CC BY
64
© А. С. Деген, О. М. Камишний
УДК 616. 379-008. 64-092. 9]:577. 214:616. 344-018. 98 А. С. Деген, О. М. Камишний
вплив ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО ЦУКРОВОГО ДІАБЕТУ НА ЕКСПРЕСІЮ ТРАНСКРИПЦІЙНИХ ФАКТОРІВ Т-Ьеі ТА йАТАЗ В ЛІМФОЇДНИХ
СТРУКТУРАХ КЛУБОВОЇ КИШКИ ЩУРІВ
Запорізький державний медичний університет (м. Запоріжжя)
Дана робота є фрагментом НДР «Роль порушень взаємовідносин лімфоїдного та епітеліального ком-партментів імунної системи слизових оболонок в розвитку експериментальної патології», державний реєстраційний номер 0112и005б42.
Вступ. Велика кількість досліджень пацієнтів з цукровим діабетом 1 типу (ЦД 1 типу) та тваринних моделей цієї патології показали тісний зв’язок розвитку ЦД 1 типу та змін у кишечнику, що передують прояву клінічних симптомів захворювання [20]. Функціональна поляризація розташованих в кишко-во-асоційованій лімфоїдній тканині (КАЛТ) субпопу-ляцій Т-хелперів (Th) відіграє важливу роль в індукції та розвитку ЦД 1 типу як у людини, так і у діабетичних тварин [19]. Основними регуляторами диференціювання Th1 и Th2-клітин є транскрипційні фактори T-bet та GATA-3 [8]. T-bet (T-box expressed in T cells), який кодується геном Tbx21 є одним з найбільш значущих гравців, що керують транскрипційним контролем імунної відповіді слизових оболонок [1б]. T-bet-дефіцитні миші резистентні до експериментальних моделей автоімунних захворювань, таких як діабет, енцефаломієліт, системна червона вовчанка та коліт, з іншого ж боку - підвищується чутливість до інфекційних захворювань, в тому числі до міко-бактеріозів, сальмонельозів, лейшманіозу, трипаносомозу та вірусних інфекцій [12]. В Th1-клітинах, T-bet здатен зв’язуватись з промоторами більше ніж 800 генів, включаючи гени цитокінів, цитокінових рецепторів, інших транскрипційних факторів та гени, що кодують протеїни необхідні для клітинного метаболізму та диференціювання. В свою чергу, GATA-3 є ключовим фактором диференціювання Th2-клітин [7]. При кондиційованому нокауті гена GATA3 послаблено утворення Th2-клітин in vivo та in vitro, знижена концентрація сироваткових Th2-залежних імуно-глобулінів (IgG4 та IgE) і підвищений рівень IgGl, який залежить від вмісту IFNy (тобто від Thl-клітин).
Зважаючи на таку значущість T-bet та GATA-3 в регулюванні балансу Th1/Th2 метою нашої роботи було вивчити особливості експресії цих транскрипційних факторів в КАЛТ при експериментальному стрептозотоциновому цукровому діабеті (ЕЦД) та після введення пентоксифілліну.
Об’єкт і методи дослідження. Дослідження проведені на 80 самцях щурів лінії Wistar. Тварини отримані з розплідника Об’єднання ветеринарної медицини ПП «Біомодельсервіс» (Київ). Експериментальну частину роботи виконували відповідно
до національних «Загальних етичних принципів досліджень на тваринах» (Україна, 2001) і положень «Європейської конвенції про захист хребетних тварин, яких використовують для експериментальних і інших наукових цілей» (Страсбург, 1985). Досліджувані тварини були розділені на 5 експериментальні групи: контрольні щури, яким одноразово внутрішньочеревно вводили 0,5 мл 0,1 М цитратного буферу (рН = 4,5) (група 1); щури з 14-денним ЕЦД (група 2); щури з 28-денним ЕЦД (група 3); щури з 14-ти денним (група 4) та з 28-ти денним ЕЦД (група 5), яким в/ш щоденно на протязі відповідно 2 та 4 тижнів вводили пентоксифіллін в дозі 9 мг/кг починаючи з 1 дня індукції діабету. Стрептозотоцин (STZ) (SIGMA Chemical, США) вводили щурам внутрішньочеревно в дозі 50 мг/кг, розчиненої в 0,5 мл 0,1 М цитратного буферу (рН 4,5) перед самим моментом введення. Час, що минув з дня введення препарату, в подальшому викладі матеріалу інтерпретувався як тривалість перебігу діабету. Визначення концентрації глюкози в крові, яку брали з хвостової вени, проводили глюкозооксидазним методом із застосуванням приладу «BIONIME Rightest™ GM 110» (Швейцарія) через 12 годин і на 1, 2, 3, 5, 7, 10, 14 і 28 добу після ін’єкції STZ. Вимірювання рівня глікемії здійснювали через б годин з моменту останнього прийому їжі. На З добу після введення стрептозотоцину для подальших досліджень відбирали тварин з рівнем глікемії натще > 8,0 ммоль/л.
