CC BY
157
УДК 579
Динамика развития метаногенного сообщества в процессе анаэробной утилизации отходов агропромышленного комплекса
А. М. Зиганшин1*, Э. Э. Зиганшина1, С. Кляйнштаубер2, Ю. Протер3, О. Н. Ильинская1 'Казанский (Приволжский) федеральный университет, 420008, Казань, ул. Кремлевская, 18, Россия
2Институт им. Гельмгольца по исследованию окружающей среды, 04318, Лейпциг,
Permoser str. 15, Германия
3Немецкий центр исследования биомассы, 04347, Лейпциг, Тогдаиег str. 116, Германия *E-mail: [email protected] Поступила в редакцию 08.08.2012
РЕФЕРАТ С использованием анализа полиморфизма длин концевых рестрикционных фрагментов архейных генов 16S рРНК (T-RFLP-анализа) изучены метаногенные археи, участвующие в анаэробном разложении навоза крупного рогатого скота и соломы кукурузы. Оценены биологическое разнообразие и динамика развития метаногенных сообществ, участвующих в анаэробной деструкции органических отходов агропромышленного комплекса с образованием биогаза в лабораторных установках. T-RFLP-анализ в сочетании с созданием библиотек клонов архейных генов 16S рРНК показал, что метаногенный консорциум в основном состоял из представителей родов Methanosarcina и МеЛапоспЫеш с доминированием Methanosarcina spp. на протяжении всего эксперимента.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА архейные гены 16S рРНК, T-RFLP-анализ, продукция биогаза, метаногены.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ T-RFLP -анализ - анализ полиморфизма длин концевых рестрикционных фрагментов; ОТЕ - операционная таксономическая единица; КРС - крупный рогатый скот; оСВ - органическое сухое вещество.
ВВЕДЕНИЕ
Одним из эффективных методов, ведущих к снижению отрицательного влияния отходов сельского хозяйства и перерабатывающей промышленности на окружающую среду, является их обработка в анаэробных условиях. Анаэробная переработка отходов сопровождается деструкцией значительной части органических компонентов и продукцией возобновляемого источника энергии - биогаза, состоящего из метана (50-75%) и углекислого газа (25-50%) с незначительными примесями. В отличие от биоэтанола и биодизеля, производимых в основном из энергетических сортов растений, биогаз получают при утилизации остаточной биомассы и различных органических отходов [1-7]. К таким отходам относится, в частности, навоз крупного рогатого скота (КРС). Однако из-за низкой биоразлагаемости утилизация навоза в анаэробных реакторах отличается незначительным выходом биогаза. Совместная анаэробная утилизация навоза и растительной биомассы способствует ускорению гидролиза субстрата и оптимизации распределения питательных веществ в биореак-
торе, что активирует рост микроорганизмов и выход биометана [8, 9]. В последние годы одновременная биодеградация нескольких различных субстратов интенсивно изучается [9-13].
Первые три стадии анаэробной деструкции комплексного субстрата - гидролиз, ацидогенез и ацетогенез - ведут бактериальные сообщества, четвертую стадию осуществляет группа ацетокла-стических и гидрогенотрофных метаногенов, которые поглощают ацетат, молекулярный водород, углекислый газ и выделяют метан [1, 6, 14]. Независимо от режима сбраживания (психро-, мезо- или термофильного), а также состава субстрата доминирующими участниками метаногенеза являются представители МеШапотюгоЫа^ и/или Methanosarcmales [2, 5, 7, 15-18]. Однако данные об изменениях структуры микробных ассоциаций в ходе метаногенной ферментации весьма скудны.
Настоящая работа посвящена изучению путей утилизации отходов сельского хозяйства - навоза и кукурузной соломы - с образованием биогаза в лабораторных биогазовых реакторах, а также исследо-
ванию разнообразия, структуры и динамики метаногенных сообществ, участвующих в данном процессе, с применением современных методов молекулярной биологии. Определение состава и динамики микробных сообществ биогазовых реакторов совместно с анализом деструкции субстрата направлено на выявление возможностей интенсификации анаэробного процесса. Использование универсального филогенетического маркера 16S рРНК, функциональных генов-маркеров и T-RFLP-анализа (Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism, или полиморфизм длин концевых рестрикционных фрагментов) [19, 20] внесет вклад в установление состава и временных изменений микробного консорциума.
