CC BY
86
Микробиология и эпидемиология Вестник Нижегородского университета им. Н.И. Лобачевского, 2012, № 2 (3), с. 56-63
УДК 579.66:[620.193.8+504.054]
ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ И БИОХИМИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ДЕЙСТВИЯ УЛЬТРАЗВУКА НА ОППОРТУНИСТИЧЕСКИЕ МИКРОМИЦЕТЫ
© 2012 г. Д-В. Кряжев, А.А. Ичеткина, В.Ф. Смирнов
Нижегородский госуниверситет им. Н.И. Лобачевского
fungo. cem@gmail .com
Поступила в редакцию 10.04.2012
Изучено влияние ультразвука на споры и мицелий грибов. Показано, что действие ультразвука на зародышевые структуры исследованных грибов способно вызывать их гибель. Показан дозозависимый эффект и установлены оптимальные временные характеристики фунгицидного действия ультразвука.
Ключевые слова: ультразвук, дезинфекция, микромицеты.
Введение
В искусственных условиях, наиболее отвечающих потребностям человека, выживают лишь отдельные штаммы микроорганизмов, для которых жилье человека оказывается, как и для самого человека, наиболее приемлемым. Они не патогенны для человека, они сапротрофы, но в то же время обладают способностью вызывать лизис макромолекул, поэтому при некоторых условиях могут разрушать не только мертвый биосубстрат, но и живые ткани, то есть приобретать патогенные свойства. Следовательно микромицеты внутри помещений оказывают прямые вегетативные воздействия на здоровье находящихся там людей, вступая в антибиоз с человеком [1]. Грибковые болезни занимают все большую роль в структуре заболеваемости людей. Все вышеизложенное особенно актуально для лечебно-профилактических учреждений, так как одной из самых серьезных проблем современной медицины является профилактика внутрибольничных инфекций. Дезинфекция -одно из наиболее значимых направлений данной профилактики [2].
В настоящее время человек располагает широким набором биоцидных средств, многие из которых выпускаются и используются в нашей стране. Серьезное опасение вызывает возможность химических средств оказывать мутагенное действие. Проблема загрязнения окружающей среды химическими фунгицидами усугубляется появлением к ним резистентности у грибов [3].
В свете вышеизложенного весьма актуальным является вопрос защиты человече-
ского жилища, а также самого человека от негативного воздействия микроорганизмов. Поэтому специалистами в области технической и медицинской микробиологии активно ведется изучение действия высокоинтенсивных физических факторов, противодействующих проникновению патогенных биологических агентов в места работы и проживания человека.
В настоящее время ультразвуковые волны находят все большее применение в дезинфекционном деле. Их использование базируется в основном на способности вызывать мгновенные разрывы бактериальных, животных и растительных клеток и клеточных структур. Очевидно, что ведущим стерилизующим фактором является ультразвуковая кавитация. Чем выше интенсивность ультразвуковых волн, тем более выражены кавитационные явления и тем сильнее биоцидное действие. Увеличение интенсивности оказывается в этом отношении более эффективным, чем удлинение времени озвучивания [4].
Были получены многочисленные экспериментальные данные по биоцидному действию ультразвука. В работе [5] указано, что в течение 5 минут ультразвуковой обработки удается достичь полной стерилизации питьевой воды без применения каких-либо химикатов. В работе [6] приводятся экспериментальные данные о стерилизации сточных вод ультразвуком. При воздействии ультразвука постоянной интенсивности на поверхность кожи человека, по мере увеличения его длительности количество микроорганизмов прогрессивно падает. После 30-40 мин обработки поверхность кожи становится
стерильной [7]. Работами И.Е. Эльпинера и др. [6] установлено, что при ультразвуковом воздействии повышается чувствительность микроорганизмов к дезинфицирующим веществам. Поэтому концентрации антисептиков и консервантов в сочетании с ультразвуковой обработкой могут быть уменьшены в десятки и сотни раз. Ультразвуковая обработка изделий и материалов для хирургии (например катетеров и искусственных клапанов сердца) в растворах антибиотиков обеспечивает не только стерилизацию, но и введение антибиотиков вглубь материалов.
До сих пор недостаточно внимания уделялось профилактике вызываемых оппортунистическими микромицетами - активными деструкторами материалов и конструкций - заболеваний, раннему выявлению и разработке мер профилактики. В связи с этим цель настоящего исследования - изучение воздействия ультразвука на микроскопические грибы.
Экспериментальная часть
Источником ультразвука (УЗ) служил оригинальный автономный ультразвуковой излучатель с частотой колебаний 2.5 МГц, модель UN-231 («AND», Япония).
