CC BY
56
Микробиология и эпидемиология Вестник Нижегородского университета им. Н.И. Лобачевского, 2012, № 2 (3), с. 64-69
УДК 579.66:[620.193.8+504.054]
ЭФФЕКТЫ КОМБИНИРОВАННОГО ДЕЙСТВИЯ НИЗКОИНТЕНСИВНОГО МИЛЛИМЕТРОВОГО ИЗЛУЧЕНИЯ И ВЫСОКОИНТЕНСИВНЫХ ХИМИЧЕСКИХ И ФИЗИЧЕСКИХ ФУНГИЦИДНЫХ ФАКТОРОВ
© 2012 г. Д-В. Кряжев, А.А. Ичеткина, В.Ф. Смирнов
Нижегородский госуниверситет им. Н.И. Лобачевского
fungo. cem@gmail .com
Поступила в редакцию 10.04.2012
Исследовано комбинированное воздействие низкоинтенсивного миллиметрового излучения в сочетании с ультрафиолетовым излучением и биоцидными препаратами «Авансепт» и «Гипохлорид натрия» в субфунгицидных концентрациях на пропагулы ряда микромицетов-деструкторов. Выявлен высокий синергический фунгицидный эффект совместного воздействия КВЧ-излучения и вышеуказанных физических и химических биоцидных факторов.
Ключевые слова: микромицеты, пропагулы, КВЧ-излучение, УФ-излучение, биоцидные препараты, фунгицидное действие.
Введение
Подавляющее большинство промышленных материалов способно подвергаться биоповреждениям [1]. Материалы и изделия из них находятся в определенных связях с окружающей средой - в природе существует множество биоагентов, которые легко поселяются на поверхности или проникают внутрь материалов и изделий и начинают там развиваться, что и приводит к возникновению биоповреждений [2]. Особой агрессивностью в данном отношении обладают микроорганизмы, на которые приходится более 40% от общего числа биоповреждений. Наиболее жизнеспособными, а поэтому и крайне опасными среди микроорганизмов являются микроскопические грибы - в силу быстрого роста мицелия, богатства, мощности и лабильности их ферментных систем, позволяющих им использовать большой круг материалов как природного, так и искусственного синтеза
[3].
Биоповреждения, вызываемые микроорганизмами, не только наносят колоссальный экономический ущерб, но и, что не менее важно, являются источником риска опасного воздействия биологических и химических факторов. Биоповреждающие процессы сопровождаются интенсивным размножением микроорганизмов, повышением их концентрации на пораженных материалах, в воздухе. Многие из возбудителей, и прежде всего микромицеты, являются потенциальными патогенами и могут быть причиной
различных инфекционных заболеваний. В этом аспекте ведущая роль отводится плесневым грибам. Таким образом, защита от микробиологических повреждений одновременно является и защитой человека от воздействий этого фактора среды.
Одним из наиболее эффективных и длительно действующих способов защиты материалов от поражения микроорганизмами является применение биоцидных соединений [4]. Повышенную опасность для экологии, как правило, представляют синтетические вещества, используемые в качестве средств защиты от микробных повреждений. В силу исходной токсичности, неспецифичности действия они длительно сохраняются и накапливаются в природе, оказывая негативное действие на все живые организмы, биоценозы в целом. Продукты их частичной биологической или химической трансформации могут быть причиной токсикологического риска. В значительной степени ситуация осложняется появлением у грибов резистентности к фунгицидам, что вызывает необходимость увеличения норм их расхода и частоты применения. Практически неизученным остается вопрос о последействии фунгицидов, в том числе вопрос о причинах более сильного повреждения грибами материалов, ранее обработанных фунгицидами.
Учитывая, что биоповреждениям подвергается практически все, что создает и сооружает человек во всех сферах своей деятельности, легко представить, сколь велики масштабы за-
грязнения среды химическими веществами, используемыми для защиты от возбудителей повреждений. Так как современное общество не может обходиться без фунгицидов, получаемых методом химического синтеза, снижение их негативного воздействия на окружающую среду представляют собой важнейшую экологическую проблему [5].
Для решения этой проблемы ученые многих стран, в том числе и России, считают возможным снизить расход используемых фунгицидов за счет повышения их эффективности или создания новых, более эффективных, чем известные. Однако создание новых фунгицидов, отвечающих всем требованиям, предъявляемым к веществам такого назначения, является процессом очень длительным и дорогостоящим.