экспериментальная часть
Параметры биореакторов
В табл. 1 представлены основные технологические параметры анаэробной переработки навоза КРС и соломы кукурузы. Во всех биореакторах поддерживали мезофильный режим (38°С). В качестве субстрата для биореакторов R 4.13 и R 4.14 использовали навоз КРС и солому кукурузы, тогда как для биореакторов R 4.15 и R 4.16 - навоз КРС и экструдированную солому кукурузы. Внесение новой порции субстрата и выгрузку переработанной смеси проводили ежедневно; количество перерабатываемого субстрата поддерживали на уровне 30 л; время пребывания субстрата в реакторах составляло 35 сут. Выход биогаза, его состав и pH измеряли каждый день, тогда как концентрацию органических кислот и ионов аммония - 2 раза в неделю.
Аналитические методы
Продукцию биогаза измеряли с использованием барабанного газового счетчика RitterTG 05 («Bochum», Германия); состав биогаза определяли с использованием инфракрасного газового анализатора GA 94 («Ansyco», Германия). Концентрацию ионов аммония определяли после окрашивания жидкой фазы содержимого биореакторов реагентом Несслера, образцы далее анализировали с использованием спектрофотометра DR/2000 («HachCompany», США) при 425 нм. Общую концентрацию органических кислот измеряли титрованием 0.025-0.1 М раствором серной кислоты в диапазоне pH от 4.5 до 3.5 с помощью титратора TitrationExcellence T 90 («Mettler-Toledo», Швейцария). Летучие органические кислоты анализировали на газовом хроматографе 5890 seriesIIGC («Hewlett Packard», США), оснащенном автоматическим пробоотборником HS40 («Perkin Elmer», США) и колонкой Agilent HP-FFAP (30 м х 0.32 мм х 0.25 мкм), в соответствии с нашей прежней работой [7].
Экстракция и очистка суммарной ДНК
Образцы из четырех реакторов отбирали раз в месяц и сразу же использовали для экстракции и очистки ДНК. Биомассу переработанной смеси осаждали центрифугированием при 20000 g в течение 10 мин. Далее суммарную ДНК экстрагировали и очищали с использованием FastDNASPIN Kit for soil («Qbiogene», Германия) согласно инструкции производителя. Общее количество выделенной и очищенной ДНК оценивали с использованием УФ-видимого спектрофотометра NanoDrop ND-1000 («PeqLab», Германия).
Амплификация, клонирование и секвенирование генов 16S рРНК архей
Все молекулярные манипуляции были проведены согласно нашей ранней публикации [7]. Гены 16S рРНК архей амплифицировали с помощью ПЦР с суммарной ДНК в термоциклере DNA Engine Tetrad 2 Peltier Thermal Cycler («Bio-Rad»), используя комбинацию универсальных праймеров UniArc21F (5'-TTCYGKTTGATCCYGSCRG-3') и UniArc931R (5'-CCCGCCAATTCCTTTHAG-3') и 2 х TaqMasterMix («Qiagen», Германия). Состав реакционной смеси: 6 мкл 2 х TaqMasterMix, 0.5 мкл UniArc21F (5 пмоль/мкл), 0.5 мкл UniArc931R (5 пмоль/мкл), 4 мкл H2O и 1 мкл в 100 раз разбавленной ДНК (эквивалентно 1-3 нг). Реакцию амплификации начинали с денатурации при 95°c в течение 5 мин, затем проводили 35 циклов: денатурация при 94°c в течение 1 мин, отжиг при 54°c в течение 1 мин и элонгация при 72°c в течение 2 мин. Конечную элонгацию проводили при 72°c в течение 20 мин.
