CC BY-ND
170
34
ЗНиСО ЯНВАРЬ №1 (274)
УДК 614.38
ЭФФЕКТИВНАЯ ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА -ОСНОВА МОНИТОРИНГА ПАРАЗИТАРНЫХ БОЛЕЗНЕЙ
М.М. Асланова1, К.Ю. Кузнецова2, Е.Н. Морозов2
1ФБУЗ «Федеральный центр гигиены и эпидемиологии» Роспотребнадзора, г. Москва, Россия 2Научно-исследовательский институт медицинской паразитологии и тропической медицины имени Е.И. Марциновского ГБОУ ВПО «Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова» Минздрава России, г. Москва, Россия
Проведен аналитический обзор существующих методов определения паразитарного патогена в биологическом материале и образцах из окружающей среды, применяемых в отечественной и зарубежной практике здравоохранения. Продемонстрированы все возможные методические приемы для установления диагноза паразитарного заболевания и паразитарного загрязнения внешней среды как взаимосвязанных факторов, отягчающих безопасность среды обитания. Ключевые слова: лабораторная диагностика, паразитарные болезни, среда обитания, методы исследований биологического материала.
M.M. Aslanova, K.Yu. Kuznetsova, E.N. Morozov □ EFFECTIVE LABORATORY TESTING IS A BASIS OF MONITORING PARASITIC DISEASES □ FBHI FCH&E of the Inspectorate for Customers Protection of Rospotrebnadzor, Moscow, Russia; Martsinovsky Research Institute of Medical Parasitology and Tropical Medicine of Sechenov First Moscow State Medical University, Moscow, Russia.
Existing methods of determining parasitic pathogen in biological material and environmental samples used in domestic and foreign practice of public health have been reviewed. All possible methodical receptions for establishment of the diagnosis of a parasitic disease and parasitic pollution of environment as the factors interconnected and aggravating safety of habitat are shown.
Key words: laboratory diagnosis, parasitic diseases, habitat, research methods biological material.
Ц
Верификация и видовая идентификация патогенов паразитарной природы являются основой диагностики паразитарных болезней и показателей биологической безопасности среды обитания. Они базируются на применении специфических лабораторных методов исследования. Развитие лабораторных технологий, в том числе в области паразитологических исследований, направлено на обеспечение точности, воспроизводимости и прослеживаемости этапов исследований и их стандартизации [2, 12].
Цель исследования — определить методы установления диагноза паразитарного заболевания и паразитарного загрязнения внешней среды как взаимосвязанных факторов, отягчающих безопасность среды обитания.
Материалы и методы. В целях формирования структуры эпидемиологической значимости качественных лабораторных исследований объектов окружающей среды и клинического материала от людей при паразитозах был использован анализ данных многолетних исследований в системе паразитологического мониторинга за объектами окружающей среды и заболеваемостью.
Результаты исследования. По данным мировой научной литературы, в настоящее время известно 1415 патогенов — возбудителей инфекционных и паразитарных болезней, из них 353 являются возбудителями паразитарных болезней.
Разработаны отечественными учеными и применяются в практической службе здравоохра-
нения России более 60 методов и модификаций паразитологических исследований биологических выделений из организма человека, около 40 методов санитарно-паразитологических исследований объектов внешней среды. Сюда входят не только традиционные макро- и микроскопические методы паразитологических исследований, но и новые методические разработки, прошедшие научные и экспериментальные испытания, а также наглядное пособие всех изображений форм и стадий развития возбудителей паразитарных болезней [1, 2, 13].
Современный этап развития паразитологических лабораторных исследований позволяет проводить комплексную оценку паразитарной системы с использованием микроскопических, иммунных, иммунохимических и высокотехнологических методов анализа, в том числе метода ПЦР и применение комплекса автоматизированной микроскопии. [5, 15].
Характер течения иммунологического процесса при гельминтозах во многом определяется вирулентностью возбудителя — индивидуальной, приобретенной в процессе предшествующего онтогенетического развития, штаммовой или расовой степенью патогенности возбудителя, проявляющихся на данном хозяине в определенных конкретных условиях [3, 4].