С экологических позиций более перспективным способом снижения химической нагрузки на среду является комплексное использование химических и физических методов, т.к. при этом биоцидный эффект достигается при более низкой концентрации токсических веществ. Примерами такого сочетания являются:
• аэрозольное распыление препарата и облучение ультрафиолетом [6];
• щадящая стерилизация под влиянием небольших доз ионизирующего излучения, длинноволнового УФ или микроволн с добавлением к ним биоцидов низкой концентрации [7].
Однако, несмотря на очевидную целесообразность такой позиции, до настоящего времени она не получила должного развития. В значительной степени эта ситуация обусловлена недостаточным уровнем научно-практических разработок и связанным с этим некоторым информационным вакуумом, а также отсутствием подготовки специалистов в этой области.
Ранее нами были изучены фунгицидные эффекты ряда излучений, как высокоинтенсивных (ультрафиолет), так и низкоэнергетических (излучение миллиметрового диапазона, крайне высокой частоты и низкой интенсивности (ГОЧ)) [8]. Было показано, что действие ГОЧ-излучения на пропагулы исследованных мик-ромицетов способно вызывать их гибель, были установлены оптимальные мощностные характеристики фунгицидного действия KВЧ-
излучения. Однако следует отметить, что выявленный нами биоцидный эффект KВЧ-излучения в дозе 0.018 мДж/см2, которая инактивирует ~70% титра KОЕ у микромицетов-биодеструкторов, нельзя признать удовлетворительным в практическом аспекте проведения биозащитных мероприятий.
В связи с вышеизложенным, цель настоящего исследования - изучение эффективности комбинированного фунгицидного действия КВЧ-излучения в дозе 0.018 мДж/см2, характеризующейся оптимальным фунгицидным эффектом [9], с ультрафиолетовым (УФ) излучением в дозе 60 мДж/см2 (опытным путем нами было установлено, что данная доза для микро-мицетов является сублетальной [8]), а также с химическими биоцидными препаратами в их субфунгицидных концентрациях.
Экспериментальная часть
Источником КВЧ-волн служил аппарат КВЧ-ИК терапии СЕМ-ТЕСН (производитель ООО «Спинор», г. Томск), излучателем в аппарате является диод Ганна, выполненный на основе нанокристаллов арсенида галлия, генерирующий КВЧ-излучение с широкополосным шумовым спектром Ганна от 42 до 100 ГГц, длина волны 9.677-8.333 мм, плотность потока импульсной мощности 5х10"10 Вт/см2 *с, частота импульсов излучения 9 Гц.
Источником ультрафиолетового излучения служил облучатель ультрафиолетовый кварцевый 0УФК-01 «Солнышко», производимый ОАО «ГЗАС им. А.С. Попова» (г. Нижний Новгород). Эффективный спектральный диапазон излучения 230-400 нм. Облученность в эффективном спектральном диапазоне - 1.0 Вт/м2. Генератором УФ-лучей в данном приборе является лампа бактерицидная ДРТ 125-1 ультрафиолетовая, разрядная, ртутная, высокого давления, дуговая, трубчатая, предназначенная для работы в установках, применяемых в медицине, биологии, сельском хозяйстве. Лампа рассчитана для работы в сети переменного тока частоты 50 Гц напряжением 220 В с соответствующим активным балластным сопротивлением.
В работе использовались следующие био-цидные препараты:
1. Средство дезинфицирующее с моющим эффектом «Авансепт». Содержит 6% гидрохлорида полигексаметиленгуанидина и 4.5% хлорида алкилдиметилбензиламмония в качестве действующих веществ. В экспериментах использовались водные растворы данного препарата в субфунгицидной концентрации 0.5%.
2. Водный раствор гипохлорида натрия (NaClO). В экспериментах использовались водные растворы данного препарата в субфунгицидной концентрации 0.1%.
В качестве тест-культур использовались следующие виды микромицетов: Aspergillus niger van Tieghem, Alternaria alternata (Fries) Keissler,
Chaetomium globosum Kunze, Fusarium
moniliforme Sheldon, Penicillium chrysogenum Thom.