Объектом исследования являлись 5 культур микромицетов из Всероссийской коллекции микроорганизмов: Aspergillus niger ВКМ F-1119, Alternaria alternata ВКМ F-1120, Chaetomium globosum ВКМ F-109, Fusarium moniliforme ВКМ F-136, Penicillium chrysogenum ВКМ F-245.
Методика воздействия ультразвука на суспензии спор грибов и бактерий. Приготовлялась суспензия спор определенной концентрации (титра). В опытах с бактериями чашечным методом Коха приготовляли разведение 1:10000. Часть приготовленной суспензии служила контролем. Другая часть подвергалась воздействию ультразвука с частотой 2.5 МГц. Время воздействия в экспериментах 1, 5 и 10 мин. Далее по 1 мл контрольной и опытной суспензии высевали на поверхность твердой питательной среды. Ингибирующий эффект (АТ) ультразвука в процентах к контролю оценивался по сравнению количеств колониеобразующих единиц (КОЕ) в 1 мл суспензии, выросших на поверхности среды в контроле и опыте на вторые сутки культивирования.
Величину ДТ рассчитывали по формуле: t — t
AT = ----1 х100%,
t
где ?о - количество КОЕ в контроле, ?і - количество КОЕ в опыте.
Методика воздействия ультразвука на вегетативный мицелий грибов. Мицелий тест-культур грибов выращивали на полной жидкой питательной среде объемом 250 мл в колбах в течение 7 суток. Во всех контрольных вариантах проводилась имитация воздействия УЗ на мицелий контактом с неработающим излучателем, на опытные варианты воздействовали ультразвуком в течение 10 минут. Затем контрольные и опытные образцы мицелия высаживались в центр чашек Петри на поверхность твердой питательной среды и культивировались в термостате при 28±2°С с последующим измерением линейного роста колоний на 3, 5, 7, 10 и 14 сутки.
Методика определения активности внеклеточной каталазы. Определение проводят спектрофотометрически. В качестве субстрата используют 30 мМ пероксид водорода, активность измеряется по убыли субстрата - 0.03%-ного пероксида водорода. Измерения проводят при X = 240±5 нм.
В кювету спектрофотометра толщиной 1 мл помещают 1 мл фосфатного буферного раствора (рН = 7.8), 1 мл ферментативного препарата (культуральной жидкости), 1 мл 30 мМ Н2О2. Измерения проводят в течение 1 минуты. В контрольной кювете Н2О2 заменяют Н2О. Перекись водорода запускает реакцию, поэтому вносится сразу перед измерением.
Активность каталазы рассчитывают по формуле
Вхах$х% ґ х й
где А - активность фермента; О - приращение оптической плотности (О = Е1 - Е2 - молярная экстинкция опытной пробы до внесения Н2О2 и через 1 минуту соответственно, Еі > Е2 ); ё - толщина слоя жидкости в кювете, см (=1); ? - время, мин; (а*рхх) - факторы разведения (=1).
Результаты измерений выражают в условных единицах (у.е.). За единицу активности принимают убыль оптической плотности в 1 мл реакционной смеси за 1 час, в пересчете на 1 мг вносимого белка [8].
Методика определения активности внеклеточной пероксидазы. Определение проводят спектрофотометрически. В качестве субстрата используют 0.03%-ный раствор Н2О2 и 0.1 М раствор парафенилендиамина (ПФДА), актив-
ность измеряют по прибыли продуктов ПФДА в окисленной форме. Измерения проводят при X = 540±5 нм. В кювету спектрофотометра толщиной 1 см помещают 1 . 5 мл фосфатного буферного раствора (рН = 7.2); 0.5 мл ферментативного препарата (культуральной жидкости);
0.5 мл 0.1 М раствора ПФДА; 0.5 мл 0.03% Н2О2. Измерения проводят в течение 1 минуты. В контрольной кювете Н2О2 заменяют водой. ПФДА заливается в контроль и опыт при настройке спектрофотометра; Н2О2 запускает реакцию, поэтому вносится сразу перед измерением.
Активность пероксидазы рассчитывают по формуле
Вхахрхх ґ х й
где А - активность фермента; О - приращение оптической плотности (О = Екон - Енач - молярная экстинкция опытной пробы до внесения Н2О2 и через 1 минуту соответственно, Екон > Енач); ё - толщина слоя жидкости в кювете, см (=1); t - время, мин; (ахрх^) - факторы разведения (=1).
