CC BY
55
© M. C. Юхта, H. О. Волкова, О. I. Гончарук УДK 616. 721. 1
М. С. Юхта, Н. О. Волкова, О. I. Гончарук
ДOЗOЗAЛEЖHИЙ TEPAПEBTИЧHИЙ EФEKT KPIOKOHCEPBOBAMX MУЛЬTИПOTEHTHИX MEЗEHXIMAЛЬHИX CTPOMAЛЬHИX KЛITИH KICTKOBOrO MOЗKУ ПPИ ДEГEHEPATИBHИX ЗMIHAX MIЖXPEБЦEBИX ДИCKIB Iнcтитyт пpoблeм кpioбioлoгГГ i кpioмeдицини HAH Укpaїни (м. XapKiB)
Робота виконана в рамках НДР «Розроблення та впровадження тканиновідновлювальної технології лікування ушкоджень хрящів», № держ. реєстрації 010911007758.
Вступ. Дегенеративно-дистрофічні захворювання хребта залишаються не тільки актуальною медичною, а й соціально-економічною проблемою будь-якої к раїни світу. Болі у спині, обумовлені цією патологією, займають питому вагу серед причин звертань в амбулаторній практиці [4]. Лікування таких хворих трудомісткий та довготривалий процес, який в 50 % випадків закінчується рецидивом на протязі першого року після закінчення курсу консервативної терапії [5]. Одним з перспективних шляхів лікування дегенеративно-дистрофічних змін міжхребцевих дисків (МХД) може стати залучення до медичної практики сучасних досягнень клітинної біології, а саме застосування кріоконсервованих алогенних мультипотентних мезенхімальних стро-мальних клітин (КрМСК). їх перевагами є:
- можливість отримувати МСК від молодих здорових донорів у достатній кількості з високими показниками здатності до проліферації та спрямованого диференціювання, що дозволяє не травмувати пацієнта;
- можливість проведення ретельного мікробіологічного контролю;
- застосування існуючих протоколів кріоконсер-вування МСК дозволяє їх використання у будь-який потрібний для лікування момент і забезпечує високу якість кріоконсервованого клітинного препарату.
Відомо, що МСК, як і більшості клітинних препаратів, властивий дозозалежний ефект, тому доза трансплантованих клітин може бути вирішальним фактором їх терапевтичної ефективності [7]. В літературі існує відносно невелика кількість робіт, цілеспрямованих на дослідження терапевтичного ефекту КрМСК в залежності від дози трансплантованих клітин. Тому експериментальне визначення ефективної дози КрМСК для оптимальної корекції патологічних станів, в тому числі дегенеративно-дистрофічних порушень МХД, на сьогодні є актуальною проблемою.
Метою роботи було визначення оптимальної дози КрМСК для корекції дегенеративно-дистрофічних порушень МХД в експерименті.
Об’єкт і методи дослідження. Усі маніпуляції з тваринами здійснювали відповідно до вимог біоети-ки та міжнародних принципів Європейської конвенції про захист хребетних тварин, які використовуються для експериментальних та інших наукових цілей, а також «Загальними принципами експериментів на тваринах», схваленими II Національним конгресом по біоетиці (2004 р., Україна).
МСК виділяли із резеційованих фрагментів стегнових кісток щурів (n=7, масою 100-150 г) шляхом вимивання за допомогою розчину Хенксу з наступним пропусканням крізь голки діаметром, що зменшувався. Суспензію центрифугували при 1500 об/ хв (834 g) протягом 5 хв. Осад ресуспендували та висівали на культуральні флакони (РАД, Австрія) зі щільністю 103 клітин/см2. Культивування проводили у стандартних умовах (370С, 5 % СО2) з використанням інкубатора Sanyo (Японія) за методом адгезії стромальної фракції до культурального пластику з наступним видаленням неадгезивних клітин. Живильне середовище культивування, що містило середовище IMDM (Sigma, США), 10 % ембріональну сироватку (ЕС) великої рогатої худоби (HyClone, США), гентаміцин (150 мкг/мл) (Фармак, Україна) та амфотеріцин Б (10 мкг/мл) (Sigma, США), змінювали кожні 3 доби.