К отличительным особенностям патогенных гельминтов и простейших за редким исключением относят: неспособность паразитов размножаться вне организма хозяина; своеобразие путей миграции; воздействие на органы и ткани
ЯНВАРЬ №1 (274)
35
в процессе их стадийного развития, в частности |— травматического, что вызывает иммунный ответ
микроорганизма. ^э В связи с этим иммунологические методы исследования при их диагностике являются i-^ основными. В настоящее время применяют иммуноферментный анализ (ИФА), реакцию Е непрямой гемагглютинации (РНГА), реакцию непрямой иммунофлуоресценции (РНИФ), иммунохроматографический экспресс-метод для определения антигенов патогенных простейших в пробах кала [1, 4].
На территории Российской Федерации разрешены к применению наборы реагентов:
1) для иммуноферментного выявления:
— иммуноглобулинов класса A, M, G — к антигену Toxoplasmagondii в сыворотке (плазме) крови;
— иммуноглобулинов класса M, G — к антигенам Trichinellaspiralis, Opisthorchisfelineus в сыворотке (плазме) крови;
— иммуноглобулинов класса G — к антигенам Anisakisspp., Ascarislumbricoides, Clonorchissinensis, Echinococcusgranulosus, Entamoebahistolytica, Leishmaniaspp., Schistosomamansoni, Taeniaso-lium (Cysticercuscellulosae), Toxocaraspp, Stron-giloidesstercoralis, Fasciolahepatica, Trypanosomacruzi в сыворотке (плазме) крови;
— иммуноглобулинов класса A, G — к антигенам Trichomonasvaginalis в сыворотке (плазме) крови;
2) для иммуноферментного определения индекса авидности иммуноглобулинов класса G — к Toxoplasmagondii в сыворотке крови;
3) для иммуноферментного выявления специфических циркулирующих иммунокомплексов, содержащих антигены Opisthorchisfelineus в сыворотке крови;
4) для иммуноферментного определения концентрации аллергенспецифических IgE — к антигенам паразитов с биотинилированными аллергенами Ascarislumbricoides, Echinococcusgranulosus, Opisthorchisfelineus, Trichinellaspiralis, Toxocaracanis, Lamblia intestinalis, Anisakis simplex в сыворотке (плазме) крови;
5) для иммуноферментного выявления антигена Lamblia intestinalis, Cryptosporidiumparvum в суспензии фекалий;
6) наборы реагентов для экспресс-диагностики кишечных инфекций: лямблиоза, криптоспори-диоза, амебиаза в пробах кала.
Более девяти видов наборов реагентов для иммуноферментного выявления иммуноглобулинов к известным возбудителям паразитарных болезней разработаны в НИИМПиТМ им. Е.И. Марциновского и внедрены в отечественное производство [1, 5, 6].
Среди экспресс-методов диагностики инфекционных и паразитарных болезней особое место занимают иммуносорбционные методы или методы иммунофлуоресценции. Иммунологические методы эффективны при гельминтозах, возбудители которых обитают непосредственно в тканях или в ранней фазе развития мигрируют по кровеносному руслу и внутренним органам хозяина. [11]. Метод объединил микроскопию с принципом иммунологического анализа.
Иммунофлуоресценции обладает двумя основными преимуществами по сравнению с другими методами исследования: устанавливает локализацию антигенов в зараженном материале или клетке и визуализирует и проводит ускоренную их идентификацию в исследуемом материале — биологическом и санитарном. Применяют два основных варианта этой методики — прямую и непрямую иммунофлуоресценцию.
Новым этапом усовершенствования общепринятых методов лабораторных исследований стало применение сорбентов с магнитными свойствами для выделения и последующей идентификации различных микроорганизмов и их антигенов. Магнитоиммуносорбенты используют в качестве твердой фазы для селективного концентрирования на их поверхности различных антигенов и микроорганизмов. Широкий диапазон объемов исследуемых проб жидкостей и возможность исследования сильнозагрязненных объектов определяют преимущественный выбор данного метода в санитарной паразитологии [9, 10].