Структуру популяції T-bet+ та GATA3+-клітин вивчали на підставі аналізу серійних гістологічних зрізів й даних їх морфометричних і денситометричних характеристик. Для проведення даного дослідження на ротаційному мікротомі MICROM HR-360 (Microm, Німеччина) робили 5-мікронні серійні зрізи клубової кишки, які потім депарафінували в ксилолі, проводили регідратацію в низхідних концентраціях етанолу (100 %, 96 %, 70 %), відмивали у 0,1 М фосфатному буфері (рН =7,4) і фарбували з первинними кролячими моноклональними антитілами (МКАТ) до транскрипційних факторів T-bet та GATA3 щура (Santa Cruz Biotechnology, США) протягом 18 годин у вологій камері при Т = 4оС. Після відмивання надлишку первинних антитіл в 0,1 М фосфатному буфері, зрізи інкубували 60 хвилин (Т = З7оС) з вторинними антитілами до повної молекули IgG кролика (Santa Cruz Biotechnology, США), кон’югованими з FITC. Після інкубації зрізи промивали 0,1 М фосфатним буфером і укладали в суміш гліцерину і фосфатного буфера
Рис. 1. Сумарна щільність T-bet+та СДТД3+-клітин у ВПСОВ (villus) та субепітеліальній зоні іЛВ (ILF Subep) при розвитку діабету (2 і 4 тижня) та введенні пентоксіфілліну (PTX) діабетичним тваринам.
(9:1) для подальшої люмінесцентної мікроскопії. Оброблені гістологічні зрізи вивчали з допомогою комп’ютерної програми ImageJ (NIH, США). Зображення, що отримується на мікроскопі PrimoStar (ZEISS, Німеччина) в ультрафіолетовому спектрі збудження 390 нм (FITC) за допомогою високочутливої камери AxioCam 5c (ZEISS, Німеччина) і пакета програм для отримання, архівування та підготовки зображень до публікації AxioVision 4. 7. 2 (ZEISS, Німеччина) негайно вводилося в комп’ютер. При цьому в автоматичному режимі визначалися області зі статистично значущою флюоресценцією, характерною для клітин, які експресують T-bet та GATA3. Обчислювалися морфометричні і денситометричні характеристики імунопозитивних клітин. При фарбуванні МКАТ досліджували T-bet+ та GATA3+-клітини. розташовані у власній пластинці слизової оболонки ворсинок (ВПСОВ) і в субепітеліальній зоні ізольованих лімфоїдних вузликів (іЛВ), які є, відповідно, ефекторними та індуктивними зонами імунної відповіді в КАЛТ
Всі отримані експериментальні дані обробляли на персональному комп’ютері пакетом прикладних і статистичних програм EXCEL з пакету MS Office 2010 (Microsoft Corp., США), STATISTICA 6. 0 (Stat-Soft,
2001). Для всіх показників розраховували значення середньої арифметичної вибірки (М), її дисперсії і помилки середньої (т). Для виявлення достовірності різниць результатів досліджень в дослідних і контрольних групах тварин визначали коефіцієнт Стьюдента (1), після чого визначали можливість різниці вибірок (р) і довірчий інтервал середньої. Критичний рівень значущості при перевірці статистичних гіпотез приймали рівним 0,05.
