CC BY
26
УДК 579.26
С. И. Мирзиев, Д. Е. Белостоцкий, В. А. Милюков,
В. Г. Евтюгин, А. М. Зиганшин
ЭФФЕКТ ВНЕСЕНИЯ ЦЕОЛИТОВ НА КОНВЕРСИЮ СУБСТРАТА С ВЫСОКИМ СОДЕРЖАНИЕМАЗОТА
Ключевые слова: анаэробная конверсия, куриный помет, сообщества микроорганизмов.
В представленном исследовании выявлен эффект внесения цеолитов на мезофильную анаэробную конвер-сиюкуриного помета вбэтч-тестах, а также идентифицирован состав метаногенного сообщества, вовлеченного в данный процесс. Выявлен повышенный и ускоренный общий выход газа сповышенным содержанием метана из анаэробных систем, в которые вносили цеолиты в различных концентрациях. T-RFLP анализ позволил установить важность миксотрофныхметаногеноврода Methanosarcina, а также гидрогенотрофныхме-таногенов родов Methanoculleus и Methanobacterium в конверсии отходов птицеводства.Полученные адаптированные микробные сообщества могут быть использованы в качестве восстановительного агента при нарушении анаэробного процесса в результате аккумуляции ингибирующего процесс аммиака.
Keywords: anaerobic digestion, chicken manure, microbialcommunities.
In the present study, the effect of addition of zeolites on mesophilic anaerobic digestion of chicken manurein the batch tests as well as the composition of methanogenic communities involved in this processwere investigated. The increased and accelerated the total gas production with a higher content of methane was revealed in the anaerobic systems which were operated in the presence of various concentrations of zeolites. T-RFLP analysis allowed the determination of the importance of mixotrophicmethanogens belonging to the genus Methanosarcina as well as the hydrogen-otrophicmethanogens of the genera Methanoculleus and Methanobacteriumintheanaerobic digestion ofpoultry wastes. Obtained adapted microbial communities can be used as a potential sourcefor the recovery of anaerobic digestion process because of accumulation of high levels of ammonia.
Введение
Утилизация органических отходов с попутным получением полезных продуктов, а также поиск возоб-новляемыхисточников энергии являются актуальными задачами современности. Биометан, продуцируемый анаэробными микроорганизмами, может быть использован для частичной замены ископаемого топлива с последующим производством тепла и электроэнергии, а также в качестве моторного топлива [1-3]. В последнее время научно-исследовательской деятельности в области анаэробных процессов конверсии биомассы, а также практическому применению разрабатываемых биотехнологий уделяется большое внимание, обращая особое внимание на влияние различных эксплуатационных и экологических параметров на функционирование различных типов анаэробных систем, оптимизацию анаэробных процессов конверсии и микробиологию самого процесса [4, 5]. Кроме того, органические отходы,переработанныев анаэроб-ныхусловиях, далее могут быть использованы в качестве высокоэффективных сельскохозяйственных удобрений.
Анаэробную конверсию биомассы осуществляют гидролитические, ацидогенные и ацетогенные бактерии, а также ацетокластические, гидрогенотрофные и метилотрофныеметаногенные археи. Среди широкого выбора субстратов куриный помёт является одним из наиболее привлекательных сырьевых источников для данного направления исследования. Кроме его широкой доступности он обладает высоким потенциальным выходом метана в конечном продукте. При должном уровне биологической обработки куриный помёт является хорошим выбором для сведения к минимуму количества отходов и для получения при этом полезных продуктов [5, 6]. Однако труднодоступ-
ность данного субстрата для анаэробных микроорганизмов объясняется высоким содержанием мочевой кислоты и неразложившихся протеинов, деструкция которых в анаэробных условиях сопровождается накоплением токсичного аммиака, а также повышенным содержанием древесных опилок, перьев и антибиотиков.Высокоесодержание мочевой кислоты и неразложившихся протеинов в курином помете в итоге ведёт к накоплению аммонийного азота (МН4+-№) и аммиачного азота (ЫН3-М) - в высоких концентрациях ингибирующих активность микроорганизмов (бактерий и в большей степени уязвимых метаногенных архей) в реакторах. Так, из-за высокого содержания азота в отходах ингибиро-вание микробов повышенными концентрациями аммиака является главной проблемой, с которой сталкиваются при практическом применении данных типов сырья.
