CC BY
46
БИОЛОГИЯ
УДК 579.66:[620.193.8+504.054]
СРАВНИТЕЛЬНАЯ ОЦЕНКА ВОЗДЕЙСТВИЯ НЕКОГЕРЕНТНОГО ИМПУЛЬСНОГО И УЛЬТРАФИОЛЕТОВОГО ИЗЛУЧЕНИЙ НА РОСТОВЫЕ И БИОХИМИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ МИКРОМИЦЕТОВ-ДЕСТРУКТОРОВ
© 2013 г. Д.В. Кряжев, И.П. Иванова, А.А. Ичеткина,
С.В. Трофимова, В. Ф. Смирнов
Нижегородский госуниверситет им. Н.И. Лобачевского fungo. cem@gmail. com
Поступила в редакцию 15.03.2013
Исследовалось влияние ультрафиолетового и некогерентного импульсного излучений на пропа-гулы и мицелий ряда микромицетов. Показано, что воздействие некогерентного импульсного излучения на пропагулы сопоставимо с действием ультрафиолетового излучения. Мицелий исследованных тест-культур, развивающихся из облученных пропагул, оказался чувствительными к действию некогерентного импульсного излучения. Было установлено, что некогерентное импульсное излучение снижает активность экзопероксидазы на 3 сутки, активность экзокаталазы - с 3 по 10 сутки; ультрафиолетовое излучение оказывает существенное ингибирующее действие на активность экзоперокси-дазы и экзокаталазы на 10 сутки.
Ключевые слова: биоповреждения, микромицеты, пропагулы, мицелий, ультрафиолетовое излучение, некогерентное импульсное излучение, дезинфекция, оксидоредуктазы.
Введение
Хорошо известно, что, поселяясь на поверхности строительных материалов и конструкций, микроорганизмы наряду с разрушающим воздействием вызывают ухудшение экологической ситуации в зданиях и сооружениях. Развиваясь на материалах, грибы выделяют массу спор и различных продуктов жизнедеятельности, которые способны вызывать ряд серьезных заболеваний человека [1]. Особой агрессивностью в данном отношении обладают микроорганизмы, на которые приходится более 40% от общего числа биоповреждений. Наиболее жизнеспособными, а поэтому и крайне опасными среди микроорганизмов являются микроскопические грибы — в силу быстрого роста мицелия, богатства, мощности и лабильности их ферментных систем, позволяющих им использовать большой круг материалов как природного, так и искусственного синтеза [2]. К основным методам борьбы с микроорганизмами-деструкторами относят химический и физический. Опыт многолетнего применения данных средств показывает, что микроорганизмы, и в особенности микроскопические грибы, доста-
точно быстро (в течение 3-5 лет) вырабатывают устойчивость к тому или иному биоциду. Обработка ультрафиолетовым излучением (УФ) в последние годы является малоэффективной вследствие появления большого количества резистентных штаммов микроскопических грибов и бактерий. Известно, что применение УФ в промышленности и быту имеет ряд негативных эффектов:
• строгое соблюдение ПДК озона, который является токсичным газом;
• ожоги кожи, сетчатки глаз;
• высокая мутагенность;
• в больших дозах вызывает преждевременное старение материалов и изделий [3].
Подобная ситуация ставит задачу разработки и реализации новых безопасных и высокоэффективных технологических санитарных мероприятий по снижению заселенности микроорганизмами различных помещений. В настоящее время представляют особый интерес исследования высокоинтенсивных физических факторов, в частности импульсных электрических разрядов, которые используют при создании устройств биологического и медицинского назначения. Накопленные теоретические и экспери-
ментальные данные [4] дают основания считать возможным применение излучения разрядов в качестве бактерицидных факторов [5], однако механизмы их воздействия на микроскопические грибы изучены недостаточно.
Некогерентное импульсное излучение (НКИИ) обладает рядом преимуществ: минимум затрат, требует меньше времени, производит менее токсичные отходы по сравнению с традиционными типами дезинфекции, например ультрафиолетовым излучением [6].