ПЦР-продукты очищали с использованием QIAGEN PcR Purification Kit и клонировали с использованием QIAGEN PCR Cloning Kit («QIAGEN», Германия). После клонирования генов 16S рРНК архей проанализировали наличие вставки нужного размера в позитивных клонах с использованием вектор-специфичных праймеров M13uni(-21) (5'-TGTAAAACGACGGCCAGT-3') и M13rev(-29) (5'-CAGGAAACAGCTATGACC-3'). Далее М13-ампликоны в количестве 1 мкл обрабатывали эндонуклеазой HaeIII («New England Biolabs», Германия) и разделяли электрофоретически в гелях Phor-агарозы («Biozym», Германия). Длины рестрикционных фрагментов анализировали при помощи программ Phoretix™ 1D Database Version 2.00 и PhoretixTM 1D Advanced Version 5.20 («Nonlinear Dynamics», Великобритания), клоны объединяли в кластеры и строили дендограммы. Репрезентативные клоны из больших кластеров отбирали для последующего определения их нуклеотидных последовательностей.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ Таблица 1. Основные технологические параметры анаэробной переработки навоза КРС и кукурузной соломы
Реак- тор* Нагрузка по органике**, ГоСВ СУТ-1 Состав субстрата, г сут 1 Выход биогаза при н.у., Л гЛсВ Состав биогаза pH Органические кислоты, г л-1 nh4+-n, г л-1
навоз КРС солома сумма*** CH. % CO2, % H2S, м.д.
R 4.13 74.1 723.6 28.2 857 0.40 58.7 40.2 3450 7.63 1.49 1.20
71.2 518.7 26.3 857 0.36 59.8 38.7 2216 7.50 1.90 1.24
71.7 694.6 26.3 857 0.33 55.6 42.9 2145 7.61 1.80 1.16
R 4.14 74.1 723.6 28.2 857 0.40 59.3 39.8 4183 7.66 1.42 1.22
71.2 518.7 26.3 857 0.38 58.4 40.2 1928 7.53 1.66 1.28
71.7 694.6 26.3 857 0.37 56.7 42.1 2092 7.58 1.43 1.31
R 4.15 72.1 723.6 83.7 857 0.39 58.1 41.1 ~5000 7.75 1.54 1.47
68.6 518.7 78.1 857 0.39 59.3 39.2 2234 7.56 1.28 1.39
69.1 694.6 78.1 857 0.39 56.8 42.6 2373 7.74 1.37 1.26
R 4.16 72.1 723.6 83.7 857 0.41 58.6 40.6 4558 7.76 1.51 1.54
68.6 518.7 78.1 857 0.38 59.0 40.1 2056 7.54 1.53 1.36
69.1 694.6 78.1 857 0.39 57.2 41.5 3155 7.61 1.37 1.27
* Параметры биореакторов представлены в трех точках отбора проб, когда метаногенные сообщества были проанализированы (за исключением выхода биогаза, состава биогаза и рН, данные которых представлены как средние значения за 1 нед.).
** Органическое сухое вещество.
*** Вода добавлена до конечной концентрации 857 мл сут-1.
ПЦР-продукты репрезентативных клонов очищали с использованием Promega PCR Purification Kit («Promega», США). Нуклеотидные последовательности генов 16S рРНК определяли с применением набора реактивов BigDye™ Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit 1.1 на автоматическом секвенаторе ABIPRISM 3100 Genetic Analyzer («Applied Biosystems»). В качестве разделительной матрицы использовали полимер POP-6TM. Программу BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) [21] далее применяли для поиска сходных нуклеотидных последовательностей в базе данных GenBank. Ribosomal Database Project (http://rdp.cme.msu.edu) [22] использовали для определения таксономической принадлежности микроорганизмов.
T-RFLP -анализ
T-RFLP-анализ проводили в соответствии с нашей предыдущей работой [7]. С этой целью гены
16S рРНК архей амплифицировали с использованием пары универсальных праймеров UniArc21F-FAM и UniArc931R и 2 х TaqMasterMix («Qiagen», Германия). Параметры ПЦР-реакции указаны выше. UniArc21F-FAM (прямой праймер) помечен флуорофором FAM (phosphoramidite fluorochrome-5-carboxyfluorescein) на 5'-конце. Ампликоны архейных генов 16S рРНК, содержащие флуорофор FAM, очищали с использованием набора SureCleanPlus («Bioline», Германия), далее обрабатывали рестриктазами MseI и HaelII («New England Biolabs», Германия). После 16-часовой инкубации при 37oC фрагменты ДНК осаждали 3 М ацетатом натрия (pH 5.5) и абсолютным этанолом. После удаления супернатанта осадок высушивали в вакууме и подсушенные фрагменты ДНК ресуспендировали в растворе, содержащем 10 мкл Hi-Di-формамида и 0.25 мкл GeneScan™ -500 ROX™STANDARD или MapMarker® 1000 (наборы стандартов определенного размера). Пробы де-
Таблица 2. Результаты секвенирования клонированных генов 16Б рРНК архей и экспериментально полученные концевые рестрикционные фрагменты (T-RF)
Клон, п.н. Ближайший представитель (номер в базе данных GenBank) / процент совпадения Таксономическая принадлежность в соответствии с RDP 10 MseI-T-RF, п.н. HaeIII- T-RF, п.н.