Поиск эффективного и экономически оправданного решения данной проблемы является одной из самых актуальных задач данного направления. Одним из эффективныхрешенийсложившейсяпробле-мы может стать добавление в анаэробные системы доступных соединений, способных к удалению ионов аммония и аммиака. Так, одними из наиболее известных и широко распространённых веществ, способных к такому процессу, являются цеолиты. Известно, что ионы аммония и аммиакэффективно удаляются цеолитами из водных растворов, когда те обмениваются катионами или адсорбируются в порах алюмосиликатных систем [6, 7].
В связи свышеизложенным целью данной работы сталовыявление эффекта внесения алюмосиликатных цеолитов на анаэробную конверсию куриного помета в бэтч-тестах и структуру метаногенного-сообщества, вовлеченного в данный процесс.
Экспериментальная часть
Субстрат и анаэробная конверсия. Куриный помёт был отобран на птицефабрике Зеленодольского-района Республики Татарстан, Российская Федерация. Субстрат далее хранилив холодильникепри температуре +4оС. В таблице 1 представлены параметры начала серии экспериментов. Цеолиты вносили в концентрациях 2.5 и 5.0 г/л. Цеолиты («Merck 5704», 0.3 нм, ~2 мм) имели следующий состав (%): Si (SiO2) -17.8 (38.0), Al (A12O3) -17.1 (32.2) и K (K2O) - 24.7 (28.9). Эксперименты проводили в бэтч-тестах при постоянной температуре +40оС в течение 32 суток. Рабочий объём герметичных склянок составил 200 мл, в котором содержалось 10 грамм свежего субстрата, 100 мл инокулята и 90 мл воды. Результаты выражены в виде средних значений плюс-минус стандартное отклонение (n= 3). Объем выхода газа определяли стандартными методами - по объёму вытесненной воды из мерных колб, погружённых открытой стороной в воду с NaCl. Количественное содержание CH4 и CO2, а также других газов определяли с использованием газового анализатора GA 2000 (KeisonProducts). Определение сухого вещества иорганического веще-стваопределяли стандартными методами [6]. Концентрацию общего аммонийного азота, как сумму ионизированного аммонийного азота и свободного аммиачного азота, определяли в жидкой фазе смеси путем дистилляции и поглощения в борной кислоте с последующим титрованием серной кислотой [6].
Таблица 1 - Параметры начала экспериментов. Анаэробные системы Ц_0 функционировали в отсутствие цеолитов, тогда как системы Ц_0.5 функционировали в присутствии цеолитов, 0.5 г, системы Ц_1.0 функционировали в присутствии цеолитов, 1.0 г
T-RFLP анализ (полиморфизм длин концевых ре-стрикционных фрагментов). Состав метаногенного-архейного сообщества анализировали в соответствии с T-RFLP профилями mcrA ампликонов после их расщепления ферментом рестрикции HaelII (NewEnglandBiolabs). Ген mcrA кодирует а-субъединицу метил-коэнзим М редуктазы и является метаболическим маркером метаногенеза [8]. Для начала тотальную ДНК экстрагировали из переработанного куриного помета с использованием FastDNASPINKitforsoil (MP BIOMEDICALS). Гены mcrA далее амплифицировали, используя 2*TaqMasterMix (NewEnglandBiolabs), а также универсальные праймеры mcrA-mlas (5'-GGT GGT GTM GGD TTC ACM CAR TA-3') и mcrA-rev-FAM (5'-CGT TCA TBG CGT AGT TVG GRT AGT-3'). По-
сле этого ампликоныгенов mcrA обрабатывали эн-донуклеазой рестрикции HaeIII. Полученные ДНК фрагменты очищали этанольным методом идалее анализировали на генетическом анализатореАВ1 3730 DNAAnalyzer (LifeTechnologies) как описано ранее [9]. Полученные T-RFLP-граммы обрабатывали с использованием пакета Rscript. T-RF фрагменты получали свой таксономический статус на основе данных клонирования генов mcrA , полученных в наших прежних работах [10, 11]. Результаты T-RFLP анализа на диаграммах выражены в виде средних значений плюс-минус стандартное отклонение (n=5).