В связи с вышеизложенным, цель настоящего исследования - сравнительная оценка воздействия НКИИ и УФ в дозах 135 и 60 мДж/см2 соответственно на пропагулы (части грибной структуры, воспроизводящие микро-мицет), радиальную скорость роста и динамику активности экзоферментов микромицетов-деструкторов.
Экспериментальная часть
В качестве тест-культур использовались культуры микромицетов из Всероссийской коллекции микроорганизмов: Aspergillus niger ВКМ F-1119, Alternaria alternata ВКМ F-1120, Chaetomium globosum ВКМ F-109, Fusarium moniliforme ВКМ F-136, Penicillium chrysoge-num ВКМ F-245.
Формирование импульсного искрового разряда, генерирующего некогерентное излучение оптического диапазона, осуществляли с помощью экспериментального устройства. Устройство разработано в ФГУП РФЯЦ Всероссийского НИИ экспериментальной физики (г. Саров). Энергия, подводимая к разрядному промежутку, составляла 4 Дж в 1 импульсе, длительность импульса 1-10 микросекунд. Полный поток излучения 75 кВт распределялся по диапазонам излучения в следующих пропорциях: ультрафиолетовый диапазон (310-380 н.м.) - 17% от полного потока излучения; видимый диапазон (600-700 н.м.) - 49%; инфракрасный диапазон (более 700 н.м.) - 33%. Световая энергия излучения составляла 0.9*10-3 Дж/см2. Интенсивность светового потока - 0.9 кВт/см2, мощность излучения - 11 кВт (1.4*1022 фотон/с).
Источником ультрафиолетового излучения служил облучатель ультрафиолетовый кварцевый 0УФК-01 «Солнышко», производимый ОАО «ГЗАС им. А.С.Попова» (г. Нижний Новгород). Эффективный спектральный диапазон излучения 230-400 нм. Облученность в эффективном спектральном диапазоне - 1.0 Вт/м2. Генератором УФ-лучей в данном приборе является лампа бактерицидная ДРТ 125-1 (ТУ 16675.013-83) ультрафиолетовая, разрядная, ртут-
ная, высокого давления, дуговая, трубчатая, предназначенная для работы в установках, применяемых в медицине, биологии, сельском хозяйстве. Лампа рассчитана для работы в сети переменного тока частоты 50 Гц, напряжением 220 В с соответствующим активным балластным сопротивлением.
Методика обработки НКИИ и УФ суспензии спор
Приготовлялась суспензия спор определенной концентрации (титра). Часть приготовленной суспензии служила контролем (не облучалась). Другая часть облучалась НКИИ. Далее по 1 мл контрольной и опытной суспензии высевался на поверхность твердой питательной среды Чапека-Докса в чашках Петри. Ингибирующий эффект (ДТ) излучения в процентах к контролю оценивался по сравнению количеств колониеобразующих единиц (КОЕ), выросших на поверхности среды в контроле и опыте, визуально на вторые сутки культивирования.
Величину ДТ рассчитывали по формуле ДТ=[(?о - Н)! ^]*100% где ^ - количество КОЕ в контроле; ^ - количество КОЕ в опыте.
Методика воздействия НКИИ и УФ при посадке спор грибов методом укола на агаризо-ванную среду Чапека-Докса
Посадка спорового материала осуществлялась методом укола на твердую питательную среду Чапека-Докса в трех повторностях. Высаживались контроль и опыт. В контроле проводили имитацию контакта образцов с излучателями. В опытных экспериментах пропагулы подвергались воздействию НКИИ либо УФ, в зависимости от варианта эксперимента. Вычисление радиальной скорости проводили по формуле [7]
К = (г - Го) / ^ - О, где Кг - радиальная скорость роста; го - радиус колоний в начальный момент времени to^; г -радиус колоний в момент времени t.