Для кріоконсервування культури МСК використовували 2-х етапну програму (10С/мін до -800С з наступним зануренням у рідкий азот) під захистом 10 % ДМСО з додавання 20 % ЕС на середовищі культивування. Зразки зберігали в умовах низькотемпературного банку не менш ніж 3 міс. Відігрівали на водяній бані (400С) з наступним видаленням кріо-протектора шляхом центрифугування.
Експериментальне дослідження проведене на 28 щурах масою 350±50 г. Всім тваринам спочатку моделювали компресійне дегенеративно-дистрофічне пошкодження МХД [2]. На 60 добу дію компресії припиняли та під кетаміновим наркозом робили серединний розтин шкіри хвоста з дорсальної сторони безпосередньо над МХД Ссу|_у||, забезпечували гемостаз та тупим шляхом здійснювали скелетування дорсальної поверхні цього диску. Подальші маніпуляції різнились в залежності від групи експериментальних тварин. Тваринам I групи (n=7), які слугували контролем, проводили лише скелетування.
Pиc. 1. Дopcaльнa чacтинa ФK MXA CcV|-V|| щypa (30 дoбa дocлiджeння): Miкpoфoтo, зaбapвлeння гeмaтoкcилi-hon i eoзинoм, Зб. Ч 120. A-кoнтpoльнa гpyпa. Б- ввєдєння cycne^n KpMCK в дoзi 0,25 Ч 106.
B - ввєдєння cycпeнзГЇ KpMCK в дoзi 0,5 Ч 106. Г - ввєдєння cycпeнзГЇ KpMCK в дoзi 1,0 Ч 106 (cтpiлкoю вкaзaнo ocepeдoк xo^po'^y, щo мєжує з MXA CcV|-V||).
Тваринам II групи (n=7) формували ложе необхідного розміру, в яке поміщали колагенову губку (Ankerpharm, Німеччина) розміром 0,8Ч0,8Ч0,5 см, а на неї наносили 0,25 Ч 10б ^MCK в 0,1 мл розчину Xeнкса (РАД, Австрія) (0,7Ч10б клітин/кг маси тіла тварини). Тваринам III групи (n=7) за тих же умов вводили 0,5 Ч 10б ^MCK (1,4Ч10б клітин/кг маси тіла тварини), а тваринам IV групи (n=7) - 1,0 Ч 10б ^MCK (2,8Ч10б клітин/кг маси тіла тварини). Витримавши 1-2 хвилини, рану ушивали вузловими швами і дезінфікували. З експерименту тварин виводили на
30 добу після терапії.
Оцінку змін, що відбувалися, проводили за допомогою гістологічних методів дослідження, для чого брали частину хребта на рівні C^^. Виготовлення целоїдинових зрізів та їх фарбування гематоксиліном та еозином, пікрофуксином по Ван-Гізону і толуїдиновим синім проводили згідно з методикою [1]. Зрізи досліджували на світловому мікроскопі Carl Zeiss з цифровою фотокамерою Cannon EOS 30D.
Peзyльтaти дocлiджeнь тэ їх oбгoвopeння.
Гістологічна картина контрольної групи тварин характеризувалася характерною для MXД морфологією з ознаками дегенеративно-дистрофічного
пошкодження (рис. 1А). Фіброзне кільце (ФК) мало ламелярну організацію зі звивистим ходом волокон, які були розволокнені і подекуди фрагментовані. У ФК визначалися розшарування пластин колагенових волокон, центральні тріщини та щілини, щільність фіброхондроцитів була зниженою, з дорсальної сторони визначалися ділянки повної відсутності клітин. Фіброхондроцити розташовувалися ланцюжками між пучками колагенових волокон і були оточені базофільним неволокнистим міжклітинним матриксом. Драглисте ядро (ДЯ) було деформоване і зміщено у вентральний бік МХД, щільність нотохор-дальніх клітин в ДЯ також була пониженою, а синцитій фрагментований.
