CC BY
52
© М. С. Юхта, Н. О. Волкова, О. І. Гончарук
УДК 616. 721. 1+616-035. 1
М. С. Юхта, Н. О. Волкова, О. І. Гончарук
ЕФЕКТИВНІСТЬ ЗАСТОСУВАННЯ КРіОКОНСЕРВОВАНИХ
МУЛЬТИПОТЕНТНИХ МЕЗЕНХІМАЛЬНИХ СТРОМАЛЬНИХ КЛІТИН
КІСТКОВОГО МОЗКУ ПРИ УШКОДЖЕННЯХ МІЖХРЕБЦЕВИХ ДИСКІВ
В ЗАЛЕЖНОСТІ ВІД СПОСОБУ ЇХ ВВЕДЕННЯ
Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України (м. Харків)
Робота виконана в рамках НДР «Розроблення та впровадження тканиновідновлювальної технології лікування ушкоджень хрящів», № держ. реєстрації 0109U007758.
Вступ. Одним з перспективних шляхів лікування дегенеративно-дистрофічних уражень між-хребцевих дисків (МХД) може стати залучення до медичної практики сучасних досягнень клітинної терапії, а саме застосування мультипотентних ме-зенхімальних стромальних клітин (МСК). Експериментально показано, що ін’єкційне введення МСК зупиняє прогресування дегенеративних змін та сприяє підвищенню синтезу протеогліканів МХД [6]. Подібні результати були отримані і F. Yang et al. [6]. G. Crevensten та ін. [3] відмічають тенденцію до збільшення висоти дегенеративно змінених МХД після введення МСК. Цінною властивістю МСК є висока кріорезистентність, що дозволяє їх використання у будь-який потрібний для лікування момент і забезпечує високу якість кріоконсервованого клітинного препарату.
Але треба відмітити, що в літературі виключно мало робіт по дослідженню впливу способу введення МСК на процеси регенерації дегенеративно змінених МХД. Більшість дослідників використовує ін’єкційне введення МСК. Проте метод введення клітин може стати ключовим фактором у підвищенні ефективності терапії МСК, тому дослідження цього питання є актуальним.
Метою роботи було визначення оптимального способу локального введення суспензії кріоконсер-вованих МСК (КрМСК) кісткового мозку у дегенеративно змінені МХД.
Об’єкт і методи дослідження. МСК виділяли із резеційованих фрагментів стегнових кісток щурів (n=7, масою 100-150 г) шляхом вимивання за допомогою розчину Хенксу з наступним пропусканням крізь голки діаметром, що зменшувався. Суспензію центрифугували при 1500 об/хв (834 g) протягом 5 хв. Осад ресуспендували та висівали на культураль-ні флакони (РАА, Австрія) зі щільністю 103 клітин/ см2. Культивування проводили у стандартних умовах (37С, 5% СО2) з використанням інкубатора Sanyo (Японія) за методом адгезії стромальної фракції до
культурального пластику з наступним видаленням фракції неадгезивних клітин. Живильне середовище культивування, що містило середовище IMDM (Sigma, США), 10% ембріональну сироватку (ЕС) великої рогатої худоби (HyClone, США), гентаміцин (150 мкг/мл) (Фармак, Україна) та амфотеріцин Б (10 мкг/мл) (Sigma, США), змінювали кожні 3 доби.
Для кріоконсервування культури МСК використовували 2-х етапну програму (1°С/мін до -80С з наступним зануренням у рідкий азот) під захистом 10% ДМСО з додавання 20% ЕС на середовищі культивування. Зразки зберігали в умовах низькотемпературного банку. Відігрівали на водяній бані (37°С) з наступним видаленням кріопротектора шляхом центрифугування.