Определение активности экзооксидоредук-таз микромицетов
Приготавливали два варианта (контроль и опыт) суспензий зародышевых структур А. nigeг с равным количеством грибковых тел. Во всех контрольных вариантах проводилась имитация облучения НКИИ и УФ контактом с неработающими излучателями, в опытных вариантах осуществляли воздействие вышеуказанными факторами в дозе 160 (НКИИ) и 60 мДж/см2 (УФ). Затем контрольными и опытными суспензиями в объеме 2 мл инокулиро-
Таблица
Обработка НКИИ и УФ пропагул микромицетов________________________________
Время и вид воздействия Вид тест- культуры количество КОЕ/мл
Alternaria alternata Aspergillus niger Chaetomium globosum Fusarium moniliforme Penicillum chrysogenum
НКИИ, 135 мДж/см2 (доля УФ-спектра 23 мДж/см2) контроль 32±6 74±13 148±5 178±15 108±11
опыт 3±1 25±3 66±10 42±2 17±4
AT, % 91 66 55 76 84
УФ, 60 мДж/см2 контроль 59±8 180±7 24±3 131±7 121±14
опыт 26±4 51±11 14±4 2±2 21±6
AT, % 56 72 42 98 83
вались колбы, содержащие по 100 мл жидкой полной питательной среды.
Количество грибковых тел в инокулирован-ной жидкой полной питательной среде (100 мл) при действии УФ: A. niger - 371000 КОЕ/мл.
Количество грибковых тел в инокулирован-ной жидкой полной питательной среде (100 мл) при действии НКИИ: A. niger - 65500 КОЕ/мл.
Тест-культуры грибов выращивали на жидкой полной питательной среде Чапека-Докса следующего состава: сахароза - 30.00 г, K2HPO4 - 0.30 г, KH2PO4 - 0.70 г, NaNO3 - 2.0 г, KCl -
0.5 г, MgSO4 - 0.5 г, FeSO4 - 0.0002 г, водопроводная вода - 1 л, на качалках АПУ-4М со скоростью вращения 180 об/мин.
На 3, 5 и 10 сутки культивирования из контрольных и опытных образцов отфильтровывали мицелий, а в культуральной среде определяли активность таких экзоферментов, как экзока-талаза и экзопероксидаза.
Определение активности внеклеточной ката-лазы проводили по методу Patterson B.D. et al. [8]. В качестве субстрата используют 30 мМ пероксид водорода, активность измеряют по убыли субстрата - 0.03% пероксида водорода. Измерения проводят при X = 240±5 нм. Активность внеклеточной пероксидазы определяют по методу Aurand L.W., Roberts W.M., Cardwell J.T. [9]. В качестве субстрата используют 0.03% раствор Н2О2 и 0.1 М раствор парафенилендиа-мина (ПФДА), активность измеряют по прибыли продуктов ПФДА в окисленной форме. Измерения проводят при X=540±5 нм. Содержание исследуемого белка в культуральной жидкости определяли методом Лоури-Фолина [10]. В качестве стандарта использовался бычий сывороточный альбумин.
Все измерения проводили в нормальных лабораторных условиях: температура окружающего воздуха (25±5)°С; атмосферное давление (84-106) кПа; относительная влажность (80±5) %; частота переменного тока (50±1) Гц; напряжение в электрической сети (220±10) В.
Полученные экспериментальные данные были статистически обработаны с помощью программы Microsoft Ехсєі. Для установления достоверности различий использовался /-критерий Стьюдента. Результаты представлены в виде средних значений с указанием средней квадратичной ошибки. Для оценки статистической значимости различий использовался уровень вероятностир < 0.05.
Результаты и их обсуждение
На первом этапе работы представляло интерес сравнить влияние НКИИ в дозе 135 мДж/см2 и УФ в дозе 60 мДж/см2 на пропагулы тест-культур микромицетов. Ранее нами было исследовано влияние указанной дозы УФ на микромицеты и показано ее высокое фунгицидное действие [11]. Результаты данного эксперимента представлены в таблице.
При воздействии НКИИ в дозе 135 мДж/см2 наблюдалось ингибирование титра КОЕ микро-мицетов от 55% у C. globosum до 91% у A. alter-nata, а при воздействии УФ в дозе 60 мДж/см2 -от 42% у C. globosum до 98% у F. moniliforme. В результате проведенных экспериментов нами было установлено, что НКИИ в указанной дозе оказывает сопоставимый с УФ ингибирующий эффект на пропагулы микромицетов, несмотря на то, что доля УФ-спектра в НКИИ в 2.6 раза меньше дозы УФ.