Результати досліджень та їх обговорення. Розвиток діабету супроводжувався збільшенням сумарної щільності Т-Ьеґ- позитивних клітин у ВПСОВ (на 72 %, р<0,05) на 14-й день розвитку патології зі збереженням динаміки на 28-й день, а в ІЛВ на 45 % (р<0,05) тільки на 28 день в порівнянні з контролем (рис. 1 А). Сумарна щільність ОДТД3+-позитивних клітин при розвитку діабету, навпаки, односпрямо-вано зменшувалася у ВПСОВ на 25-30 %о (р<0,05) і в ІЛВ на 21-44 % (р<0,05) в порівнянні з контролем за рахунок зниження кількості переважно ОДТД3+-лімфобластів та середніх лімфоцитів (рис. 1 В). Вимірювання інтенсивності флюоресценції Т-Ье1+- та ОДТД3+-клітин, що відображує концентрацію відповідних транскрипційних факторів, показало достовірне зростання даного параметру у ВПСОВ на
2-й та 4-й тиждень розвитку ЕЦД тільки у T-bet ^середніх лімфоцитів в порівнянні з контролем при відсутності змін концентрації GATA3.
Введення PTX діабетичним тваринам супроводжувалось зменшенням сумарної щільності популяції T-bet +-клітин у ВПСОВ як на 14-й, так і на 28-й день розвитку ЕЦД (на 30 % та 24 % відповідно, р<0,05), проте в субепітеліальній зоні ІЛВ цей показник значно зростав на 14 день розвитку ЕЦД (на 94 %, р<0,05), але вже на 28 день - достовірно знижувався (на 41 %, р<0,05) у порівнянні з групами діабетичних щурів (рис. 1 C). В той же час, сумарна щільність GATA3+-клітин на фоні введень PTX залишалася стабільною у ВПСОВ, а в ІЛВ також змінювалась різноспрямовано - збільшувалась на 14-й день розвитку патологічного процесу (на 31 %, р<0,05) і зменшувалась на 28 день (на 34 %, р<0,05) (рис. 1 D). Введення діабетичним тваринам PTX знайшло відображення у достовірному зниженні концентрації T-bet у T-bet +-середніх та T-bet +-малих лімфоцитів на 4-й тиждень розвитку ЕЦД при відсутності змін концентрації транскрипційного фактора GATA3 в імунопозитивних клітинах.
Отримані нами результати співпадають з даними багатьох інших досліджень. T-bet є одним з ключових регуляторів утворення Th 1 Ой4+-клітин, тому його роль в розвитку автоімунної патології вивчалась безпосередньо з моменту відкриття. Перші данні про зв’язок T-bet з розвитком ЦД були отримані у 2004 році Sasaki Y et al. [17]. В їх дослідженні була запропонована перша ознака зв’язку ЦД 1 типу з поліморфізмом в гені T-bet у населення Японії, а також,що варіації в транскрипційній активності T-bet можуть грати роль в розвитку ЦД 1 типу, можливо через вплив на продукцію IFNy ^^клітинами. Проте, регіон 17 хромосоми, в якому локалізований Tbx21 не досліджувався як регіон ризику розвитку ЦД 1 типу [22]. Крім того, в мишиній моделі ЦД 1 типу, T-bet контролює диференціювання аутореак-тивних CD8+ T-клітин в ході розвитку патології. За відсутності T-bet важкість перебігу захворювання значно знижувалась, що корелювало зі зменшенням кількості аутоагресивних CD8+ T-клітин та зниженням продукції IFNy [9]. Спираючись на роль Th1 та Th2 клітин в розвитку ЦД 1 типу, поляризація Th- клітин, які продукують цитокіни, була запропонована як тригер розвитку даної патології. В цьому аспекті було проведено декілька досліджень на людях з ЦД 1 типу на початку захворювання, які показали, що значне зниження функціональної активності Th2-клітин тісно пов’язане зі зниженням продукції IL-4 периферичними мононуклеарами у відповідь на поліклональні активатори, такі як фітогемаглютинін та anti-CD3 антитіла [19]. Здатність Th2-клітин, які інфільтрують панкреатичні острівці у діабетичних пацієнтів, продукувати цитокіни значно погіршується, що доведено для IL-4 та IL-10. Відповідно до дослідів, що були проведені на предіабетиних пацієнтах, які мають близьких родичів з даною патологією, та пацієнтах з нещодавно діагностованим ЦД 1 типу, клітинні реакції на глутаматдекарбоксілазу (GAD65)