Результаты измерений выражают в условных единицах (у.е.). За единицу активности принимают убыль оптической плотности в 1 мл реакционной смеси за 1 час, в пересчете на 1 мг вносимого белка [9].
Методика определения концентрации белка. Содержание исследуемого белка в культуральной жидкости определялось методом Лоури -Фолина [10]. В качестве стандарта использовался бычий сывороточный альбумин.
Все измерения проводились в нормальных лабораторных условиях: температура окружающего воздуха (20±5)°С, атмосферное давление (84-106) кПа, относительная влажность (80± ±5)%, частота переменного тока (50±1) Гц, напряжение в электрической сети (220±10) В.
Полученные данные были обработаны с использованием методов математической статистики с помощью компьютерной программы Statistica 6.0. Оценка достоверности различий изучаемых показателей проводилась с исполь-
зованием парного Г-критерия Стьюдента при уровне значимости р < 0.05. Каждый вариант эксперимента ставился как минимум в тридцати повторностях. В табл. 1-5 представлены средние арифметические значения и их среднеквадратичные отклонения.
Результаты и их обсуждение
Представляло интерес оценить воздействие ультразвука на пропагулы микроскопических грибов. С этой целью приготовлялись суспензии зародышевых структур грибов АЫетапа alternata и Репісіїїіит chrysogenum, затем на них воздействовали ультразвуком в течение 1 , 5 и 10 мин. Далее проводился количественный учет микроорганизмов. Результаты представлены в табл. 1.
Воздействие УЗ в течение 1 минуты не приводит к значительной гибели пропагул А. alter-nata и Р. chrysogenum. При воздействии УЗ в течение 5 минут гибнет около 50% пропагул тест-культур, а в течение 10 минут наблюдается возрастание ингибирующего эффекта до 100%. Таким образом, в фунгицидном действии УЗ прослеживается зависимость доза - эффект.
Затем расширили выборку до 5 культур мик-ромицетов. Воздействие УЗ проводили в течение 5 и 10 минут. Результаты представлены в табл. 2 и 3.
По полученным данным можно судить о фунгицидной активности ультразвука. Наблюдается ингибирование титра КОЕ от 39% у Р. moniliforme до 53% у А. alternata при воздействии УЗ в течение 5 мин., и от 83% до 100% при воздействии УЗ в течение 10 мин. Таким образом, ультразвук оказывает самый высокий биоцидный эффект при воздействии в течение 10 мин.
В дальнейшем представляло интерес оценить воздействие УЗ непосредственно на мицелий микромицетов. Результаты эксперимента представлены в табл. 4.
Как видно из таблицы, ни у одного из опытных образцов мицелия тест-культур грибов не наблюдалось роста с 3 по 14 сутки. Таким обра-
Таблица 1
Изменение титра зародышевых структур микромицетов при различном времени воздействия УЗ
с частотой 2.5 МГц
Вид гриба КОЕ/мл
контроль 1 мин ДГ, % 5 мин ДТ, % 10 мин ДТ, %
Alternaria alternata 59±15 57±8 3 28±10 53 0±0 100
Penicillium chrysogenum 119±3 107±11 10 60±12 50 15±7 87
Таблица 2
Изменение титра зародышевых структур микромицетов при воздействии УЗ в течение 5 мин с частотой 2.5 МГц
Вид гриба КОЕ/мл
контроль опыт ДТ, %
Alternaria alternata 59±15 28±10 53
Aspergillus niger 109±З 54±4 50
Chaetomium globosum 41±2 2З±2 44
Fusarium moniliforme 111±16 68±З 39
Penicillium chrysogenum 119±З 60±12 50
Ассоциативная культура 119±З 64±4 46
Таблица 3
Изменение титра зародышевых структур микромицетов при воздействии УЗ в течение 10 мин с частотой 2.5 МГц
Вид гриба КОЕ/мл
контроль опыт ДТ, %
Alternaria alternata 59±15 0±0 100
Aspergillus niger 101±4 0±0 100
Chaetomium globosum 11±7 0±0 100
Fusarium moniliforme 99±12 17±11 83
Penicillium chrysogenum 119±З 15±7 87
Ассоциативная культура 119±З 16±5 87
Таблица 4
Рост мицелия микромицетов при воздействии УЗ с частотой 2.5 МГц в течение 10 минут
Вид гриба Время, сутки Диаметр колоний, мм
контроль опыт
Alternaria alternata 3 40.З±1.5 9.0±1.7
5 64.0±З.6 9.0±1.7
7 76.0±10.0 9.0±1.7
10 84.0±4.2 9.0±1.7
14 85.5±2.1 9.0±1.7
Aspergillus niger 3 53.7±3.5 7.7±0.6
5 90.0±0.0 7.7±0.6
7 90.0±0.0 7.7±0.6
10 90.0±0.0 7.7±0.6
14 90.0±0.0 7.7±0.6
Penicillium chrysogenum 3 26.3±2.3 7.З±0.6
5 40.7±2.9 7.З±0.6
7 65.0±18.4 7.З±0.6
10 71 .З±12.1 7.З±0.6
14 80.7±6.7 7.З±0.6
зом, можно с уверенностью утверждать, что воздействие УЗ в течение 10 минут способно полностью ингибировать жизнедеятельность мицелия.