Становление молекулярной паразитологии и нового в ней направления — метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) — является качественно новой областью лабораторного мониторинга паразитарной заболеваемости населения и состояния среды обитания по показателям паразитарной чистоты. Применение метода ПЦР в качестве лабораторного контроля критических уровней нахождения паразитарного патогена в исследуемых образцах основана на обеспечении принципа методологического единообразия и интерпретации результатов проводимых исследований. По сравнению с традиционными методами диагностики ПЦР обладает более высокой чувствительностью, специфичностью и позволяет проводить прямое определение микроорганизма непосредственно в клиническом материале без получения чистой культуры возбудителя, что снижает трудозатраты [10].
Метод ПЦР позволяет с высокой степенью точности проводить диагностику ВИЧ-ассоциированных паразитозов — висцерального лейшманиоза, токсоплазмоза, кишечных прото-зойных инфекций — амебиаза, криптоспоридиоза, лямблиоза и бластоцистоза. Их клиническую и лабораторную диагностику затрудняет либо по-лиморфность возбудителя, либо клиническое разнообразие симптомокомплексов и особенности эпидемиологии и эпизоотологии очагов [8]. В частности, лейшманиозы, вызванные Ъ. braziliensis, L. aethiopica и L. Donovani, могут проявиться в кожной и висцеральной форме болезни или иметь сходные клинические проявления с другими заболеваниями, при этом затрачивается многочасовой метод культивирования, их выявление и видовое определение. Метод ПЦР применяется для прямой диагностики и идентификации различных клинических проявлений лейшманиоза [5].
Актуальность этой проблемы для России определена эндемичными территориями Крыма и Северного Кавказа.
Возбудители бластоцистоза долгое время относились к условно-патогенной группе микроорганизмов. Многочисленные данные отечественной
36
ЗНиСО ЯНВАРЬ №1 (274)
и зарубежной науки в настоящее время указывают на этиологическое и патогенетическое значение возбудителя в развитии диарейного синдрома. По статистическим данным, зараженность бластоци-стами у лиц с диарейным синдромом составила в среднем 30 %, из них у взрослых — 38,3 %, у детей — 25,4 %. В 56 сомнительных случаях бластоцистоза затруднения диагностики были связаны с наличием морфологически измененных форм возбудителя после самолечения и при микст-инфекциях. В этих случаях применялись комбинированные методы микроскопической диагностики — метод ФЭО, нативный мазок, посев на специальные среды [10].
В других исследованиях диагностика B. hominis проводилась методом ПЦР: из 32 проб, содержащих бластоцисты микроскопически, в 94 % был отмечен положительный результат; в 36 пробах, не содержащих бластоцисты, положительный результат был получен в восьми случаях, что подтверждает высокие критерии чувствительности и специфичности метода ПЦР для полиморфной детекции возбудителя при его невысокой концентрации в исследуемых образцах [9].
Перечень «новых» открытий в паразитологии постоянно пополняется. В 2013 г. впервые был описан клинический случай совместного паразитирования половозрелых гельминтов и микрофилярий в крови больного дирофиля-риозом, что позволило по-новому взглянуть на эпидемиологию дирофиляриоза. В настоящее время достоверно установлен факт развития до половозрелой стадии дирофилярий в организме человека с обнаружением микрофилярий в крови, вследствие чего человек может служить источником заражения комаров — участвовать в передаче инвазии [6, 11].
Внедрение метода ПЦР в лабораторную диагностику дирофиляриоза и видовой дифференциации возбудителя в крови у больных и в организме комаров (D. repens, D. immitis) являются новейшими разработками отечественной науки [11].
Хорошо известны эпидемиологические последствия малярии для отдельно взятых стран и клиническое значение для самого больного. Первоочередные задачи национальных программ по борьбе с малярией в эндемичных странах определяют временные критерии снижения заболеваемости, сохранение и закрепление достигнутых результатов [6].
В достижении поставленных целей лабораторная диагностика малярии является ответственным звеном клинико-эпидемиологической работы по выявлению больного и паразитоносителя, видового определения паразита, особенно при микст-инфекциях, и контроля эффективности лечения [6, 9].