очевидно зміщені до фенотипу Th1 [10]. Також було повідомлено, що поляризація функцій Th корелює з розвитком захворювання і у схильних до розвитку діабету NOD мишей та BioBreeding (BB) щурів [б]. Було відмічено, що більш високі значення співвідношення IFN-y/IL-4 корелюють з деструктивним інсу-літом, тоді як нижчі значення - з не деструктивним інсулітом. Нещодавно було продемонстровано, що дисбаланс секреції цитокінів Th 1 та Th2 фактично сприяє гендерним відмінностям в розвитку ЦД 1 типу у NOD мишей. Т- клітини від чутливих до захворювання молодих самок мишей продукують більше IFN-у (Th 1), тоді як Т-лімфоцити від резистентних самців демонструють біль високу IL-4-секрецію [2]. Таким чином, не дивлячись на деяку суперечливість даних, можна зробити висновок, що зменшення експресії гену GATA3, яке супроводжується послабленням диференціювання Th2-клітин і посиленням диференціювання ^1-клітин, сприяє розвитку, принаймні, деяких Th1/Th17-залежних аутоімунних процесів, тоді як посилення його експресії може сприяти розвитку алергічних захворювань. У NOD мишей делеція Ifng або Il12b (IL12p40) генів, які є критичними для цитокінів Th1, не зменшують вірогідність розвитку автоімунного діабету. Ці результати припускають, що автоімунний діабет у NOD мишей не є Th 1 -залежним захворюванням. Однак, Esensten J. et al. (2009) повідомляють, що дефіцит Tbx21 у NOD мишей повністю блокує інсуліт та діабет через дефекти в ініціюванні імунної відповіді проти острівців та функціонуванні CD4+ ефекторних T-клітин [4].
Одну з найголовніших ролей в імунопатогене-зі ЦД 1 типу грають прозапальні цитокіни, перш за все TNFa, одним з основних джерел якого є клітини КАЛТ інгі6ітори TNFa знижують ризик розвитку цукрового діабету [1]. В серії робіт показано, що у хворих на цукровий діабет підвищений рівень TNFa в сироватці крові, при цьому концентрація його зростає на початкових етапах ЦД, а також при утворенні мікро-ангіопатій [24]. Попередні дослідження показали, що підвищення рівня TNF-a в неонатальний період у NOD мишей підвищує частоту та прискорює розвиток ЦД 1 типу. Введення нейтралізуючих anti-TNFa-антитіл новонародженим NOD мишам призводить до повного попередження розвитку патології. Так, Koulmanda M. et al. (2012) показали, що короткочасне лікування anti-TNFa відновлює еуглікемічний статус у діабетичних NOD мишей, аутотолерантність та нормальну передачу сигналу інсуліном [11]. Тем не менш, використання МКАТ до TNFa пов’язано з такою проблемою, як підвищення ризику розвитку тяжких інфекцій (пневмонія, сепсис), та вірогідністю реактивації латентної інфекції, в першу чергу туберкульозу. В цьому аспекті цікавою є більш «м’яка» блокада TNFa за допомогою інгібіторів фосфодіес-тераз (іФДЕ), зокрема пентоксифілліном (PTX), який підвищує рівень внутрішньоклітинного цАМФ та пригнічує активацію NF-kB і транскрипції мРНК, що кодує TNFa. Ще одним важливим моментом такого підходу є позитивний вплив PTX на мікроциркуля-торне русло, що надзвичайно важливо, зважаючи
на кількість ангіогенних ускладнень у хворих на ЦД 1 типу. Зокрема, Han K. et al. (2010) показали, що тривалий прийом збільшує ренопротективний ефект PTX через протизапальну активність при стрепто-зотоцин-індукованій діабетичній нефропатії. У діабетичних щурів, введення PTX протягом 4 тижнів (40 mg/kg, per oral) інгібує запалення в нирках, а при призначенні препарату протягом 8 тижнів - попередило протеїнурію [5]. Цілий ряд спостережень показав позитивні ефекти прийому PTX при діабетичній ретинопатії та нефропатії [3, 18]. Крім того, була відмічена пряма здатність PTX попереджувати розвиток діабету у