Експериментальне дослідження проведене на 21 щурі масою 350 ± 50 г. Всім тваринам спочатку моделювали компресійне дегенеративно-дистрофічне пошкодження МХД [2]. На 60 добу дію компресії припиняли та під кетаміновим наркозом робили серединний розтин шкіри хвоста з дорсальної сторони безпосередньо над МХД Сс , забезпечували гемостаз та тупим шляхом здійснювали скелетування дорсальної поверхні цього диску. Подальші маніпуляції різнились в залежності від групи експериментальних тварин. Тваринам I групи (n=7) проводили лише скелетування (контрольна група). Тваринам II групи (n=7) суспензію КрМСК вводили неін’єкційним способом на колагеновій губці, для чого формували ложе необхідного розміру, в яке поміщали колагенову губку (Ankerpharm, Німеччина), а на неї наносили 0,1 мл клітинної суспензії. Тваринам III групи (n=7) суспензію КрМСК вводили ін’єкційним способом: інсуліновим шприцом 29G (BD Micro-Fine Plus, США) робили прокол МХД Ссу|_у||, не пошкоджуючи кісткову тканину тіл хребців, і вводили 0,1 мл клітинної суспензії. Шкіру хвоста зашивали вузловими швами, контролювали гемостаз і повторно дезінфікували. З експерименту тварин виводили на 30 добу після введення КрМСК. Оцінку ефективності способу введення проводили за допомогою гістологічних методів дослідження, для чого брали частину хребта на рівні Сс|ух. Виготовлення целоїдинових зрізів та їх фарбування гематоксиліном та еозином і пікрофуксином
Рис.1. Дорсальна частина ФК МХД CcV|-V|| щураконтр-ольної групи (30 доба). Тріщини і щілини колагенових волокон,гіпо-табезклітинніділянки ФК. Мікрофото.
Забарвлення гематоксиліном і еозином, 4120.
по Ван-Гізону проводили згідно з методикою [1]. Зрізи досліджували на світловому мікроскопі Carl Zeiss з цифровою фотокамерою Cannon EOS 30D.
Усі маніпуляції з тваринами здійснювали відповідно до вимог біоетики та міжнародних принципів Європейської конвенції про захист хребетних тварин, які використовуються для експериментальних та інших наукових цілей, а також «Загальними прин-ципамиекспериментівна тваринах», схваленими II Національним конгресом по біоетиці (2004 р., Київ).
Результати досліджень та їх обговорення. МХД тварин I, II (окрім Ссу|-у||) та III (окрім Ссу|-у||) груп (рис. 1 ),булипредставленіфібрознимкільцем(ФК) та вентрально зміщеним драглистим ядром, межа між якими була нечітка та переривчаста. ФК складалося з розволокнених та фрагментованих пластин колагенових волокон. З дорсального боку по центру ФК виявлялися тріщини та щілини. Щільність
Рис. 2. Дорсальна частина ФК МХД Ссу|лл| щура (30 доба післянеін’єкційноговведеннясуспензії КрМСК на колагеновій губці). Збереження ламелярної структури ФК, проліферація фіброхондроцитів. Мікрофо-то.Забарвленнягематоксиліноміеозином, 4200.
фіброхондроцитів (фібробластоподібних витягнутих клітин із щільними овоїдними ядрами) з цього боку була нерівномірна - більша по краям диска і менша у напрямку центра ФК, де навкруги тріщин і щілин визначалися ацелюлярні ділянки. Драглисте ядро було фрагментоване та містило велику кількість клітин з гіпохромними ядрами. Ознаки регенерації були представлені лише поодинокими інфільтратами із фібробластів, що локалізувались по краю МХД.
В МХД Ссу|-у|| тварин II групи (рис. 2), в які суспензія КрМСК була введена на колагеновій губці, на фоні вище описаних дегенеративних змін виявлялись ознаки регенерації у вигляді проліферації фіброхондроцитів. Ці клітини тяжами з великою щільністюроз ташовувалисьвпродовжтавсередині пучків волагеиовиушолоеон. Лише невеласіетрівну-но з контролем центральні ділянки, що межували з щівуоовсФК,валишапсеоШов клітоуоуіши.
В гістологічних препаратах тварин III групи, еоемнуевтазію К|вМСВ оовсолв іи’укціОвв м шао-хом, у місці введення (МХД Сс ) характерна для М>ВЦ муріфологічна структура була відсутня. На рис. 3 добре видно, що з одного боку ФК зберігало пластинчасту організацію, а з іншого боку було
Рис. 3. МХД Ссу|лл| щура(30добапісляінґєкційного введення суспензії КрМСК). Фіброзна тканина з осе-редкамихондроїдуу місціін’єкції,частковезбере-ження пластинчастої структури ФК з протилежного боку,руйнаціякістковихтрабекулапофізів хребців. Мікрофото. Забарвлення гематоксиліном і еозином,4100.