Известно, что при элиминации малярии лабораторный контроль инфекции осложняется тем, что болезнь «уходит в подполье» — падает число больных и уровень паразитемии в крови больных, а критический контроль достоверности оздоровления очага отсутствует. Отечественными учеными разработана оригинальная методика выделения ДНК возбудителя из препарата крови «толстая капля» с порогом чувствительности
метода в пределах 2—4 паразитов в 1 мкл крови. Применение данного метода позволяет достоверно I— подтвердить отсутствие заболевания и результаты достижения целевых программ элиминации ^э малярии на эндемичных территориях [9, 13].
Наиболее распространенные методы лабораторной диагностики кишечных гельминтозов -^з и протозойных болезней, а также санитарно- е паразитологические методы определения возбудителей во внешней среде основаны на применении микроскопических методов исследования. Микроскопия позволяет достаточно быстро провести видовую диагностику паразита, но результаты во многом зависят от квалификации исследователя. Положительной тенденцией является общий современный тренд нарастающего применения электромеханических моторизованных элементов автоматизации рутинных операций микроскопии [7, 8, 16].
В 2004 г. на базе НИИМПиТМ им. Е.И. Мар-циновского совместно с отечественным производителем медицинских компьютеризированных систем (МЕКОС) впервые был разработан и внедрен в практику программный модуль «Паразитология», позволяющий в автоматизированном режиме проводить скрининг микроскопических препаратов с целью поиска и идентификации возбудителей кишечных паразитозов в биологическом материале с последующим сохранением изображений обнаруженных патогенов, возможностью дистанционного контроля результатов исследования, архивирования протоколов исследований с атласом изображений и, что более важно, возможностью их представления при отдаленной экспертной оценке [8, 14].
В роботизированной модели МЕКОС-Ц2 использованы оригинальные методы обнаружения и распознавания паразитологических объектов, оригинальная система сбора данных о функционировании автоматических функций с использованием особенностей архитектуры аппарата и промежуточных фиксируемых моделей препаратов каждого уровня распознавания биоматериала. Работа на данном аппарате предлагает два режима эксплуатации: ручной микроскопии и комплекса автоматизированной микроскопии (КАМ) с автоматическими функциями сканирования и анализа изображений препарата.
Применение КАМ позволяет увеличить чувствительность и воспроизводимость диагностически значимой морфологии в 2—5 раз по сравнению с применяемыми современными методиками исследований. Ошибка распознавания объектов поиска при данном режиме работы не превышает статистический показатель ошибки анализа и позволяет в 1,5—2 раза повысить точность дифференциальной диагностики широкой группы паразитарных и других патологий, увеличить выявляемость искомых патогенов. Дальнейшие технические и технологические разработки КАМ проводятся в направлении расширения функций анализа на биоматериалы разных типов и объектов окружающей среды на базе так называемых проточных технологий [1, 2].
Выводы. Результаты анализа состояния лабораторных технологий показывают, что современная номенклатура исследований биологического ма-
ЯНВАРЬ №1 (274)
37
г-Ь
териала и объектов окружающей среды предлагает большой выбор унифицированных методик для практического применения и решения главной государственной задачи по формированию достоверного статистического слежения за уровнем заболеваемости населения паразитарными болезнями и состоянием среды обитания.
Следует учитывать также заболеваемость населения паразитозами на каждой конкретной администативной территории субъектов Российской Федерации и рационально планировать необходимые исследования в соответствии со структурой эпидзначимости объектов окружающей среды.
Необходимо также осуществлять: дальнейшую разработку и усовершенствование методов и средств профилактики и борьбы с социально значимыми паразитарными болезнями, включая совершенствование систем эпидемиологического надзора за паразитозами и комплекса мер по санитарной охране территории страны от завоза тропических болезней; оптимизацию методов диагностики и терапии паразитарных болезней; изучение экологии и биологии переносчиков, природных хозяев и возбудителей паразитозов; разработку новых методов и средств борьбы с переносчиками и регуляции численности природных хозяев возбудителей.
ЛИТЕРАТУРА
1. Асланова М.М. Диагностика криптоспоридиоза // Здоровье населения и среда обитания. 2015. № 7 (268). С. 49—50.