В дальнейшем представляло интерес оценить эффективность действия УЗ на так называемые «дикие» штаммы микромицетов, наиболее часто выделяемые из различных помещений. С этой целью нами были выделены из воздуха в чистую культуру штаммы грибов. Были выделены, иден-
тифицированы и депонированы в коллекцию HHFY следующие штаммы микромицетов: Aspergillus fumigatus ИУ-7, Fusarium moniliforme HУ-10, Penicillium terrestre ІЇУ-8, P. citrinum ІЇУ-
2, Paecilomyces variotii ИУ-7. Далее была проведена оценка фунгицидного действия УЗ на данные штаммы микромицетов. Результаты эксперимента представлены в табл. 5.
Как видно из данной таблицы, пропагулы «диких» штаммов микромицетов весьма эффек-
тивно разрушаются ультразвуком при десятиминутном воздействии, так же как и у стандартных культур.
В дальнейшем представляло интерес оценить изменение активности экзокаталазы и эк-зопероксидазы Alternaria alternata и Aspergillus niger на 3, 5 и 10 сутки после однократного воздействия ультразвука (время 5 мин, частота колебаний 2.5 МГц) на зародышевые структуры данных видов. Выбор энзимов был обоснован тем, что каталаза и пероксидаза, с одной стороны, являются дыхательными ферментами, с другой - это экзоферменты, которые участвуют в первичном окислении субстратов.
Результаты эксперимента представлены в виде диаграмм (рис. 1-4).
Анализ полученных данных показывает, что при воздействии ультразвука на пропагулы Al-ternaria alternata отмечается достоверное увеличение активности экзопероксидазы с 5 по 10 сутки. Активность экзокаталазы значительно снижается на 3 и 10 сутки.
При воздействии ультразвука на пропагулы Aspergillus niger отмечается достоверное снижение активности экзопероксидазы и экзоката-
лазы на З сутки, а на 5 и 10 сутки наблюдается достоверное увеличение активности данных ферментов.
Полученные нами результаты позволяют утверждать, что воздействие УЗ на зародышевые структуры микромицетов может влиять на физиолого-биохимическую активность мицелия, развивающегося из подвергнутых воздействию данного фактора зародышевых структур.
Также для нас представляло интерес изучить изменение активности экзопероксидазы и эк-зокаталазы мицелия гриба A. niger после однократного воздействия ультразвука (время 5 мин, частота колебаний 2.5 МГц). Для этого гриб культивировали в жидкой среде Чапека-Докса в течение 7 суток, затем пеллеты мицелия отфильтровывали, подвергали воздействию УЗ, после чего пеллеты помещали в жидкую среду Чапека-Докса и культивировали в течение 10 дней, на З, 5 и 10 сутки культивирования проводили определение экзооксидоредуктаз в культуральной жидкости. Результаты данного эксперимента представлены на рис. 5 и 6.
При воздействии ультразвука на мицелий Aspergillus niger достоверного изменения
Таблица 5
Изменение титра зародышевых структур «диких» штаммов микромицетов при воздействии УЗ с частотой 2.5 МГц в течение 10 мин
Вид гриба КОЕ/мл
контроль опыт ДТ, %
Aspergillus fumigatus НУ-8 73±10 15±3 79
Fusarium moniliforme НУ-10 26±9 0±0 100
Penicillium terrestre НУ-9 76±12 0±0 100
P. citrinum НУ-2 63±12 8±2 87
Paecilomyces variotii НУ-7 83±12 1±1 99
Рис. 1. Динамика активности экзопероксидазы A. altemata при воздействии на пропагулы УЗ с частотой 2.5 МГц в течение 5 мин
Рис. 2. Динамика активности экзокаталазы A. altemata при воздействии на пропагулы УЗ с частотой 2.5 МГц в течение 5 мин
Рис. 3. Динамика активности экзопероксидазы A. niger при воздействии на пропагулы УЗ с частотой 2. 5 МГц в течение 5 мин
Рис. 4. Динамика активности экзокаталазы A. niger при воздействии на пропагулы УЗ с частотой 2.5 МГц в течение 5 мин
Рис. 5. Динамика активности экзопероксидазы A. niger при воздействии УЗ с частотой 2.5 МГц в течение 5 мин на мицелий
Рис. 6. Динамика активности экзокаталазы A. niger при воздействии УЗ с частотой 2.5 МГц в течение 5 мин на мицелий.