представленефіброзною тканиною та осередками хондроїду з високою щільністю клітин. Деструктивні зміни розповсюджувалися і на суміжні хребці. Апофізи хребців були частково зруйновані, їх між-трабекулярні простори були заповнені фіброретику-лярноютканиною.Останнярозповсюджуваласяна наростковіхрящові пластинки,грубопорушуючиїх структуру.
Таким чином, ін’єкційне введення суспензії КрМСК у МХД щурів призводило до прогресування
дегенеративно-дистрофічних змін. Відбувалась деструкція ФК та драглистого ядра у місці введення з утворенням фіброзної тканини, осередків хондроїду та реактивними змінами зі сторони апофізів прилеглих хребців. Швидше за все, прогресування дегенеративно-дистрофічних змін було пов’язано з проколом МХД та примусовим нагнітанням у нього рідини. Відомо, що прокол ФК голкою безпосередньо може ініціювати дегенерацію диска, негативно впливаючи на механотрансдукцію у ньому [5]. Існують дослідження, результати яких вказують на залежність ступеню пошкоджень структур МХД, що розвиваються, від діаметру пункційної голки [7]. Хоча автори роботи [5] стверджують, що розмір отворів та щілин ФК не корелює з розміром голки та локалізацією проколу, при цьому у всіх випадках формуються глибокі пошкодження, що не піддаються самовідновленню у зв’язку з низькою метаболічною активністю фіброхондроцитів.
Неін’єкційне введення КрМСК на колагеновій губці забезпечувало значно кращі результати
порівняно з інґєкційним способом. На фоні дегенеративних змін з’являлись виражені ознаки регенерації, які характеризувалися збільшенням клітин-ності та частковим відновленням тріщин і щілин ФК. Ефективність застосування КрМСК на колагеновій губці також підтверджувалося при порівнянні з гістологічною картиною МХД Ссу|-у|| контрольних тварин, де дегенеративні ознаки були більш виражені.
Висновки. Застосування у якості носія для КрМСК колагенової губки, яка розміщується безпосередньо на ушкоджений МХД, є оптимальним способом введення для терапії ушкоджених МХД.
Перспективою подальших досліджень є вивчення динаміки відновлювальних процесів в дегенеративно зміненому МХД після локального введення КрМСК на колагеновій губці.
Автори висловлюють подяку і зберігають пам’ять про ініціатора і натхненника цієї роботи академіка НАН України Грищенко В. І.
Література
1. Волкова О. В. Основы гистологии с гистологической техникой / Волкова О. В., Елецкий Ю. К. - М. : Медицина, 1982. -304 с., ил.
2. Патент № 73383 Україна МПК (51) G09B23/28 (2006. 01). З-но: 20. 02. 2012 Опубл. : 25. 09. 2012 Бюл. №18, 2012 р. Спосіб моделювання дегенеративно-дистрофічного пошкодження міжхребцевого диску. Гончарук О. І., Волкова Н. О., Юхта М. С.
3. Crevensten G. Intervertebral disc cell therapy for regeneration: mesenchymal stem cell implantation in rat intervertebral discs / G. Crevensten, A. J. L. Walsh, D. Ananthakrishnan [et al.] // Annals of Biomedical Engineering. - 2004. - Vol. 32 (3) -Р. 430-434.
4. Elliott D. M. The effect of relative needle diameter in puncture and sham injection animal models of degeneration / D. M. Elliott, C. S. Yerramalli, J. C. Beckstein // Spine. - 2008. - Vol. 33 (6). - P. 588-596.
5. Michalek A. J. The effects of needle puncture injury on microscale shear strain in the intervertebral disc annulus fibrosus / A. J. Michalek, M. R. Buckley, L. J. Bonassar [et al.] // The Spine Journal. - 2010. - Vol. 10. - P. 1098-1105.
6. Sakai D. Transplantation of mesenchymal stem cells embedded in Atelocollagens gel to the intervertebral disc:a potential therapeutic model for disc degeneration / D. Sakai, J. Mochida, Y Yamamoto [et al.] // Biomaterials. - 2003. - 24. - Р. 35313541.