На втором этапе работы представляло интерес сравнить влияние НКИИ и УФ в выше указанных дозах на радиальную скорость роста мицелия, развившегося из облученных пропагул, на 5, 7, 10 и 14 сутки.
При воздействии НКИИ наблюдается существенное отставание радиальной скорости роста мицелия A. аlternata и F. moniliforme в опыте на 4.5 и 4.4 мм/сутки соответственно (на 14 сутки). Однако при воздействии НКИИ наблюдается значительная стимуляция радиальной скорости роста A. niger в опыте на 10.5 мм/сутки на 5 сутки, к 14 суткам уровень скорости роста приближается к контролю, различие составляет 1.3
я 70
8
к 60
О
И
а. зо
и
о 40
ГО
И
» 30 £
ё 20 к
И 1 л а 10 е* л < 0
т
0 контроль □ опыт
10
Время, сутки
Рис. 1. Динамика активности экзопероксидазы A. niger при воздействии УФ в дозе 60 мДж/см2
Рис. 2. Динамика активности экзокаталазы A. niger при воздействии УФ в дозе 60 мДж/см2
Врещ суши
Рис. 3. Динамика активности экзопероксидазы А. niger при воздействии НКИИ в дозе 160 мДж/см2
мм/сутки. Возможно подобный эффект стимуляции роста связан с физиолого-биохими-ческими особенностями данного вида микро-мицета. При воздействии УФ наблюдается совсем иная картина: характер роста в контроле и опыте практически не отличается у культур А. alternata, А. niger, F. тот^огте. Полученные нами результаты показали, что НКИИ оказывает более интенсивный эффект на характер роста мицелия микромицетов по сравнению с УФ. НКИИ ограничивает ростовую активность светло- и темноокрашенных микромицетов, а, следовательно, будет препятствовать им, осваивать и колонизировать субстрат.
На третьем этапе работы представляло интерес сравнить изменение активности экзокатала-зы и экзопероксидазы в культуральной жидкости у А. niger на 3, 5 и 10 сутки после однократного воздействия УФ (доза 60 мДж/см2) и НКИИ (доза 160 мДж/см2, доля УФ-спектра 32 мДж/см2). Полученные результаты представлены в виде диаграмм (см. рис. 1-4).
Анализ полученных биохимических данных показывает, что под действием УФ активность экзокаталазы А. niger существенно возрастает на 3 сутки, а на 10 сутки она была значительно ниже, чем в контроле. Активность экзоперокси-дазы на 3 сутки культивирования в опыте незначительно возрастает, а на 10 сутки значительно снижается в сравнении с контролем. Анализируя данные, можно утверждать, что А.
mger на начальных этапах культивирования отвечает активизацией экзокаталазы и экзоперок-сидазы на воздействие УФ, затем на 10 сутки активность ферментов снижается. Таким образом, можно предположить, что ультрофиолето-вое облучение способно стимулировать выработку данных ферментов у А. niger на начальных этапах культивирования. При воздействии НКИИ отмечается значительное уменьшение активности экзопероксидазы А. niger на 3 сутки, на 5 и 10 сутки достоверных различий не наблюдалось, активность экзокаталазы значительно с,нижается с 3 по 10 сутки, что, видимо, связано с высокой чувствительностью данного фермента к НКИИ.
Выводы
1. Установлено, что некогерентное импульсное излучение в дозе 135 мДж/см2 по своему фунгицидному действию не уступает ультрафиолетовому излучению в дозе 60 мДж/см2, следовательно, на основе генераторов низкотемпературной плазмы возможна разработка высокоэффективных устройств для противо-плесневой дезинфекции.
