная (гуморальными факторами) активация нейтрофилов при малообъемной гемоперфузии не вызывает сомнений. Внутриарте-риальная перфузия региона кровью с активированными лейкоцитами должна была отразиться на функциональном состоянии клеток в венозном русле. Действительно, если до ЦМОГ показатели спонтанной ХЛ в артериальной и венозной крови были схожими, то через 30 мин после процедуры показатели ХЛ в венозной пробе крови повысились по сравнению с показателями в венозной крови до МОГ (р < 0,05).
Для оценки способности гемоконтактной процедуры изменять функциональное состояние индуцибельной NO-синтазы проведено исследование концентрации нитратов и нитритов в плазме крови больных КИНК до и после МОГ (табл. 6).
Оценивали суммарный уровень нитратов и нитритов в тех же пробах, в которых подсчитывали количество лейкоцитов и определяли
Таблица 5
Гемодинамические показатели по данным ультразвуковой допплерографии
Показатели Норма До МОГ После МОГ
МОГ Контроль МОГ Контроль
Уэ (см/с) 27,9-57,9 11,6±0,06 12,4±3,71 20,5±2,43* 18,3±2,89
п = 21 п = 12 п = 21 п = 12
ЛПИ (усл.ед.) 0,9-1,2 0,31±0,02 0,29±0,01 0,45±0,02* 0,35±0,04
п = 36 п = 51 п = 36 п = 51
Примечание: Уэ - линейная скорость дистального кровотока больной конечности; Л ПИ - лодыжечноплечевой индекс; * - различия достоверны по сравнению с показателями до лечения МОГ (р < 0,05).
Таблица 6
Содержание нитратов и нитритов в плазме крови перфузированной конечности до и после
процедуры (усл. ед)
Определяемые соединения Колонка Артерия Вена Вена-1
Нитраты и нитриты 18,9±2,07 24,7±2,41 29,8±2,51 44,3±3,23*
п =28 п = 28 п = 28 п = 26
Примечание: Вена - проба до МОГ; Вена-1 - проба через 30 мин после МОГ; * - различия достоверны по сравнению с пробой Вена (р < 0,05).
уровень ХЛ. Суммарное содержание нитратов и нитритов в артериальной и венозной крови до процедуры было практически одинаковым. В пробах крови, полученных из бедренной вены до и через 30 мин после процедуры ЦМОГ, суммарная концентрация нитратов и нитритов возрастала (р < 0,05), что свидетельствовало об усилении функционирования индуцибельной NO-синтазы в перфузируемом регионе.
Контакт крови с гранулированным препаратом СКТ-6А-ВЧ вызывал прямую и опосредованную активацию клеток. Одним из проявлений усиления функциональной активности нейтрофилов является их секреторная дегрануляция и появление в плазме маркерных белков лизосом - ЛФ и МПО (табл. 7). При контакте крови с твердофазными гранулами СКТ-6А-ВЧ происходило увеличение (р < 0,05) концентраций ЛФ и МПО в плазме крови, полученной непосредственно с колонки. Количество как ЛФ, так и МПО возрастало в пробе с колонки в 1,8 раза. После завершения трансфузии активированной крови в процессе МОГ на нижнюю треть предплечья больных с воспалительными и гнойно-некротическими заболеваниями пальцев и кисти накладывали второй жгут, отграничивая отток крови из очага поражения. Спустя 20 мин повторно накладывали жгут на плечо, снимали второй жгут с предплечья и забирали кровь из локтевой вены. Исследование ЛФ и МПО в плазме этой пробы крови показало, что концентрация МПО составила 72% исходного уровня, а ЛФ - 52% (р < 0,05).
Для оценки роли метаболитов арахидо-новой кислоты - вазоактивных эйкозанои-дов, у больных с воспалительными и гнойнонекротическими заболеваниями пальцев и кисти (основная группа) и здоровых волонтеров (контроль) в плазме определяли эйкозанои-ды с вазодилятаторым (PGE2 и 6-кето-PGF1a) и
вазоконстрикторным (ТЬг В2 и Leuk С4/Б4/Е4) эффектами. После проведения курса МОГ (4 процедуры) произошло увеличение суммарной концентрации метаболитов арахидоновой кислоты в 1,5 раза (простагландин Е2, простаци-клин, тромбоксан А2, лейкотриены С4/Б4/Е4) в плазме крови. В составе метаболитов арахидоновой кислоты на протяжении всего курса МОГ преобладали эйкозаноиды с вазодилятацион-ными и антиагрегантными свойствами (простагландин Е2, простациклин). Вероятно, что малообъемная гемоперфузия подавляет липок-сигеназные процессы и приводит к усилению метаболизма арахидоновой кислоты по циклок-сигеназному пути, что способствует противовоспалительному эффекту лечебной процедуры.
Проведены исследования концентрации ци-токинов в пробах крови из локтевой вены больных с критической ишемией нижних конечностей (КИНК) до начала лечения методом МОГ и после завершения данного курса. Определяли концентрации ИЛ-1р, ФНО-а, ИФН-у, ИЛ-8, ИЛ-10. Отмечали общую тенденцию к снижению концентрации провоспалительных цитокинов, регистрируемых в сыворотке венозной крови: ИЛ-8 - 1,2 раза; ИЛ-1р - в 1,5 раза; ИФН-у -в 4 раза. Концентрация ИЛ-10 увеличилась в
2 раза. Применение регионарной малообъемной гемоперфузии у пациентов у больных с воспалительными и гнойно-некротическими заболеваниями пальцев и кисти вызывало схожие изменения содержания цитокинов в сыворотке крови.