2. Асланова М.М. и др. Сравнительный анализ эффективности методов диагностики криптоспоридиоза / М.М. Асланова, Т.Г. Сыскова, Е.А. Черникова // Здоровье населения и среда обитания. 2012. № 10 (235). С. 36—37.
3. Бронштейн А.М. и др. Первый в России аутохтонный случай выявления длительной микрофиляриемии Dirofilaria repens и первый опыт комбинированной терапии дирофиляриоза repens / А.М. Бронштейн, Н.А. Малышев, С.Н. Жаров [и др.] // Эпидемиология и инфекционные болезни. 2013. № 3. С. 47—52.
4. Булат С.А. и др. Идентификация маркерных штаммов Leishmaniamajor, L. turanica, L. gerbilli методом полимеразной цепной реакции с универсальным праймером / С.А. Булат, М.В. Стрелкова, В.В. Сысоев // Медицинская паразитология и паразитарные болезни. 1992. № 1. С. 21—22.
5. Жиренкина Е.Н. Изучение лейшманиозов методом полимеразной цепной реакции // Сеченовский вестник. 2012. № 1. С. 49—53.
6. Кондрашин А.В. и др. Тенденции в борьбе с малярией в мире. Прогресс и актуальные задачи в программах борьбы с малярией / А.В. Кондрашин, А.М. Баранова,
Л.Ф. Морозова [и др.] // Медицинская паразитология и паразитарные болезни. 2011. № 4. С. 3—8.
7. Кузнецова К.Ю. Автоматизация лабораторной диагностики гельминтозов (экспериментальные исследования) // Автореф. дисс. ... канд. мед. наук. М., 2005. 28 с.
8. Медовый В.С. и др. Современные возможности роботизированной микроскопии в автоматизации анализов и лабораторной телемедицине (аналитический обзор) / В.С. Медовый, А.М. Пятницкий, Б.З. Соколинский [и др.] // Клиническая лабораторная диагностика. 2012. № 10. С. 32—43.
9. Морозов Е.Н. Перспективы применения методов молекулярной паразитологии в мониторинге социально значимых паразитозов // Справочник заведующего КДЛ. 2011. № 4. С. 13—20.
10. Морозов Е.Н. и др. Молекулярная диагностика паразитарных болезней / Е.Н. Морозов, К.Ю. Кузнецова // Инфекционные болезни. 2014. № 1. С. 36—37.
11. Морозов Е.Н. и др. Дирофиляриоз человека: клинико-диагностические признаки и методы диагностики / Е.Н. Морозов, В.Г. Супряга, В.М. Ракова [и др.] // Медицинская паразитология и паразитарные болезни. 2014. № 2. С. 13—17.
12. Национальный стандарт Российской Федерации. Технологии лабораторные клинические. Обеспечение качества клинических лабораторных исследований. Часть 4. Правила ведения преаналитического этапа: ГОСТ Р 53079.4—2008 (утв. и введен в действие приказом Ростехрегулирования от 18.12.2008 № 554-ст).
13. Malaria Control: the power of intergrated action: [Электронный ресурс] // Geneva: WHO, 2005. P. 1—2 (Helth and Environment Linkages Policy Series): Режим доступа: http://www.who.int/heli/risks/vectors/malariacontrol/en/ (дата обращения: 04.12.2015).
14. Sorvillo F. et al. Baylisascaris procyonis: An emerging helminthic Zoonosis / F. Sorvillo, R.Ash. Lavrence, O.G.W. Berlin [et al.] // J. Emerging infectious diseases. 2002. Vol. 8. № 4. P. 355—358.
15. Spillman R.K. Pulmonary ascariasis in tropical communities // American journal of tropical medicine and hygiene. 1975. P. 124—791.
16. Taylor L.N. et al. Risk factor for human diseases emergence / L.N. Taylor, S.M. Latham, M.E. Woolhiuse // Philosophical Transactions of the Royal Society B. 2001. Vol. 356. P. 983—989.
Контактная информация:
Асланова Мария Михайловна, тел.: +7 (903) 964-11-45, e-mail: [email protected]
Contact information: Aslanova Maria, phone: +7 (903) 964-11-45, e-mail: [email protected]