По методике Хабриева [10] готовились два варианта (контрольный и опытный) суспензий пропагул вышеуказанных тест -культур микромицетов одинаковой мутности (с равным количеством грибковых тел), во всех контрольных вариантах проводилась имитация облучения контактом с неработающим излучателем, в опытных вариантах осуществляли последовательное воздействие KВЧ - и УФ -излучениями, а также одновременное совместное воздействие KВЧ -излучения и биоцидного препарата, согласно методике количественного определения микроорганизмов [11]. Затем 1 мл контрольных и опытных суспензий высевался на поверхность твердой питательной среды Чапека-Докса в чашках Петри, чашки культивировались в термостате при (28±2)°С с последующим подсчетом колониеобразующих единиц ^ОЕ). Эффект фунгицидного действия в опыте в процентах к контролю (ДТ) рассчитывали по формуле
ДТ = xlOO,
^o
где t0 - количество KОE в контроле; t\ - количество KОE в опыте.
Измерения проводились в нормальных лабораторных условиях. Полученные данные статистически обработаны с помощью компьютерной программы Statistica 6.0 и представлены в виде средних арифметических значений (M+m). Оценку значимости отличий между группами проводили по критерию Стьюдента: p < 0.05, n = 3, t = 4.303.
Результаты и их обсуждение
На первом этапе данной работы нами проводилась оценка фунгицидного эффекта от совместного синергического действия КВЧ-излу-чения в дозе 0.018 мДж/см2 и УФ-излучения в дозе 60 мДж/см2. Результаты эксперимента представлены в табл. 1.
Как видно из данных таблицы, комбинированное применение КВЧ-излучения в дозе
0.018 мДж/см2 и УФ-излучения в дозе 60 мДж/см2 позволяет инактивировать ~93% КОЕ тест-культур микромицетов, что значительно превышает фунгицидный эффект раздельного воздействия данных излучений. Интерпретировать данный эффект можно следующим образом: известно, что ультрафиолетовое излучение с длиной волны 200-300 нм и интенсивностью в несколько мВт/см2 оказывает летальный эффект на клетки микроорганизмов, вызывая формирование тиминовых димеров в ДНК, это подавляет репликацию ДНК и вызывает летальный эффект [12]. В свою очередь, полагают, что механизм действия КВЧ-излучения связан с ингибированием репаратив-ных процессов в клетках [13]. Синергичность действия данных видов излучения обеспечивается за счет того, что КВЧ-излучение нарушает внутриклеточные механизмы нейтрализации мутагенных эффектов УФ-излучения.
Таким образом, по итогам проведенных экспериментов можно сделать вывод о том, что совместное воздействие КВЧ- и УФ-излучений, в дозах 0.018 и 60 мДж/см2 соответственно, характеризуется высокой фунгицидной активностью; применяя данное комплексное воздействие, можно будет проводить антиплесневые дезинфекционные мероприятия с высоким уровнем эффективности (80-100%). Примене-
Таблица 1
Раздельное и комбинированное воздействие на пропагулы микромицетов КВЧ - и УФ-излучений
Kоличество KQE/мл
Вид гриба Kb4, 0.018 мДж/см2 УФ, 60 мДж/см2 Kb4, 0.018 мДж/см2 + + УФ, 60 мДж/см2
контроль опыт ДТ, % контроль опыт ДТ, % контроль опыт ДТ, %
Aspergillus niger 78±7 29±9 63 180±7 51±11 72 148±1 26±4 82
Alternaria alternata 26±6 7±1 73 59±8 26±4 56 84±10 14±1 83
Chaetomium globosum 8±2 1±1 88 24±3 14±4 42 76±13 1±1 99
Fusarium moniliforme 118±12 41±4 65 131±7 2±2 98 115±12 0±0 100
Penicillium chrysogenum 165±5 51±3 69 121±14 21±6 83 115±25 1±1 99
ние подобного комплексного метода дезинфекции будет особенно актуальным в условиях современного мегаполиса, учитывая, что в последние годы мы все чаще сталкиваемся со своего рода «экологической экспансией» условнопатогенных микромицетов [14].
Известно, что перспективным направлением защиты от микробиологических повреждений является комплексное использование химических и физических методов, т.к. при этом био-цидный эффект достигается при более низкой концентрации токсических веществ [6].