2. Некогерентное импульсное излучение в дозе 135 мДж/см2 является более эффективным по сравнению с ультрафиолетовым излучением в дозе 60 мДж/см2 при влиянии на рост мицелия, развивающегося из облученных пропагул. Неко-
Время, сутки
Рис. 4. Динамика активности экзокаталазы А. niger при воздействии НКИИ в дозе 160 мДж/см2
герентное импульсное излучение ограничивает ростовую активность светло- и темноокрашенных микромицетов: A. аltemata и F. moniliforme в опыте на 4.5 и 4.4 мм/сутки соответственно к 14 суткам, а, следовательно, будет препятствовать им, осваивать и колонизировать субстрат.
3. Некогерентное импульсное излучение в дозе 160 мДж/см2 оказывает существенное ингибирующее действие на активность экзокаталазы A. niger уже на 3 сутки, однако УФ в дозе 60 мДж/см2 оказывает существенное ингибирующее действие на активность экзопероксида-зы и экзокаталазы A. niger только на 10 сутки. Поскольку нет общности в воздействии некогерентного импульсного и ультрафиолетового излучений на экзооксидоредуктазы отобранной нами тест-культуры микромицета, можно говорить о наличии различных механизмов действия данных видов излучения на микромицеты.
Список литературы
1. Дрозд Г.Я. Микроскопические грибы как фактор биоповреждений жилых, гражданских и промышленных зданий. Макеевка: Б. И., 1995. 18 с.
2. Ильичев В.Д. Биоповреждения. М.: Высшая школа, 1987. 352 с.
3. Соломатов В.И., Ерофеев В.Т., Смирнов В.Ф., Семичева А.С., Морозов Е.А. Биологическое сопротивление материалов. Саранск: Изд-во Мордовского ун-та, 2001. 195 с.
4. Пискарев И.М. Теоретические основы химической технологии. М.: Изд-во МГУ, 2000. 34 с.
5. Иванова И.П., Заславская М.И. Фунгицидный эффект некогерентного импульсного излучения при экспериментальном оральном кандидозе крыс // Проблемы медицинской микологии. 2005. Т. 6. С. 285.
6. Laroussi M. Nontheimal decontamination of biological media by atmospheric-pressure plasmas: review, analysis, and prospects // IEEE Trans. Plasma Sci. IEEE Nucl. Plasma Sci. Soc. 2002. V. 30. № 4. Р. 1409-1415.
7. Паников Н.С. Кинетика роста микроорганизмов. М.: Наука, 1991. 309 с.
8. Patterson B.D., Payne L.A., Chen Yi-Zhu, Grah-man P. An inhibitor of catalase induced by cold in chilling-sensitive plants // P. Physiol. 1984. V. 76. № 4. P. 1014-1018.
9. Aurand L.W., Roberts W.M., Cardwell J.T. A method for the estimation of peroxidase activity in milk. // J. Dairy Science. 1956. V. 39. № 5. P. 568-573.
10. Досон P., Элиот У., Джонс К. Справочник биохимика. М.: Мир, 1991. 464 с.
11. Кряжев Д.В., Ичеткина А.А., Мухина Е.С. и др. Высоко- и низкоинтенсивные электромагнитные излучения как средство профилактики внутрибольничных инфекций, вызываемых микромице-тами-биодеструкторами // Медицинский альманах. 2011. № 4 (17). С. 81-84.
COMPARATIVE EVALUATION OF THE IMPACT OF INCOHERENT PULSED AND ULTRAVIOLET RADIATIONS ON THE GROWTH AND BIOCHEMICAL INDICATORS OF MICROMYCETES-DESTRUCTORS
D. V. Kryazhev, I.P. Ivanova, A.A. Ichetkina, S. V. Trofimova, V.F. Smirnov
The impact of ultraviolet and incoherent pulsed radiation on propagules and mycelium of a number of micromycetes has been studied. The action of IPR on the propagules has been shown to be comparable with that of UV radiation. The mycelium developed from irradiated propagules of the test cultures appeared to be sensitive to the action of IPR which reduced the activity of exoperoxidase on the third day and exocatalase on the 3rd to 10th days. UV radiation had a significant inhibitory effect on the activity of exoperoxidase and exocatalase on the 10th day.
Keywords: biodeterioration, micromycetes, propagules, mycelium, ultraviolet radiation, incoherent pulsed radiation, disinfection, oxidoreductases.