ar_B9 (863) Uncultured archaeon clone: FA69 (AB494258) / 99% Methanoculleus sp. 37 67
ar_A1 (864) Uncultured Methanoculleus sp. clone: DMMR219 (HM218939) / 99% Methanoculleus sp. 36 67
ОТЕ 1 Methanoculleus sp. I 36/37 67
ar_A2 (863) Uncultured archaeon clone: MTSArc_G8 (EU591664) / 99% Methanoculleus sp. 499 67
ОТЕ 2 Methanoculleus sp. II 499 67
ar_E12 (864) Uncultured archaeon clone: WA50 (AB494245) / 100% Methanocorpusculum sp. 97 241
ОТЕ 3 Methanocorpusculum sp. 97 241
ar_E10 (567) Uncultured euryarchaeote clone: B35_F_A_A05 (EF552199) / 99% Methanosarcina sp. 557 220
ar_H2 (873) Uncultured euryarchaeote clone: B35_F_A_A05 (EF552199) / 99% Methanosarcina sp. 557 220
ОТЕ 4 Methanosarcina sp. I 557 220
ar_E6 (873) Uncultured archaeon clone: SA42 (AB494252) / 99% Methanosarcina sp. 859 220
ar_F10 (873) Uncultured archaeon clone: SA42 (AB494252) / 99% Methanosarcina sp. 858 220
ОТЕ5 Methanosarcina sp. II 858/859 220
ar_G8 (874) Uncultured archaeon clone: SA42 (AB494252) / 99% Methanosarcina sp. 877 220
ОТЕ6 Methanosarcina sp. III 877 220
натурировали при 95°С в течение 5 мин, охлаждали на льду (примерно 5 мин) и анализировали на генетическом анализаторе ABIPRISM 3100 Genetic Analyzer («Applied Biosystems»). В качестве разделительной матрицы использовали полимер POP-6™. Полученные T-RFLP-граммы анализировали при помощи программы GeneMapper Version 3.7 («Applied Biosystems»). Теоретические T-RF-значения репрезентативных филотипов, представленных в библиотеке клонов, были оценены программой NEBcutter Version 2.0 (http://tools.neb.com/NEBcutter2) и подтверждены экспериментально T-RFLP-анализом соответствующих клонов.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Использование альтернативных возобновляемых источников энергии, в частности различных видов органических отходов, является необходимой составляю-
щей «зеленых технологий» производства биотоплива [1]. В настоящей работе с целью анализа динамики развития метаногенных ассоциаций проведена анаэробная конверсия навоза и соломы кукурузы в модельных мезофильных биореакторах.
В табл. 1 представлены основные технологические параметры анаэробного разложения органических субстратов сельского хозяйства. Анаэробную деструкцию биомассы проводили в четырех лабораторных ферментерах с рабочей емкостью 30 л при 38оС. В реакторах И 4.13 и И 4.14 проводили совместную ферментацию следующих субстратов - навоза КРС и соломы кукурузы, а в реакторах И 4.15 и И 4.16 анаэробному разложению подвергали навоз и экструдированную солому кукурузы. Нагрузка по органике для реакторов И 4.13 и И 4.14 варьировала в диапазоне 71.2-74.1 гоСВ сут-1 (органическое сухое вещество), в то время как для реакторов И 4.15
100 90 80 70 60 % 50 40 30 20 10 0
Methanosarcina sp. III Methanosarcina sp. II 849п.н.
■ 816п.н.
■ 565п.н.
Methanosarcina sp. I Methanoculleus sp. II
■ 336п.н.