Сканирующая электронная микроскопия (СЭМ). Для визуализации иммобилизации бактерий и архей на поверхности цеолитов последние были отобраны и проанализированы в конце экспериментального периода. Подготовку образцов проводили как описано ранее [12]. Вкратце, образцы фиксировали в растворе глутаральдегида (2.5% в 0.1 М фосфатном буфере, рН 7.2) и инкубировали в течение ночи при +4оС. После добавления цеолитов в фосфатно-солевой буферный раствор на 15 мин они промывались деионизированной водой трираза. Дегидратация клеток микроорганизмов далее проводилась поэтапно с использованием серии водно-этанольных растворов (30%, 50%, 70%, 80% и 96%). После покрытия золотом/палладием образцы анализировали на универсальном аналитическом комплексе сканирующей автоэмиссионной электронной микроскопии Merlin (CarlZeiss). Изображения высокого разрешения получали при ускоряющем напряжении 5 кВ и рабочем расстоянии 11-12 мм. СЭМ была выполнена в Междисциплинарном центре «Аналитическая микроскопия» Казанского федерального университета.
Результаты и их обсуждения
Куриный помет был подвергнут анаэробной конверсии в бэтч-тестах, в рамках которых определяется максимально возможное количество образующегося газа из определенного субстрата. Изначальный выход газа из всех анаэробных систем был одинаковым, однако с 10-12 суток наблюдалась разница в средней суточной продукции газа (рис. 1). Так, повышенный и ускоренный выход газа наблюдался в экспериментах с цеолитами (в особенности при исходной концентрации последних 1 гна 200 мл перерабатываемой смеси). Продукция газа сохранялась вплоть до 22-27 суток, после чего общий выход газа из анаэробных систем значительно понизился. В результате проведенных экспериментов было получено около 3750 мл газа в случае экспериментов с цеолитами, тогда как в их отсутствие выход газа отличался и составил 3550 мл. Содержание метана и диоксид углерода в выделяемом газе представлено на рисунке 2, из которого видно, что в присутствии цеолитов концентрация метана выше (69-73%), чем в его отсутствие (64-68%). Результаты проведенных экспериментов показали ускоренный и повышенный общий выход газа сболее высоким содержанием метана из анаэробных систем, в которых присут-
Параметры Куриный Иноку-лят Вода Общее
помет
Общий вес, г 10 100 90 200
Сухое веще- 7.45 ± 4.48 ± 0 11.93 ±
ство, г 0.01 0.01 0.02
Органическое 6.40 ± 3.13 ± 0 9.53 ±
вещество, г 0.01 0.01 0.02
МН4+-Ы", г 0.07 ± 0.67 ± 0 0.74 ±
0.02 0.03 0.05
ствовали цеолиты в различных концентрациях (рис. 1 и 2).
Рис. 1 - Средний общий выход газа из анаэробных систем (Ц_0 - в отсутствие цеолитов; Ц_0.5 - в присутствии цеолитов, 0.5 г; Ц_1.0 - в присутствии цеолитов, 1.0 г)
Рис. 2 - Содержание метана и диоксид углерода в выделяемом газе (Ц_0 - в отсутствие цеолитов; Ц_0.5 - в присутствии цеолитов, 0.5 г; Ц_1.0 -в присутствии цеолитов, 1.0 г)
Содержание аммонийного азота измерялидва раза - до начала серии экспериментов, а также после их завершения. Содержание аммонийного азота в перерабатываемой смеси до начала экспериментов составило 3.7 г/л (таблица 1). В конце экспериментов содержание аммонийного азота увеличилось и оказалось наиболее низким в системах с цеолитами в самой высокой концентрации(4.81 г/л МН4+-Ы), тогда как в контрольном реакторе МН4+-Ы накапливалось 5.21 г/л (табл. 2). Аккумуляция ионов аммония и аммиака в экспериментальных системах протекала в результате деструкции мочевой кислоты и остаточных белков, входивших в состав отходов птицеводства.
Несмотря на разницу в содержании МН4+-Ы в различных системах на конец эксперимента, удаление МН4+-Ы цеолитами все же оказалось незначительным. Когда цеолиты были добавлены в наши анаэробные системы, онибыли погружены на дно реакторов. Таким образом, возможно, цеолитам оказалось сложно вступать в контакт с ионами аммония и аммиаком в жидкости [13]. Кроме того, пониженное удаление ионов аммония из наших систем также можно объяснить невысокими концентрациями цеолитов, примененных в нашей работе. Однако, несмотря на невысокое удаление МН4+-Ы цеолитами, применение последних привело к повышенной выработке газа, так как
темпы продукции и конечный общий выход газа из реакторов с цеолитами оказалисьвыше, чем в контрольных реакторах.