експериментальних тварин. Так, у NOD мишей PTX знизив важкість інсуліту та попередив діабет як на фоні призначення циклофосфаміду, так і без нього. Цей протективний ефект зберігався через більш ніж 10 тижнів після відміни препарату [13]. Stosic-Grujicic S. et al. (2001) продемонстрували, що PTX попереджує автоімунно-опосередковане запалення, яке спричинене багаторазовим низько-дозовим введенням стрептозотоцину (MLD-SТZ) генетично чутливим мишам лінії CBA/H (40 мг STZ на кг ваги протягом 5 днів) та щурам лінії DA (20 мг STZ на кг ваги протягом 5 днів). Призначення PTX (200 мг/кг/день протягом 10 днів) в комбінації з низькими дозами SТZ зменшувало прояви інсуліту та попереджало розвиток гіперглікемії [21]. Mensah-Brown E. et al. (2002) проаналізували розвиток діабету та апоптозу p-клітин панкреатичних острівців у мишей лінії CBA після індукції MLD-SТZ. Ефект PTX був оцінений по рівню індукції апоптозу в острівцях через різні інтервали часу після індукції діабету. PTX значно затримумав апоптоз та пригнічував індукцію діабету. Отримані ними данні збігаються з інформацією, що INFy/TNFa/NO-індукований апоптоз р-клітин у експериментальних тварин послаблюється пенток-сифілліном [15]. Visser J. et al. (2002) показали, що захисний ефект від використання PTX у схильних до діабету Diabetes-prone Bio Breeding (DP-BB) і резистентних до діабету Diabetes-resistant (DR-BB)
щурів значною мірою залежить від термінів його введення. Якщо DP-BB отримували PTXпротягом 60 днів, розвиток діабету був практично редукований. інші протоколи лікування не мали ніякого ефекту. У DR-BB щурів лікування PTXвикликало лише затримку розвитку діабету. В обох моделях ВВ-щурів, використання PTX in vivo значно затримувало продукцію TNFa, але помірно впливало на продукцію IL-10 in vitro. Ці результати демонструють значення вибору часу використання PTX для запобігання розвитку діабету у DP-BB щурів. Збільшене PTX -індукованого співвідношення IL-10/TNFa можливо е одним з механізмів захисту або затримки розвитку діабету [23]. Крім того, за результатами іншого дослідження за участю 21 дитини з вперше діагностованим ЦД 1 типу було з’ясовано, що PTX здатен зменшити (але не ліквідувати) необхідність в інсуліні або подовжити період без використання інсуліну [14].
Висновки.
1. Розвиток діабету супроводжується переважно збільшенням кількості T-bet+-клітин в лімфоїдних структурах КАЛТ на 45-72 % (р<0,05), односпря-мованим зниженням сумарної щільності GATA3+-лімфоцитів на 21-44 % (р<0,05), призводить до незначного зниження концентрації T-bet і не впливає на концентрацію GATA3 в Т-хелперах. Виявлені зміни співвідношення T-bet+/GATA3+-клітин можуть бути одними з тригерів розвитку і прогресії діабету.
2. Введення PTX діабетичним тваринам зменшує кількість T-bet+-клітин у ВПСОВ (на 24-30 %, р<0,05) на протязі всього періоду спостереження, в іЛВ -тільки к 4 тижню діабета (на 41 %, р<0,05), не впливає на щільність Th2 у ворсинках, різноспрямовано змінює їх число в іЛВ, дещо знижуючи концентрацію T-bet на 4-й тиждень розвитку ЕЦД при відсутності змін концентрації GATA3 в імунопозитивних клітинах.
Перспективи подальших досліджень. Значний інтерес представляє подальше вивчення компонентів адаптивної та вродженої імунної системи КАЛТ при ЕЦД.
література
1. Antohe J. Diabetes risk in rheumatoid arthritis: Reduced incidence with anti-tumor necrosis factor-a therapy / J. Antohe,
A. Bili, J. Sartorius // Arthritis Care & Research - 2012. - Vol. 64(2). - P. 215-221.
2. Bao M. Molecular mechanisms for gender differences in susceptibility to T cell-mediated autoimmune diabetes in non-obese diabetic mice / M. Bao, Y Yang, H. Jun // J. Immunol. - 2002. -Vol. 168. - P. 5369-5375.