■ 335п.н.
326п.н.
■ 315п.н.
■ 285п.н.
■ 210п.н.
■ 207п.н.
■ 205п.н.
■ 191 п.н.
■ 189п.н.
■ 119п.н. Methanocorpusculum sp.
■ 84п.н.
■ 51п.н.
Methanoculleus sp. I
Рис. 1. Динамика развития метаногенного сообщества в ферментерах R 4.13 и R 4.14 на основе T-RFLP-анализа (после обработки ампли-конов генов 16Б рРНК ферментом MseI)
R 4.13-Т1 R 4.13-Т2 R 4.13-Т3 R 4.14-Т1 R 4.14-Т2 R 4.14-Т3
и И 4.16 общая нагрузка по органике была ниже и составила 68.6-72.1 гоСВ сут-1. На протяжении всего эксперимента время пребывания субстрата в реакторах составляло 35 дней. В зависимости от вносимого органического вещества выход биогаза из анализируемых ферментеров варьировал в диапазоне от 0.33 до 0.41 л г-1оСВ с содержанием метана 56-60%. Как видно из табл. 1, во всех биореакторах значения рН поддерживали на уровне ~7.5-7.8, количество органических кислот - в диапазоне ~1.3—1.9 г л-1, а концентрацию ионов аммония - в пределах ~1.2—1.5 г л-1. Эти параметры благоприятны для процесса метано-генеза [23].
С помощью амплификации, клонирования, рестрикционных анализов и секвенирования генов 16S рРНК архей, полученных из суммарной ДНК содержимого биореакторов, проведена оценка биологического разнообразия и динамики метаногенных сообществ, участвующих в анаэробной деструкции органических отходов агропромышленного комплекса - навоза КРС и соломы кукурузы. Определение структуры метаногенной ассоциации осуществляли в трех точках отбора проб с интервалом отбора 1 мес.
Амплификация, клонирование, секвенирование генов 16S рРНК, а также T-RFLP-анализ выявили относительно большое разнообразие представителей
архей в реакторах. При проведении T-RFLP-анализа ампликоны генов 16S рРНК архей, содержащие флу-орофор FAM, обрабатывали эндонуклеазами MseI и НаеІІІ. Принадлежность пиков на общей T-RFLP-грамме к определенным филогенетическим группам микроорганизмов определяли по длине соответствующих концевых рестрикционных фрагментов (T-RF) генов 16S рРНК клонов. В общей сложности из кло-нотеки были отобраны девять клонов для определения их нуклеотидных последовательностей. Эти клоны были сгруппированы в шесть операционных таксономических единиц (ОТЕ) на основе длин T-RF (табл. 2). При определении таксономической принадлежности три филотипа отнесли к порядку МеШапо-тісгоЬіа^ (ОТЕ 1, ОТЕ 2, ОТЕ 3) и три - к порядку Methanosarcmales (ОТЕ 4, ОТЕ 5, ОТЕ 6). С помощью T-RFLP-анализа генов 16S рРНК с использованием рестриктазы MseI в ферментерах выявлено до 22 различных T-RF-профилей (с встречаемостью более 1%). Поскольку основные T-RF в реакторах были идентифицированы, мы определили метаноге-ны, играющие ключевую роль в продукции биогаза (табл. 2).
На рис. 1 представлено распределение групп ме-таногенов (динамика развития сообщества) в ходе анаэробной деструкции навоза и соломы ^ 4.13 и R 4.14). Это распределение получено на основе про-
90
80
70
60
% 50
40
30
20
Mefhanosarcina sp. III Mefhanosarcina sp. II 850п.н.
849п.н.
Mefhanosarcina sp. I Mefhanoculleus sp. II 336п.н.
335п.н.
314п.н.
207п.н.
205п.н.
191п.н.
189п.н.