7. Yang F. Mesenchymal Stem Cells Arrest Intervertebral Disc Degeneration Through Chondrocytic Differentiation and Stimulation of Endogenous Cells / F. Yang, V. Y L. Leung, K. D. K. Luk [et al.] // Molecular Therapy. - 2009. - Vol. 17. - P. 1959-1966.
УДК 616. 721. 1+616-035. 1
ЕФЕКТИВНІСТЬ ЗАСТОСУВАННЯ КРІОКОНСЕРВОВАНИХ МУЛЬТИПОТЕНТНИХ МЕЗЕНХІМАЛЬНИХ СТРОМАЛЬНИХ КЛІТИН КІСТКОВОГО МОЗКУ ПРИ УШКОДЖЕННЯХ МІЖХРЕБЦЕВИХ ДИСКІВ В ЗАЛЕЖНОСТІ ВІД СПОСОБУ ЇХ ВВЕДЕННЯ
Юхта М. С., Волкова Н. О., Гончарук О. І.
Резюме. Метою дослідження було визначення оптимального способу локального введення кріоконсер-вованої суспензії мультипотентних мезенхімальних стромальних клітин (КрМСК) в дегенеративно змінений міжхребцевий диск (МХД). На компресійної моделі дегенеративно-дистрофічного пошкодження МХД Ссу|-у|| ми порівняли ефективність ін’єкційного та неін’єкційних (на колагеновій губці) способів введення КрМСК. У тварин, яким КрМСК були введені на колагеновій губці, визначалася регенерація тріщин і щілин фіброзного кільця (ФК), проліферація фіброхондроцитів. У гістологічних препаратах тварин з ін’єкційним введенням КрМСК ФК регенерувало з утворенням фіброзної тканини і вогнищ хондроїду.
Ключові слова: міжхребцевий диск, дегенеративно-дистрофічне ушкодження, клітинна терапія, муль-типотентні мезенхімальні стромальні клітини, спосіб введення.
удк 616. 721. 1. 089
ЭФФЕКТИВНОСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ КРИОКОНСЕРВИРОВАННЫХ МУЛЬТИПОТЕНТНЫХ МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ СТРОМАЛЬНЫХ КЛЕТОК КОСТНОГО МОЗГА ПРИ ПОВРЕЖДЕНИЯХ МЕЖПОЗВОНКОВЫХ ДИСКОВ В ЗАВИСИМОСТИ ОТ СПОСОБА ИХ ВВЕДЕНИЯ
Юхта М. С., Волкова Н. А., Гончарук Е. И.
Резюме. Целью исследования было определение оптимального способа локального введения криокон-сервированной суспензии мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (КрМСК) в дегенеративно измененный межпозвонковый диск (МПД). На компрессионной модели дегенеративно-дистрофического повреждения МПД Ссу|-у|| мы сравнили эффективность инъекционного и неинъекционного (на коллагеновой губке) способов введения КрМСК. У животных, которым КрМСК были введены на коллагеновой губке, определялась регенерация трещин и щелей фиброзного кольца (ФК), пролиферация фиброхондроцитов. В гистологических препаратах животных с инъекционным введением КрМСК ФК регенерировало с образованием фиброзной ткани и очагов хондроида.
Ключевые слова: межпозвонковый диск, дегенеративно-дистрофическое повреждение, клеточная терапия, мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки, способ введения.
UDC 616. 721. 1. 089
Efficiency of Cryopreserved Marrow-Derived Multipotent Mesenchymal Stromal Cell Application at Damaged Intervertebral Discs According to the Route of Administration
lukhta M. S., Volkova N. A., Goncharuk E. I.
Summary. The aim of the study was to determine the optimal way of local administration of cryopreserved multipotent mesenchymal stromal cell (CMSC) suspension in the degenerated intervertebral disc (IVD). On compressive IVD degeneration model we compared efficiency of injectible and non- injectible (on a collagen sponge) ways of CMSC administration. A renewal of fibrous ring (FR) cracks and clefs, fibrochondrocyte proliferation were determined in animals with CMSC administration on a collagen sponge. In histological preparations of animals with MSC intradiscal injection FR regenerated by fibrous tissue and chondroid focus formation.
Key words: intervertebral disc, degenerative damage, cell therapy, multipotent mesenchymal stromal cells, route of administration.
Стаття надійшла 11. 03. 2013 р.
Рецензент - проф. Шепітько В. I.