3. Baykara M. Pentoxifylline treatment for protecting diabetic retinopaty in children with type 1 diabetes / M. Baykara, M. Atabek,
B. Eklioglu // J. Pediatr. Endocrinol. Metab. - 2013. - Vol. 26(1-2). - P. 19-24.
4. Esensten J. T-bet-deficient NOD mice are protected from diabetes due to defects in both T cell and innate immune system function / J. Esensten, M. Lee, H. Glimcher, J. Bluestone // J. Immunol. - 2009. - Vol. 183(1). - P. 75-82.
5. Han K. Prolonged administration enhances the renoprotective effect of pentoxifylline via anti-inflammatory activity in strepto-zotocin-induced diabetic nephropathy / K. Han, S. Han, H. Kim // Inflammation. - 2010 - Vol. 33(3) - P. 137-143.
6. Hirai H. Analysis of cytokine mRNA expression in pancreatic islets of nonobese diabetic mice / H. Hirai, K. Kaino, T. Ito, K. Kida // J. Pediatr. Endocrinol. Metab. - 2000. - Vol. 13(1). - P. 91-98.
7. Ho C. GATA3 and the T-cell lineage: essential functions before and after T-helper-2-cell differentiation / C. Ho, T. Tai, S. Pai // Na. t Rev. Immunol. - 2009. - Vol. 9(2). - P. 125-135.
8. Hoyler T. T-bet and Gata3 in controlling type 1 and type 2 immunity mediated by innate lymphoid cells / T. Hoyler, C. Connor, E. Kiss // Curr. Opin. Immunol. - 2013. - Vol. 25(2). - P. 139-147.
9. Juedes A. T-bet controls autoaggressive CD8 lymphocyte responses in Type I diabetes / A. Juedes, E. Rodrigo, L. Togher // J. Exp. Med. - 2004. - Vol. 199. - P. 1153-1162.
10. Karlsson F Cytokine profile in children during the first 3 months after the diagnosis of type 1 diabetes / F. Karlsson, J. Erner-udh, J. Ludvigsson // Scand. J. Immunol. - 2004. - Vol. 59(5). - P. 517-526.
11. Koulmanda M. The Role of TNF-a in Mice with Type 1- and 2- Diabetes / M. Koulmanda, M. Bhasin, Z. Awdeh // PLoS One. -
2012. - Vol. 7(5). - P. 332- 354.
12. Lazarevic V. T-bet: a bridge between innate and adaptive immunity / V. Lazarevic, L. Glimcher, G. M. Lord // Nat. Rev. Immu-
nol. - 2013. - Vol. 11. - P. 777-789.
13. Liang L. The phosphodiesterase inhibitors pentoxifylline and rolipram prevent diabetes in NOD mice / L. Liang, E. Beshay, G. J. Prud'homme // Diabetes. - 1998. - Vol. 47(4) - P. 570-575.
14. MacDonald M. Pentoxifylline in the treatment of children with new-onset 1 diabetes mellitus / M. MacDonald, N. Shahidi, D. Allen // JAMA. - 1994. - Vol. 271. - P. 27-28.
15. Mensah-Brown E. P. Downregulation of apoptosis in the target tissue prevents low-dose streptozotocin-induced autoimmune diabetes / E. P. Mensah-Brown, S. Stosic Grujicic, D. Maksimovic // Mol. Immunol. - 2002. - Vol. 38(12-13). - P. 941-946.
16. Powell N. Transcriptional regulation of the mucosal immune system mediated by T-bet / N. Powell, J. Canavan, T. MacDonald, G. M. Lord // Mucosal Immunology. - 2010. - Vol. 3. - P. 567-577.
17. Sasaki Y Identification of a novel type 1 diabetes susceptibility gene, T-bet / Y Sasaki, K. Ihara, N. Matsuura // Hum Genet. -2004. - Vol. 115(3). - P. 177-184.