активности экзопероксидазы и экзокаталазы на 3 и 5 сутки не наблюдается. На 10 сутки в опыте отмечается достоверное увеличение активности экзопероксидазы и снижение экзокаталазной активности.
Сравнение результатов изменения экзоок-сидоредуктазной активности при воздействии УЗ на пропагулы и мицелий микромицетов показывает, что активность экзопероксидаз и экзокаталаз у мицелия и пропагул меняется по-разному. Это позволяет нам высказать предположение, что механизмы устойчивости и адаптации к действию УЗ у пропагул и у
мицелия микромицетов отличаются друг от друга. Воздействие УЗ на пропагулы стимулирует активность экзоредуктаз на ранних этапах развития мицелия, тогда как при действии на мицелий наблюдается прямо противоположный эффект.
Выводы
1. Воздействие ультразвука с частотой
2.5 МГц в течение 10 минут инактивирует большое количество пропагул микромицетов, от 83 до 100%.
2. Воздействие ультразвука с частотой
2.5 МГц в течение 10 мин полностью ингибирует рост вегетативного мицелия тест-культур микромицетов.
3. В биоцидном действии ультразвука с частотой 2.5 МГц прослеживается зависимость доза - эффект линейного характера.
4. Воздействие ультразвука с частотой
2.5 МГц в течение 5 мин существенно снижает активность экзокаталазы Alternaria alternata с З по 10 сутки и активность экзопероксидазы, эк-зокаталазы Aspergillus niger на З сутки, что, безусловно, будет препятствовать данным культурам осваивать и колонизировать субстрат, понизит их инвазивный потенциал и позволит успешно противостоять экологической экспансии патогенных микромицетов в местах работы и проживания человека, что будет особенно актуальным в условиях современного мегаполиса.
Список литературы
1. Марфенина О.Е. Антропогенная экология почвенных грибов. М.: Медицина для всех, 2005. 196 с.
2. Лившиц Д.М. Практические вопросы дезинфекции и стерилизации // ФАРМиндекс-Практик. 2005. № 7. C. 46-50.
3. Сухаревич В.И., Кузикова И.Л., Медведева Н.Г. Защита от биоповреждений, вызываемых грибами. СПб.: ЭЛБИ-СПБ, 2009. 206 с.
4. Эльпинер И.Е. Ультразвук. Физико-химичес-кое и биологическое действие. М.: Физматгиз, 1963. 322 с.
5. Haussmann K.K. // Z. Hyd. und Infectionsk-rank. 1952. V. 134. P. 565.
6. Эльпинер И.Е. Экспериментальные исследования по обеззараживанию воды ультразвуком. Дис. ... канд. техн. наук. М.: Институт водных проблем РАН, 1959. 163 с.
7. Левковский Ю.Л., Чалов А.В. Влияние турбулентности потока на возникновение и развитие кавитации // Ак. журнал. 1978. Т. 24. Вып. 2. С. 221-227.
8. Aurand L.W., Roberts W.M., Cardwell J.T. A method for the estimation of peroxidase activity in milk // J. Dairy Science. 1956. V. 39. №. 5. P. 568-573.
9. Patterson B.D., Payne L.A., Chen Yi-Zhu et al. An inhibitor of catalase induced by cold in chilling-sensitive plants // P. Physiol. 1984. V. 76. № 4. P. 1014-1018.
10. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L. et al. Protein measurement with Folin phenol reagent // J. Biol. Chem. 1951. V. 193. № 1. P. 265-275.
PHYSIOLOGICAL AND BIOCHEMICAL ASPECTS OF THE ACTION OF ULTRASOUND ON OPPORTUNISTIC MICROSCOPIC FUNGI
D.V. Kryazhev, A.A. Ichyotkina, V.F. Smirnov
The effect of ultrasound on spores and mycelium of microscopic fungi was studied. It is shown that the action of ultrasound on germinal structures of the fungi studied can cause their death. The dose-dependent effect is demonstrated and optimum temporal characteristics of antifungal action of ultrasound are established.
Keywords: ultrasound, disinfection, microscopic fungi.