Процедура МОГ позволила значительно снизить нагрузку антибиотиками, а в некоторых случаях и полностью от неё отказаться, что, в свою очередь, может использоваться в дальнейшем при наличии непереносимости больными антибиотиков или возросшей устойчивости микроорганизмов к препаратам. Улучшение микроциркуляции в поражённом сегменте способствовало
Таблица 7
Динамика концентраций лактоферрина и миелопероксидазы при малообъемной
гемоперфузии
Маркеры, нг/мл Пробы крови
до МОГ с колонки 20 мин после МОГ 80 мин после МОГ
Лактоферрин 669±35,6 1218±38,0* 1015±41,7* ** 311±24,4* **
Миелопероксидаза 138±17,7 249±23,4* 238±18,5* 188±11,2 **
Примечание: п = 177; * - различия достоверны по сравнению с показателями до МОГ (р < 0,05); ** - различия достоверны по сравнению с пробами «с колонки» (р < 0,05).
повышению биодоступности лечебных препаратов в зону воспаления и ускорению регенерации пораженных тканей.
Клинический эффект процедуры МОГ выражался в улучшении самочувствия и настроения больных, значительном уменьшении болей покоя в конечности, уменьшении воспалительного отека, уменьшении очагов ишемии, отторжении некротических тканей, разрастании нормальных грануляций, усилении эпителизации и рубцевании трофических язв. Сравнительный анализ результатов лечения больных с воспалительными и гнойно-некротическими заболеваниями верхних конечностей традиционно и с использованием малообъемной гемоперфузии свидетельствовал о том, что применение этой процедуры приводит к сокращению сроков пребывания пациентов в стационаре на 3,7±0,64 койко-дня, а также уменьшению числа осложнений с 29,6% до 7,7%. Анализ отдаленных результатов проведения процедуры малообъемной гемоперфузии показал, что в контрольной группе больных с критической ишемией нижних конечностей в сроки до 6 месяцев от момента выписки процент высоких ампутаций составил 67,5%, а в группе пациентов с включением курса малообъемной гемоперфузии, - 34,14%.
Выводы
Результаты проведенного исследования подтверждают, что лечебный эффект гемосорбции обусловлен не только удалением «гипотетических» токсических продуктов, а связан с развитием активационных процессов в системе гуморально-клеточной кооперации. С этих позиций колонка для гемосорбции может рассматриваться как временный генератор активных «валентностей», поставляющий активированные макромолекулы и форменные элементы крови в течение всего периода нахождения сорбента в системе циркуляции. При этом гемоперфузия больших объемов крови через сорбционные колонки часто бывает малооправданной. Более приемлемым и обоснованным способом воздействия на патологический процесс, при котором не идентифицирован токсический фактор, является малообъемная гемоперфузия как с точки зрения необходимой и достаточной активации гуморально-клеточных цепных реакций, так и с точки зрения доставки образовавшихся активностей в очаг поражения. Малообъемная
Н.В. Буркова e-mail: [email protected]
гемоперфузия в комплексной терапии больных с критической ишемией нижних конечностей и воспалительными и гнойно-некротическими заболеваниями пальцев и кисти позволяет повысить эффективность лечения тяжелой категории пациентов, качественно улучшить общее состояние больных, оптимизировать раневой процесс и корригировать нарушения основных звеньев гомеостаза.
Литература
1. Лопухин, Ю.М. Гемосорбция / Ю.М. Лопухин, М.Н. Молоденков. - М. : Медицина. -1985.- 287 с.
2. Картель, Н.Т. Биосовместимость углеродных гемосорбентов / Н.Т. Картель // Эфферентная терапия. - 1998. - Т.4, № 4. - С. 3-9.
3. Петросян, Э.А. Биологическая совместимость модифицированных гемосорбентов / Э.А. Петросян [и др.] // Бюл. экспер. биологии и мед.- 2002. - Прил. 2.- С. 76-78.
4. Гуревич, К.Я. Современные направления развития экстракорпоральной гемокоррекции/ К.Я. Гуревич [и др.]// Эфферентная терапия. -2004. - Т. 10, № 3. - С. 26-36.
5. Сергиенко, В.И. Оценка состояния про-оксидантной системы и вазоактивного статуса организма при развитии и лечении ишемии-реперфузии конечности с применением модифицированных натрия гипохлоритом углеродных гемосорбентов / В.И. Сергиенко [и др.] // Эфферентная терапия.- 2006.- Т. 12, № 4. - С. 21-25.
6. Петросян, Н.Э. Клинико-лабораторная оценка эффективности физико-химической гемокоррекции при лечении больных с флегмонами челюстно-лицевой хирургии : автореф. дисс. докт. мед. наук / Н.Э. Петросян. - Краснодар, 2009. - 44 с.
7. Солдатов, А.И. Структура и свойства поверхности углеродных материалов / А.И. Солдатов // Вест. Челяб. ун-та.- 2001.- № 1.- С. 155-163.
8. Ветров, В.В. Экстракорпоральная гемокоррекция в акушерстве / В.В. Ветров // Эфферентная терапия. - 1999. - Т. 5, №3. - С. 21-26.
9. Кузнецов, С.И. Эффекторные механизмы гемоперфузии / С.И. Кузнецов // Эффекторная терапия.- 1998. - Т. 4, № 4. - С. 28-31.
10. Кузнецов, СИ. Практические аспекты принципа твердофазной контактной активации крови / С.И. Кузнецов // Успехи соврем. естествознания. - 2006. - № 2.- С. 31-32.