Таблица 2 - Концентрация NH4+-N в анаэробных системах на конец экспериментального периода
Эксперименты NH4+-N, г/л
Ц 0 5.21 ± 0.14
Ц 0.5 4.90 ± 0.04
Ц 1.0 4.81 ± 0.07
Определение структуры метаногенных консорциумов в трех анаэробных системах осуществляли путем T-RFLP анализа на 32 сутки экспериментов (рис. 3). Так, среди метаногенных сообществ преобладали представители рода Methanosarcina (до 6270%). Среди других филотипов - Methanoculleus(12-14%) и Methanobacterium (12-18%) - оказались заметными. Применение данного метода позволило установить важность метаноархеймиксотрофного рода Methanosarcina, а также метаногенов гидрогенотрофных родов Methanoculleus и Methanobacterium в конверсии отходов птицеводства в условиях высокой концентрации ионов аммония.
Ф 70%
30%--
— -ь
■
1Ь
Ц_0
□ Methanosarcina
Ц_0.5 Ц_1.0
■ Methanoculleus 'Methanobacterium »Остальные
Рис. 3 - Состав метаногенного сообщества в соответствии с T-RFLP профилями тсгАамплико-нов после их расщепления HaeIII (Ц_0 - в отсутствие цеолитов; Ц_0.5 - в присутствии цеолитов, 0.5 г; Ц_1.0 - в присутствии цеолитов, 1.0 г)
С целью обнаружения иммобилизации микроорганизмов на поверхности алюмосиликатных минералов цеолиты по окончании экспериментального периода были отобраны из анаэробныхсистем и проанализированы с использованием сканирующей электронной микроскопии (рис. 4). Так, сканирующая электронная микроскопия позволила обнаружить способность некоторых участников микробных сообществ анаэробных систем к иммобилизациина поверхности алюмосиликатных минералов. Микроорганизмы, иммобилизованные на поверхности протестированных минералов, были представлены как клетками палочковидной формы, так и коккоиднойформы (последние на изображении не представлены). Полученные результаты демонстрируют способность протестированных цеолитов выступать в роли агентов для иммобилизации анаэробных микроорганизмов, что, по-видимому, положительно отразилось на конверсии и конечном выходе газа из органических отходов птицеводства в экспериментах с внесением алюмосили-катных минералов.
Рис. 4 - СЭМ изображение поверхности цеолитов с анаэробными микроорганизмами (Ц_1.0 - в присутствии цеолитов, 1.0 г). Длина шкалы: 1 цм
Влияние различных типов цеолитов и их различных концентраций на анаэробную конверсию органических отходов с высоким содержанием NH4+-N также было исследовано рядом других авторов. В работе Milan с сотрудниками [14] было показано, что конверсия отходов свиноводства, богатых аммонием, при 27-30oC оказалась более эффективной при добавлении природных цеолитов в концентрациях 2-4 г/л, однако ингибировалась при концентрациях, превышающих 6 г/л. Согласно другой работе [15], цеолиты в дозах 510 г/л в бэтч-тестах стимулировали деструкцию органического вещества и увеличение выхода метана при мезофильной анаэробной конверсии птичьего помета. Кроме этого, ранее также было показано [16], что термофильная конверсия отходов свиноводства была выше в бэтч-тестах в присутствии природных цеолитов при используемых концентрациях в диапазоне от 8 до 12 г/л.
Природные цеолиты также эффективно были испытаны в качестве среды для иммобилизации микроорганизмов в анаэробных реакторах с неподвижным слоем, а также для снижения ингибирующего эффекта выделяемого аммиака на микроорганизмы [17]. В другой работе [13] иммобилизация микроорганизмов на поверхности неподвижных цеолитов способствовала эффективной анаэробной трансформации органических отходов свиноводческого комплекса в биометан, а также устойчивости микробов к высокому уровню накапливаемого аммиака.
Таким образом, мы предполагаем, что положительный эффект влияния цеолитов в наших экспериментальных системах заключается в предоставлении дополнительной поверхностной площади для иммобилизации микроорганизмов (бактерий и архей), вовлеченных в анаэробную конверсию куриного помёта, в способности цеолитов к катионному обмену, а так-
же в частичном удалении ингибирующих концентраций аммония и аммиака. Полученные адаптированные микробные сообщества могут быть использованы в качестве потенциального восстановительного агента в промышленных условиях при нарушении анаэробного процесса в результате аккумуляции ингибирующих процесс соединений, в частности повышенных концентраций ионов аммония и аммиака.
Исследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ в рамках научного проекта № «16-34-60093мол_а_дк».