18. Shan D. Pentoxifylline for diabetic kidney disease / D. Shan, H. Wu, Q. Yuan // Cochrane Database Syst. Rev. - 2012. - Vol. 15. - P. 2-9.
19. Sia C. Imbalance in Th Cell Polarization and its Relevance in Type 1 Diabetes Mellitus / C. Sia // Rev Diabet Stud. - 2005. - Vol. 2(4). - P. 182-186.
20. Sorini C. Shaping the autoimmune response in the gut: the role of intestinal immune regulation in the prevention of type 1 diabetes / C. Sorini, M. Falcone // Am. J. Clin. Exp. Immunol. - 2013. - Vol. 2. - P. 156-171.
21. Stosic-Grujicic S. Pentoxifylline prevents autoimmune mediated inflammation in low dose streptozotocin induced diabetes /
S. Stosic-Grujicic, D. Maksimovic, M. Stojkovic // Dev. Immunol. - 2001. - Vol. 8(3-4). - P. 213-221.
22. Todd J. Robust associations of four new chromosome regions from genome-wide analyses of type 1 diabetes / J. Todd, N. Walker, J. Cooper // Nat. Genet. - 2007. - Vol. 39. - P. 857-864.
23. Visser J. Timing of pentoxifylline treatment determines its protective effect on diabetes development in the Bio Breeding rat / J. Visser, H. Groen, F. Klatter // Eur. J. Pharmacol. - 2002. - Vol. 445(1-2). - P. 133-140.
24. Zorena K. Threshold serum concentrations of tumour necrosis factor alpha (TNFa) as a potential marker of the presence of microangiopathy in children and adolescents with type 1 diabetes mellitus (T1DM) / K. Zorena, M. Kula, E. Malinowska // Hum. Immunol. - 2013. - Vol. 74(1). - P. 75-81.
УДК 616. 379-008. 64-092. 9]:577. 214:616. 344-018. 98
вплив ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО ЦУКРОВОГО ДІАБЕТУ НА ЕКСПРЕСІЮ ТРАНСКРИПЦІЙНИХ ФАКТОРІВ Т-Ьег ТА йАТАЗ В ЛІМФОЇДНИХ СТРУКТУРАХ КЛУБОВОЇ КИШКИ ЩУРІВ
Деген А. С., Камишний О. М.
Резюме. В експерименті досліджувався вплив експериментального цукрового діабету на інтенсивність експресії транскрипційних факторів Т-Ьеі та ОДТД імунними клітинами клубової кишки. Для визначення Т-Ьеі+ та ОДТД +-клітин було застосовано метод непрямої імунофлюоресценції з використанням монокло-нальних антитіл до Т-Ьеі та ОДТД щура. Встановлено, що розвиток діабету супроводжується збільшенням кількості Т-Ьеі+-клітин в лімфоїдних структурах КАЛТ на 45-72 % (р<0,05), зниженням сумарної щільності ОДТД3+-лімфоцитів на 21-44 % (р<0,05), незначного зниження концентрації Т-Ьеі і не впливає на концентрацію ОДТД3 в Т-хелперах. Введення РТХ діабетичним тваринам зменшує кількість Т-Ьеі+-клітин у ВПСОВ (на 24-30 %, р<0,05), не впливає на щільність ТИ2 у ворсинках, різноспрямовано змінює їх число в ІЛВ, дещо знижуючи концентрацію Т-Ьеі на 4-й тиждень розвитку ЕЦД при відсутності змін концентрації ОДТД3 в імуно-позитивних клітинах.
Ключові слова: діабет, Т-Ьеі, ОДТД, кишково-асоційована лімфоїдна тканина.
УДК 616. 379-008. 64-092. 9]:577. 214:616. 344-018. 98
ВЛИЯНИЕ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО САХАРНОГО ДИАБЕТЕ НА ЭКСПРЕССИЮ ТРАНСКРИПЦИОННЫХ ФАКТОРОВ Т-Ьег И йАТАЗ В ЛИМФОИДНЫХ СТУКТУРАХ ПОДВЗДОШНОЙ КИШКИ КРЫС
Деген А. С., Камышный А. М.