В гістологічних препаратах тварин, яким в зону дефекту (Ссу|_у||) на колагеновій губці вводили 0,25 Ч 106 КрМСК, спостерігали лише незначний терапевтичний ефект. Хід колагенових волокон у внутрішніх відділах ФК з дорсальної сторони залишався порушеним, вони мали звивисту форму, були розво-локненні і подекуди фрагментовані. Серед них переважно в центрі ФК спостерігались досить великі щілини, навкруги яких колагенові волокна були різко оксифільні та не містили клітин. На решті ділянок ФК з дорсальної сторони МХД Ссу|_у|| відбувалося
збільшення клітинності (у першу чергу за рахунок зовнішніх відділів ФК та зон прилеглих до апофізів хребців) (рис. 1Б). З вентральної сторони ФК залишалися деструктивні тріщини, розволокнення колагенових волокон та гіпоклітинні ділянки. ДЯ було фрагментоване та містило велику кількість клітин з гіпохромними ядрами. По краям диску локалізувались інфільтрати із фібробластоподібних клітин. Структура решти досліджених дисків істотно не відрізнялася від МХД контрольних тварин.
При введенні КрМСК у дозі 0,5 Ч 106 терапевтичний ефект був більш вираженим порівняно з меншою дозою клітин (0,25 Ч 106 КрМСК). Визначалася позитивна динаміка відновлення структури МХД Ссу|-у|| (рис. 1В). ФК мало пластинчасту організацію з радіальним ходом пучків колагенових волокон, впродовж та всередині яких розташовувались фібробластоподібні витягнуті клітини із щільними овоїдними ядрами. Щільність клітин була високою, хоча центральні його ділянки з дорсальної сторони залишались безклітинними. В частині препаратів по центру ФК локалізувались деструктивні щілини. Відмічалось незначне розволокнення та фрагментація пучків колагенових волокон. ДЯ було фрагментоване та містило велику кількість клітин з гіпохромними ядрами. По краям диску локалізувались невеликі інфільтрати із фібробластоподібних клітин. Структура решти досліджених дисків істотно не відрізнялася від контролю з самовідновленням.
При введенні КрМСК в дозі 1,0 Ч 106 терапевтичний ефект мав найбільш виражений характер, але в 4 з 7 досліджених препаратів по краю МХД Ссу|-у|| спостерігалось формування осередків хондрої-ду різної величини, оточених фіброзною тканиною (рис. 1Г). Клітинний склад хондроїду був представлений крупними, яскраво забарвленими хрящовими
клітинами з центрально розташованими крупними овальними гіпохромними ядрами. При фарбуванні толуїдиновим синім центральні ділянки таких осередків набували метахроматичного забарвлення. В подібних дослідженнях по репарації пошкоджень сухожилків in vivo [3, 6] надлишкова доза МСК призводила до активізації хондро- та остеогенезу у місці трансплантації. Ймовірно, що отриманий у наших дослідженнях аналогічний ефект також пов’язаний
зі збільшенням кількості трансплантованих клітин.
Висновки. Таким чином, КрМСК кісткового мозку властивий дозозалежний терапевтичний ефект у разі їх локального введення (на колагеновій губці) у дегенеративно змінений МХД. В лінійці відпрацьованих доз найменш виражений результат спостерігався при застосуванні КрМСК у кількості 0,25 Ч 106 клітин. Застосування КрМСК у дозі 1,0 Ч 106 призводило до наявності майже у половині випадків побічних ефектів у вигляді формування осередків хондроїду у місці введення. Оптимально ефективною стала доза 0,5 Ч 106 КрМСК, застосування якої давало гарний терапевтичний результат та не викликало побічних ефектів. Перспективою подальших досліджень є вивчення динаміки відновлю-вальних процесів в дегенеративно зміненому МХД після локального введення КрМСК у дозі 0,5 Ч 106.