Mefhanoculleus sp. I
Рис. 2.Динамика развития метаногенного сообщества в ферментерах R 4.15 и R 4.16 на основе T-RFLP-анализа (после обработки ампли-конов генов 16Б рРНК ферментом MseI)
R 4.15-Т1 R 4.15-Т2 R 4.15-Т3 R 4.16-Т1 R 4.16-Т2 R 4.16-Т3
филей MseI-рестрикции (результаты, полученные при использовании фермента НаеІІІ, не показаны). В первой отобранной пробе, когда нагрузка по органике составила 74.1 гоСВ сут-1, T-RFLP-анализ позволил выявить преобладание метаногенов рода Methanosarcina и гидрогенотрофных метаногенов рода Methanoculleus в архейном сообществе биореакторов Г 4.13 и Г 4.14. Так, общее соотношение представителей Methanosarcina sp. (ОТЕ 4, ОТЕ 5, ОТЕ 6) и Methanoculleus sp. (ОТЕ 1, ОТЕ 2) в реакторе Г 4.13 составило 65 и 15% от общих T-RF-площадей пиков соответственно. В реакторе Г 4.14 были идентифицированы метаногены Methanosarcina sp. и Methanocul-Ыш sp. - 75 и 9% соответственно. Другие представители архей с низкой встречаемостью (1-3%) были отнесены к минорным группам сообщества (рис. 1). Снижение вносимой органики до 71.2 гоСВ сут-1 и последующее ее увеличение до 71.7 гоСВ сут-1 привело к изменению состава микробного сообщества. Так, относительная частота встречаемости представителей рода Methanosarcina (ОТЕ 4, ОТЕ 5, ОТЕ 6) в двух следующих точках отбора проб составила 70/47 и 35/49% для Г 4.13 и Г 4.14 соответственно. Относительная частота встречаемости видов Methanocul-leus (ОТЕ 1, ОТЕ 2) в Г 4.13 и Г 4.14 составила 8/31 и 9/32% соответственно (две следующие точки отбора проб). Среди минорных ассоциаций обнаружены
и представители гидрогенотрофных метаногенов, относящихся к роду Methanocorpusculum, однако на их долю приходилось менее 2% от общей площади T-RF-пиков. Кроме того, на T-RFLP-граммах обнаружен мажорный пик, соответствующий фрагменту длиной 336 п.н.; однако этого филотипа не было среди клонированных генов 16S рРНК архей и, следовательно, он был отнесен к неидентифицированной группе метаногенного сообщества.
Как видно из рис. 2, структура метаногенных ассоциаций биореакторов Г 4.15 и Г 4.16, утилизирующих навоз и экструдированную солому, также была представлена сходными группами, обнаруженными в Г 4.13 и Г 4.14. Нагрузка по органике в трех точках отбора проб для Г 4.15 и Г 4.16 составила 72.1, 68.6 и 69.1 гоСВ сут-1 соответственно. Преобладающими в сообществе ферментера Г 4.15 стали представители рода Methanosarcina (70, 54 и 63% встречаемости в трех точках отбора проб соответственно) и рода Methanoculleus (15, 25 и 25% встречаемости в трех точках отбора проб соответственно). Как и в реакторе Г 4.15, основными таксонами биореактора Г 4.16 были представители рода Methanosarcina (81, 69 и 51%), а также представители рода Methanoculleus (6, 17 и 28%). Как и в реакторах Г 4.13 и Г 4.14, отмечена высокая встречаемость T-RF-пика размером 336 п.н., однако таксономическая группа архей, соот-
0
ветствующая данному фрагменту рестрикционного профиля, не определена.
Полученные результаты обосновывают возможность эффективной совместной утилизации навоза и соломы кукурузы с получением биогаза. Нами установлено, что доминирующими представителями метаногенов на протяжении всего ферментационного процесса являются представители родов Metha-nosarcina и Methanoculleus. Кроме этого, впервые отслежена динамика метаногенного сообщества в ходе утилизации органических отходов. Микроорганизмы Methanoculleus sp. используют водород и диоксид углерода для роста и продуцируют метан [2], тогда как метаногены рода Methanosarcina в основном рас-
щепляют ацетат с образованием метана и диоксид углерода либо утилизируют водород, диоксид углерода и метилированные соединения с образованием метана [24]. По-видимому, повышенная концентрация органических кислот в реакторах подавляет представителей строго ацетокластического рода Metha-nosaeta и стимулирует развитие Methanosarcina spp. [14, 25]. •
Работа поддержана грантом Правительства Республики Татарстан «Алгарыш» (2010 г.) и стипендией совместной программы DAAD и Министерства образования и науки РФ (Программа «Михаил Ломоносов II», 2011 г.).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Antoni D., Zverlov V.V., Schwarz W.H. // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2007. V. 77. P. 23-35.