Поэтому на втором этапе нашей работы мы решили оценить ингибирующий эффект сочетанного воздействия KВЧ-излyчения и биоцидных препаратов в их субфунгицидных (вызывающих гибель ~50% KОE тест-культур микромицетов) концентрациях. Выбор подобного пути обусловлен необходимостью снижения экологической нагрузки от биозащитных мероприятий.
Результаты экспериментов по оценке сочетанного фунгицидного действия KВЧ и дезинфицирующего средства «Авансепт» в концентрации 0.5% представлены в табл. 2, ГОЧ и гипохлорида натрия в концентрации 0.1% - в табл. 3.
Из представленных в таблицах данных видно, что при совместном применении KВЧ-
излучения и фунгицидных препаратов (даже в предельно малых концентрациях) фунгицидное действие данного вида излучения существенно усиливается (в среднем на 30%), вплоть до полной инактивации жизнеспособности пропагул ряда тест-культур: СК. globosum, F. топі^огте и P. chrysogenum в сочетании с препатаратом «Авансепт», и Alt. altemata и СК. globosum - с гипохлоридом натрия.
Объяснить подобный эффект, на наш взгляд, можно со следующих позиций: известно, что синергидное действие антимикробной комбинации веществ, принадлежащих к различным химическим классам, достигается, как правило, тем, что один компонент воздействует непосредственно на морфологию и физиологобиохимические процессы у грибов, другой — облегчает его проникновение в клетки [5]; в то же время ряд авторов считает, что действие КВЧ-излучения на биологические объекты может быть связано с усилением конвекции водных растворов и пассивного транспорта ионов через мембраны с переносчиком [15]. Поэтому мы предполагаем, что синергическое высокоэффективное фунгицидное действие КВЧ-излучения и биоцидов в субфунгицидных концентрациях обусловлено, в первую очередь, не собственным фунгицидным действием КВЧ-излу-
Таблица 2
Сравнительная оценка изменения титра КОЕ у микромицетов при действии фунгицидного препарата «Авансепт» в концентрации 0.5% и совместном его действии с КВЧ-излучением (0.018 мДж/см2)
Вид гриба Kоличество KОE/мл
фунгицид фунгицид и Kb4
контроль опыт ДТ, % контроль опыт ДТ, %
Alternaria alternata 18±2 9±1 50 27±2 1±1 96
Aspergillus niger 108±7 45±5 58 108±7 18±2 83
Chaetomium globosum 25±2 11±3 56 47±4 0±0 100
Fusarium moniliforme 54±4 2±1 96 54±4 0±0 100
Penicillium chrysogenum 112±4 52±2 54 227±3 0±0 100
Таблица 3
Сравнительная оценка изменения титра КОЕ у микромицетов при действии фунгицидного препарата «Гипохлорид натрия» в концентрации 0.1% и совместном его действии с КВЧ-излучением (0.018 мДж/см2)
Вид гриба Kоличество KОE/мл
фунгицид фунгицид и Kb4
контроль опыт ДТ, % контроль опыт ДТ, %
Alternaria alternata 43±2 8±3 81 24±3 0±0 100
Aspergillus niger 79±7 26±6 67 135±3 25±9 81
Chaetomium globosum 32±2 12±2 63 56±8 0±0 100
Fusarium moniliforme 55±8 20±4 64 132±15 23±6 83
Penicillium chrysogenum 73±6 42±3 42 124±11 38±5 69
чения, а тем, что оно облегчает и ускоряет процесс поступления молекул действующих веществ фунгицида внутрь грибной клетки.
Результаты данных экспериментов позволяют нам утверждать, что, сочетая дезинфекцию воздуха и поверхностей в помещениях путем облучения КВЧ с аэрозольной обработкой био-цидными препаратами в низких экологически безопасных концентрациях, можно существенно повысить качество проводимых дезинфекционных мероприятий, при этом снизив их экологическую нагрузку.
Выводы
1. При сочетанном действии на пропагулы тест-культур микромицетов УФ- и КВЧ-излучений фунгицидный эффект значительно выше, чем при их воздействии по отдельности. Особенно эффективно совместное действие УФ- и КВЧ-излучений инактивирует споры культур СЪа&втшт globosum, Ешапит тотИ/огте, РетсШшт chrysogenum. Данные излучения могут совместно использоваться для высокоэффективной инактивации микромицетов - деструкторов различных материалов и изделий.