Литература
1. P. Weiland, Appl. Microbiol. Biotechnol., 85, 849-860 (2010)
2. R.C. Mazareli, R.M. Duda, V.D. Leite, R.A. Oliveira, Waste Manage., 52, 112-121 (2016)
3. P.D. Jensen, C.M. Mehta, C. Carney, D.J. Batstone, Waste Manage., 51, 72-80 (2016)
4. Q. Niu, W. Qiao, H. Qiang, T. Hojo, Y.-Y. Li, Bioresour. Technol., 137, 358-367 (2013)
5. Q. Niu, W. Qiao, H. Qiang, Y.-Y. Li, Bioresour. Technol., 146, 223-233 (2013)
6. E.E. Ziganshina, D.E. Belostotskiy, O.N. Ilinskaya, E.A. Boulygina, T.V.Grigoryeva, A.M. Ziganshin, Microb. Ecol., 70, 948-960 (2015)
7. I.A.Fotidis, P.G.Kougias, I.D.Zaganas, T.A.Kotsopoulos, G.G.Martzopoulos, Environ. Technol., 35, 1219-1225 (2014)
8. L.M. Steinberg, J.M. Regan, Appl. Environ. Microbi-ol.,75, 4435-4442 (2009)
9. A.M. Ziganshin, E.E. Ziganshina, J. Proter, S. Kleinsteuber, O.N. Il'inskaya, Acta Nat., 4, 91-97 (2012)
10. E.E. Ziganshina, D.E. Belostotskiy, R.V. Shushlyaev, V.A. Miluykov, P.Y. Vankov, A.M. Ziganshin, J. Microbiol. Biotechnol., 24, 1464-1472 (2014)
11. A.M. Ziganshin, T. Schmidt, Z. Lv, J. Liebetrau, H.H. Richnow, S. Kleinsteuber, M. Nikolausz, Bioresour. Technol., 217, 62-71 (2016)
12. I.V. Khilyas, A.M. Ziganshin, A.J. Pannier, R. Gerlach, Biodegradation, 24, 631-644 (2013)
13. Q. Wang, Y. Yang, C. Yu, H. Huang, M. Kim, C. Feng, Z. Zhang, Bioresour. Technol., 102, 7064-7068 (2011)
14. Z. Milan, E. Sanchez, P. Weiland, R. Borja, A. Martin, K. Ilangovan, Bioresour. Technol., 80, 37-43 (2001)
15. P.G. Kougias, I.A. Fotidis, I.D. Zaganas, T.A. Kotsopou-los, G.G. Martzopoulos, Int. Agrophys., 27, 169-173 (2013)
16. T.A. Kotsopoulos, X. Karamanlis, D. Dotas, G.G. Martzopoulos, Biosystems Eng., 99, 105-111 (2008)
17. S. Nikolaeva, E. Sanchez, R. Borja, F. Raposo, M.F. Col-menarejo, S. Montalvo, A.M. Jimenez-Rodriguez, J. Environ. Sci. Health A Tox. Hazard. Subst. Environ. Eng.,44, 146-154 (2009)
© С. И. Мирзиев - асп. каф. микробиологии КФУ, mirziev.samat@yandex.ru;,n. Е. Белостоцкий - к.т.н., н.с. технологической лаборатории ИОФХ КНЦ РАН, d.belostotskiy@gmail.com; В. А. Милюков - д.х.н., зав. технологической лабораторией ИОФХ КНЦ РАН, miluykov@iopc.ru; В. Г. Евтюгин - к.б.н., гл. инж. Междисциплинарного центра «Аналитическая микроскопия» КФУ, VGEvtjugin@kpfu.ru; А. М. Зиганшин - д.б.н., в.н.с. каф. микробиологии КФУ, a.ziganshin06@fulbrightmail.org.
© S. 1 Mirziev - postgraduate student, Department of microbiology, KFU, mirziev.samat@yandex.ru; D. E. Belostotskiy - candidate of science in technology, scientist, Technological laboratory, IOPCKSCRAS, d.belostotskiy@gmail.com; V. A. Miluykov - doctor of science inchemistry, head of the Technological laboratory, IOPCKSCRAS, miluykov@iopc.ru; V. G. Evtjugin - candidate of science inbiology, chief engineer, Interdisciplinary Centre for Analytical Microscopy, KFU, VGEvtjugin@kpfu.ru; A. M. Ziganshin- doctor of science inbiology, leadingresearcher, Department of microbiology, KFU, a.ziganshin06@fulbrightmail.org.