Резюме. В эксперименте изучалось влияние экспериментального сахарного диабета на интенсивность экспрессии транскрипционных факторов Т-Ьеі и ОДТД иммунными клетками подвздошной кишки. Для определения Т-Ье1+ та ОДТД +-клеток был использован метод непрямой иммунофлюоресценции с использованием моноклональных антител к Т-Ьеі и ОДТД крыс. Установлено, что развитие диабета сопровождается увеличением количества Т-Ьеі+-клеток в лимфоидных структурах КАЛТ на 45-72 % (р<0,05), снижением суммарной плотности ОДТД3+-лимфоцитов на 21-44 % (р<0,05), незначительного снижения концентрации Т-Ьеі и не влияет на концентрацию ОДТД3 в Т-хелперах. Введение РТХ диабетическим животным уменьшает количество Т-Ьеі+-клеток в СПСОВ (на 24-30 %, р<0,05), не влияет на плотность ТИ2 в ворсинках, разнонаправленно изменяет их число в ИЛФ, несколько снижая концентрацию Т-Ьеі на 4-й неделе развития ЭСД при отстствии изменений концентрации ОДТД3 в иммунопозитивных клетках.
Ключевые слова: диабет, Т-Ьеі, ОДТД, кишечно-ассоциированная лимфоидная ткань.
UDC 616. 379-008. 64-092. 9]:577. 214:616. 344-018. 98
Inluence of Experimental Diabetes Mellitus on the T-Bet and Gata Transcriptions Factors Expression in Lymphoid Structures of Ileum in Rats
Degen A. S., Kamyshny A. M.
Abstract. A considerable quantity of researches of patients with a diabetes and its models at animals have shown a close connection of development type 1 diabetes mellitus and changes in an intestine which anticipate appearance of clinical symptoms of disease. Functional polarization of T- helpers in gut-associated lymphoid tissue plays an important role in an induction of development and progression of T1DM. The great interest represents studying of adaptive immune system, especially tight regulation of the type 1 inflammatory response, at the development of autoimmune disease, such as type 1 diabetes mellitus. Because reduction of an expression of gene GATA3 which is accompanied by weakening of a differentiation of Th2-cells and intensifying of a differentiation of Th1-cells, promotes the development of some Th1 / Th17-dependent autoimmune processes whereas intensifying of its expression can promote development of allergic diseases.
Proinflammatory cytokines, such as TNFa play one of the most important roles in pathogenesis of T1DM. Indirect inhibitors of their production (for example, pentoxifylline, PTX) reduce risk of development of this pathology.
The aim of research: To study the peculiarities of T-bet and GATA transcriptions factors expression in gut-associated lymphoid tissues (GULT) of rats with experimental STZ-induced diabetes mellitus and pentoxifylline administration.
Methods:Researches are made on Wistar rats. For an induction of diabetes streptozotocin was used in doses 50 mg/kg. Structure of population of T- bet+ and GATA +-cells has been studied by the analysis of serial histological sections using the method of indirect immunofluorescense with monoclonal antibodies to T-bet and GATA of rat. T- bet+ and GATA +-cells, which were situated in lamina propria of villi and subepithelial zone of ILF has been studied by coloring of monoclonal antibodies to T-bet and GATA3. It demonstrates features of activation of effector and inductive immune response in GALT
Results: It has been established that diabetes development was accompanied with 45-72 % (р <0,05) increase in quantity of T-bet +-cells in lymphoid structures of ileum, with 21-44 % (р <0,05) decrease in total density of GATA3+- lymphocyte, an insignificant decrease in concentration of T- bet and it had no influence on concentration of GATA3 in T-helpers. Pentoxifylline administration of diabetic animal reduces the quantity of T- bet+-cells in mucous membrane of villus (on 24-30 %, р <0,05), does not influence the density of Th2 in villus, changes their number in ILF, reduces concentration of T- bet by the 4th week of development of T1DM in the absence of concentration changes of GATA3 in immunopositive cell.
Conclusions: The expression augmentation with T-bet and GATA in ileum immunopositive cells can influence the differentiation of subsets of T-helpers and their proinflammatory cytokines production, thus acting as one of triggers of diabetes development and progression.
Key words: diabetes, T-bet, GATA, gut-associated lymphoid tissue.
Рецензент - проф. Рибаков С. Й.
Стаття надійшла б. 11. 2013 р.