Перспективою подальших досліджень є вивчення динаміки відновлювальних процесів у дегенеративно зміненому МХД після локального введення КрМСК у дозі 0,5 Ч 106.
Автори висловлюють подяку і зберігають пам’ять про ініціатора і натхненника цієї роботи академіка НАН України Грищенко В. І.
Лiтepaтypa
1. Волкова О. В. Основы гистологии с гистологической техникой / О. В. Волкова, Ю. K. Елецкий. - M. : Meдицина, 1982. -304 с., ил.
2. Патент № 73383 Україна MI1K (51) G09B23/28 (200б. 01). З-но: 20. 02. 2012 Опубл. : 25. 09. 2012 Бюл. № 18, 2012 р. ^осіб моделювання дегенеративно-дистрофічного пошкодження міжхребцевого диску. Гончарук О. I., Волкова Н. О., Юхта M. C.
3. Awad H. A. Repair of patellar tendon injuries using a cell-collagen composite / H. A. Awad, G. P. Boivin, M. R. Dressler [et al.] // J. Orthop. Res. - 2003. - Vol. 21. - P. 420-431.
4. Bogduk N. Medical management of acute and chronic low back pain / N. Bogduk, B. McGuirk. - Amsterdam : Elsevier, 2002. - 224 p.
5. Hestbaek L. Low back pain: what is the long-term course? A review of studies of general patient populations / L. Hestbaek, C. Leboeuf-Yde, C Manniche. // European Spine Journal. - 2003. - Vol. 12(2). - P. 149-б5.
6. Juncosa-Melvin N. Effects of cell-to-collagen ratio in stem cell-seeded constructs on tendon repair biomechanics and histology / N. Juncosa-Melvin, G. P. Boivin, M. T. Galloway [et al.] // Tissue Eng. - 2005. - Vol. 11. - P. 448-457.
7. Sessarego N. Multipotent mesenchymal stromal cells from amniotic fluid: solid perspectives for clinical application / N. Sessarego, A. Parodi, M. Podestа [et al.] // Haematologica. - 2008. - Vol. 93(3). -P. 339-4б.
УДК 616. 721. 1
ДОЗОЗАЛЕЖНИЙ ТЕРАПЕВТИЧНИЙ ЕФЕКТ МУЛЬТИПОТЕНТНИХ МЕЗЕНХІМАЛЬНИХ СТРОМАЛЬ-НИХ КЛІТИН ПРИ ДЕГЕНЕРАТИВНИХ ЗМІНАХ МІЖХРЕБЦЕВИХ ДИСКІВ
Юхта М. С., Волкова Н. О., Гончарук О. І.
Резюме. За допомогою гістологічних методів дослідження показано, що кріоконсервованій алогенній культурі МСК кісткового мозку властивий дозозалежний терапевтичний ефект у разі їх локального введення у дегенеративно змінений міжхребцевий диск.
Ключові слова: міжхребцевий диск, дегенеративно-дистрофічне ушкодження, кріоконсервування, клітинна терапія, мультіпотентні мезенхімальні стромальні клітини.
УДK б1б. 721. 1
ДOЗOЗABИCИMЫЙ TEPAПEBTИЧECKИЙ ЭФФEKT KPИOKOHCEPBИPOBAHHЫX MУЛЬTИПOTEHT-НИЖ MEЗEHXИMAЛЬHЫX CTPOMAЛЬHЫX KЛETOK KOCTHOГO MOЗГA ПPИ ДEГEHEPATИBHЫX ИЗ-MEHEHИЯX MEЖПOЗBOHKOBЫX ДИCKOB
Юxтa M. C., Boлкoвa Н. A., Гoнчapyк E. И.
Peзюмe. C помощью гистологических методов исследования показано, что криоконсервированной ал-логенной культуре MCK костного мозга присущ дозозависимый терапевтический эффект при их локальном введении в дегенеративно измененный межпозвонковый диск.
^ючевы^ cлoвa: межпозвонковый диск, дегенеративно-дистрофическое повреждение, криоконсервирование, клеточная терапия, мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки.