2. Выявлен высокий синергический эффект в фунгицидном действии на пропагулы микро-мицетов-деструкторов КВЧ-излучения и суб-фунгицидных концентраций некоторых широко применяемых в современной России биозащит-ных препаратов.
Работа выполнена при финансовой поддержке Фонда содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере (программа СТАРТ 09: проект № 9449, контракт № 6804р/9449).
Список литературы
1. Дрозд Г.Я. Микроскопические грибы как фактор биоповреждений жилых, гражданских и промышленных зданий. Макеевка: Б. И., 1995. 18 с.
2. Ильичёв В.Д. Биоповреждения. М.: Высшая школа, 1987. 352 с.
3. Коваль Э.З., Сидоренко Л.П. Микодеструкторы промышленных материалов. Киев: Наукова думка, 1989. 192 с.
4. Бочаров Б.В. Химическая защита строительных материалов от биологических повреждений // В сб.: Биоповреждения в строительстве. М., 1984. С. 96-104.
5. Сухаревич В.И., Кузикова И.Л., Медведева Н.Г. Защита от биоповреждений, вызываемых грибами. СПб.: ЭЛБИ-СПБ, 2009. 206 с.
6. Иммиев Я.И., Закомырдин А.А. Способ дезинфекции воздуха // Открытия. Изобретения. 1990. № 8. С. 33.
7. Соломатов В.И., Ерофеев В.Т., Смирнов В.Ф., Семичева А.С., Морозов Е.А. Биологическое сопротивление материалов. Саранск: Изд-во Мордовского ун-та, 2001. 195 с.
8. Кряжев Д.В., Ичеткина А.А., Мухина Е.С., Трофимова С.В., Иванова И.П., Смирнов В.Ф. Высоко- и низкоинтенсивные электромагнитные излучения как средство профилактики внутрибольничных инфекций, вызываемых микромицетами-биодеструк-торами // Медицинский альманах. 2011. № 4 (17).
С. 81-84.
9. Кряжев Д.В., Смирнов В.Ф. Новые аспекты применения низкоинтенсивных излучений (КВЧ) в экобиотехнологии // Вестник ННГУ им. Н.И. Лобачевского. 2010. № 2 (2). С. 418-422.
10. Хабриев Р.У. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. Москва: Наука, 2005. 827 с.
11.Сливкин А.И., Семменев В.Ф., Суховер-хова Е.А. Физико-химические и биологические методы оценки качества лекарственных средств. Воронеж: Изд-во Воронежского госуниверсите-та, 1999. 368 с.
12. Laroussi M. Nonthermal decontamination of biological media by atmospheric-pressure plasmas: review, analysis, and prospects // Plasma Sci. Soc. 2002. V. 30. № 4. P. 1409-1415.
13. Шестопалова Н.Г. Влияние миллиметровых волн на клетки растений // Тез. докл. 2-го Съезда биофизиков России, Москва, 23-27 августа 1999. Т. 3. С. 858-859.
14. Антонов В.Б. Антропогенно-очаговые болезни жителей большого города // Журн. инфектологии. 2009. Т. 1. № 2/3. С. 7-12.
15. Кожокару А.Ф., Кожокару Н.Л., Бурковец-кая Ж.И. Механизмы прямого и опосредованного действия через воду низкоинтенсивного радиочастотного ЭМИ на мембранные системы и биологические объекты // Биомедицинские технологии и радиоэлектроника. 2006. № 8-9. С. 58-68.
COMBINED EFFECTS OF LOW-INTENSITY MILLIMETER RADIATION AND HIGH-INTENSITY CHEMICAL AND PHYSICAL ANTIFUNGAL FACTORS
D.V. Kryazhev, A.A. Ichyotkina, V.F. Smirnov
Combined impact of low-intensity millimeter radiation in combination with ultra-violet radiation and biocidal preparations «Avansept» and «Sodium hypochlorite» in subantifungal concentration on germinal structures of some microscopic fungi was investigated. The high synergistic antifungal effect of joint influence of EHF radiation and the above-mentioned physical and chemical biocidal factors was revealed.
Keywords: microscopic fungi, germinal structures, EHF radiation, UV radiation, biocidal preparations, antifungal action.