2. Krause L., Diaz N.N., Edwards R.A., Gartemann K.H., Krömeke H., Neuweger H., Pühler A., Runte K.J., Schlüter A., Stoye J., et al. // J. Biotechnol. 2008. V. 136. P. 91-101.
3. Ahn H.K., Smith M.C., Kondrad S.L., White J.W. // Appl. Biochem. Biotechnol. 2010. V. 160. P. 965-975.
4. Bedoya I.D., Arrieta A.A., Cadavid F.J. // Bioresour. Technol.
2009. V. 100. P. 6624-6629.
5. Goberna M., Insam H., Franke-Whittle I.H. // Appl. Environ. Microbiol. 2009. V. 75. P. 2566-2572.
6. Weiland P. // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2010. V. 85.
P. 849-860.
7. Ziganshin A.M., Schmidt T., Scholwin F., Il’inskaya O.N., Harms H., Kleinsteuber S. // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2011. V. 89. P. 2039-2052.
8. Holm-Nielsen J.B., Seadi T.A., Oleskowicz-Popiel P // Bioresour. Technol. 2009. V. 100. P. 5478-5484.
9. El-Mashad H.M., Zhang R. // Bioresour. Technol. 2010. V. 101. P. 4021-4028.
10. Gomez X., Moran A., Cuetos M.J., Sanchez M.E. // J. Power Sources. 2006. V. 157. P. 727-732.
11. Davidsson A., Lövstedt C., la Cour Jansen J., Gruvberger C., Aspegren H. // Waste Manage. 2008. V. 28. P. 986-992.
12. Fountoulakis M.S., Petousi I., Manios T. // Waste Manage.
2010. V. 10. P. 1849-1853.
13. Nayono S.E., Gallert C., Winter J. // Bioresour. Technol. 2010. V. 101. P. 6998-7004.
14. Demirel B., Scherer P. // Rev. Environ. Sci. Biotechnol. 2008. V. 7. P. 173-190.
15. O’Reilly J., Lee C., Collins G., Chinalia F., Mahony T., O’Flaherty V. // Water Res. 2009. V. 43. P. 3365-3374.
16. Kröber M., Bekel T., Diaz N.N., Goesmann A., Jaenicke S., Krause L., Miller D., Runte K.J., Viehöver P, Pühler A., Schlüter A. // J. Biotechnol. 2009. V. 142. P. 38-49.
17. Lee C., Kim J., Hwang K., O'Flaherty V., Hwang S. // Water Res. 2009. V. 43. P 157-165.
18. Nettmann E., Bergmann I., Pramschüfer S., Mundt K., Plogsties V., Herrmann C., Klocke M. // Appl. Environ. Microbiol. 2010. V. 76. P. 2540-2548.
19. Abdo Z., Schüette U.M., Bent S.J., Williams C.J., Forney L.J., Joyce P. // Environ. Microbiol. 2006. V. 8. P. 929-938.
20. Culman S.W., Bukowski R., Gauch H.G., Cadillo-Quiroz H., Buckley D.H. // BMC Bioinformatics. 2009. V. 10. P. 171-180.
21. Altschul S.F., Gish W., Miller W., Myers E.W., Lipman D.J. //
J. Mol. Biol. 1990. V. 215. P 403-410.
22. Wang Q., Garrity G.M., Tiedje J.M., Cole J.R. // Appl. Environ. Microbiol. 2007. V. 73. P 5261-5267.
23. Gerardi M.H. The microbiology of anaerobic digesters. Hoboken: Wiley-Interscience, 2003. 177 p.
24. Kendall M.M., Boone D.R. // The order Methanosarcinales. The Prokaryotes - a Handbook on the Biology of Bacteria. 3rd ed. / Eds Dworkin M., Falkow S., Rosenberg E., Schleifer K.H., Stackebrandt E. New York: Springer, 2006. P. 244-256.
25. Karakashev D., Batstone D.J., Angelidaki I. // Appl. Environ. Microbiol. 2005. V. 71. P. 331-338.