UDC б1б. 721. 1. G89
Dose-Dependent Therapeutic Effect of Cryopreserved Bone Marrow-Derived Multipotent Mesenchymal Stromal Cells in Intervertebral Disc Degenerative Changes
Iukhta M. S., Volkova N. A., Goncharuk E. I.
Summary. The aim of the study was to determine the optimal dose of cryopreserved allogeneic multipotent mesenchymal stromal cells for correction of degenerative IVD damages in experiment.
Materials and methods. MSCs were isolated from femur fragments of rats (n = 7), weighing 1GG-15G g). The culturing was carried out under standard conditions (370C, 5 % CO2) by the adhesion method of stromal fraction to culture plastic with subsequent removal of nonadherent cells. For cryopreservation MSC culture was passaged under protection of 1G % DMSO (PAA) and 2G % FBS on the base of nutritive medium and cooled in cryovials with rate 1deg/min to-800C with following plunging in liquid nitrogen. Samples were stored in a low temperature bank for 3 months. They were thawed on water bath (400C) with following removal of cryoprotectant by centrifugation.
A compressive degenerative damage model of the IVD CcV|-V|| in rats (3GG-35G g) was used. Animals of the experimental groups (three groups of 7 animals) were treated with G. 25Ч10б, G. 5Ч10б or 1. 0Ч10б CrMSCs (G. 7Ч10б, G. 14Ч10б and G. 28Ч10б cells/kg corresponding) applied on collagen sponge (G. 8Ч0. 8Ч0. 5 cm) which was surgically implanted directly onto the damaged disk. Nontreated animals (n=7) served as a self-healing control. Evaluation of the MSC therapy efficiency was performed using histological methods on the 30th day after transplantation.
Results. To the 30th day after treatment degenerative changes were preserved in the IVD of the control group of animals. Annulus fibrosus (AF) had a serpentine reversed tour lamellas with ruptures. There were defined the central fissures and cracks, low density of fibrohondrocytes and areas of complete absence of cells on dorsal sides of AF.
Analysis of histological specimens of animals, which were treated with 0. 25Ч10б CrMSCs, showed only minor therapeutic effect. Collagen fibers in the inner parts of the posterior AF remained serpentine and sometimes were fragmented. Among them, generally in the center of the posterior AF, there were observed comparatively large cracks, around which the collagen fibers were deeply oxyphilic and did not contain cells. In other parts of the posterior AF there was an increasing of cellularity.
CrMSC administration in the dose of 0. 5 Ч 10б cells had more pronounced therapeutic effect compared with lower dose of cells (0. 25Ч10б CrMSCs). AF had a lamellar organization with radial collagen fiber bundles along and inside of which the fibroblast-like cells with dense ovoid nuclei were located. The density of cells was high, although the central area of the posterior AF remained acellular. There were observed slight garnetting and fragmentation of collagen fiber bundles.
Therapeutic effect after CrMSC administration in the dose of 1,0 Ч 10б was most pronounced, but in 4 of 7 studies there was observed a hondroid foci formation of various sizes, surrounded by fibrous tissue. Cellular structure of such foci was represented by large, brightly colored cartilage cells with large centrally located oval hypochromic nuclei. In toluidine blue staining their central area acquired metachromatic stain.
Conclusions. Thus obtained data showed a dose-dependent therapeutic effect of CrMSCs on regeneration of degenerated IVD. Among applying doses the less pronounced result was observed in case of using CrMSCs in the number of 0. 25Ч10б cells. Application of CrMSCs in the dose of 1. 0Ч10б cells lead to the hondroid foci formation at the administration area. Optimally effective dose was 0. 5 Ч 10б CrMSCs which gave good therapeutic result and not cause side effects.
Key words: intervertebral disk, degenerative damage, cryopreservation, cell therapy, multipotent mesenchymal stromal cells.
Рецензент - проф. Шепітько В. I.
Отэття нздшшлз 30. 04. 2013 p.
