CC BY
102
Вестник Совета молодых учёных и специалистов Челябинской области №3(10) 2015 27
УДК 504.064:57.084.5 ББК 26.23-28.080.1
ЭФФЕКТ ПЛОТНОСТИ КУЛЬТУРЫ ТЕСТ-ОБЪЕКТА В ПРИБОРНОМ БИОТЕСТИРОВАНИИ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ PARAMECIUMCAUDATUM
М.Г. МОСКВИЧЕВА, ФГБОУВПО ЧелГУ, г. Челябинск, Россия Д.Ю. НОХРИН, Уральский филиал ФГБНУ "ВНИИВСГЭ", г. Челябинск, Россия
e-mail: nokhrin8@mail.ru
Аннотация
С использованием прибора "Биотестер-2" и культуры инфузорий P. сaudatum оценена токсичность снегового покрова г. Челябинска и растворов нитрата кадмия в эксперименте. Показано, что при использовании плотности культуры свыше 300-500 клеток/мл распределение индекса токсичности Itox становится асимметричным, исчезает связь Itox с содержанием в пробах снега тяжёлых металлов, в эксперименте наблюдается рост Itox на сверхмалых концентрациях токсиканта. Рекомендуется продолжить исследование феномена.
Ключевые слова: биотестирование, Биотестер-2, инфузории, плотность культуры, методика.
Актуальность. Приборное биотестирование, распространившееся в нашей стране в начале 90-х годов, сочетает в себе точность и удобство аппаратных исследовательских методов с высокой чувствительностью, свойственной живым объектам [6]. Большую популярность в экологических, санитарно-эпидемиологических и ветеринарных службах получили методы, использующие в качестве тест-объекта различные виды инфузорий, а в качестве прибора - специализированный импульсный фотометр "Биотестер-2". Принцип
биотестирования с его использованием заключается в измерении реакции хемотаксиса инфузорий - способности избегать неблагоприятных концентраций химических веществ в окружающей среде. Поскольку по своим биохимическим параметрам инфузории очень близки к высшим животным и человеку, результаты такого биотестирования могут быть экстраполированы на человека [3].
В то время как прикладные экологические исследования по биотестированию с использованием инфузорий широко
распространены и многочисленны, работы, посвящённые его методологическим аспектам почти не встречаются.
Цель данной работы заключалась в демонстрации обнаруженного нами эффекта влияния плотности культуры инфузорий на результаты биотестирования с использованием фотометра "Биотестер-2".
Авторы благодарят А. Осинникова и к.г.-м.н. И.В. Грачёву за помощь на разных этапах работы.
Материал и методы исследования. Отбор проб снега на территории г. Челябинска был проведён в апреле 2006 г. сотрудниками НПТ "Прогноз". Пробы отбирались вдоль основных магистралей (с отступлением от полотна дороги не менее 50 м) и внутри жилых массивов с помощью цилиндра 0 200 мм на всю глубину снегового покрова. Пробы фасовались в полиэтиленовые мешки и транспортировались в лабораторию, где снег растапливался при комнатной температуре, а талая вода разливалась в пластиковые бутыли для последующего анализа.
Оценка токсичности 150 проб была проведена на специализированном фотометре "Биотестер-2" (ЦНТТМ "Квант", Санкт-Петербург, Россия) с использованием в качестве тест-объекта культуры инфузории-туфельки P. caudatum согласно методике [5]. Пробы анализировались в случайном порядке в 6 сериях определений, выполненных в разные дни с интервалом в несколько дней, необходимым для размножения культуры. Параллельно в лаборатории Уральского филиала ФГБНУ ВНИИВСГЭ были определены: рН проб, содержание взвешенных веществ и 13 элементов (Mg, Ca, Cr, Mn, Fe, Co, Ni, Cu, Zn, As, Sr, Cd, Pb).
В лабораторном эксперименте 2011 г. по оценке влияния рабочей концентрации
28 Вестник Совета молодых учёных и специалистов Челябинской области №3(10) 2015
культуры инфузорий на результаты
биотестирования использовались ГСО 7257-96 состава ионов хрома (водный раствор К2СГ2О7) и ГСО 7472-98 состава ионов кадмия (раствор Cd (NO3) 2 в азотной кислоте) производства ОАО "Уральский завод химических реактивов". Растворы токсикантов готовились на
дистиллированной воде, которая была выбрана ввиду сходства с атмосферными осадками по водородному показателю.
В ходе статистической обработки данных использовались: точечная и интервальная
оценка среднего значения, непараметрический корреляционный анализ по Спирмену,
двухфакторный дисперсионный анализ и интерполяция пространственных данных методом минимального искривления (minimum curvature). 95%-ный доверительный интервал (95% ДИ) для средних значений индекса токсичности рассчитывался в предположении нормальности распределения данного показателя, а 95% ДИ для доли токсичных проб - методом Клоппера - Пирсона. Расчёты и графические построения выполнены в пакетах KyPlot (v. 2.0 beta 15; [10] ) и Surfer (v. 9.11; Golden Software Inc.).
Результаты и обсуждение.
1. Оценка токсичности снегового покрова, сформировавшегося на территории г. Челябинска в зимний период 2005-2006 гг. В ходе разведения культуры парамеций было отмечено, что их двигательная активность может заметно изменятся во времени под действием неконтролируемых факторов. Поэтому, учитывая, что исследование было выполнено за 6 подходов, важным представлялось убедиться в сопоставимости результатов биотестирования в сериях определений. В ходе иерархического двухфакторного дисперсионного анализа (случайные факторы: "Серия" и "Проба внутри Серии") было установлено, что серии не различались статистически значимо по средним значениям индекса токсичности (/tox) проб: F [6/144] =1,70; p=0,126. Однако характер
распределения Itox в 6 сериях был различен (рис. 1 ): в исследованиях на невысоких
плотностях р культуры (серии 1, 3-5) оно было симметричным и по коэффициенту асимметрии (As=0,062) не отличалось от нормального (p=0,406), в то время как на более высоких плотностях (серии 2, 6) имело отчётливую отрицательную асимметрию (As= - 0,920;
p=0,0008). Следует пояснить, что отрицательные значения Itox получались для проб, в которые инфузории переходили более активно, чем в контрольную пробу (отстоянная и прокипячённая вода из водопровода г. Челябинска), т.е. пробы, демонстрировавшие положительный хемотаксис. Как видно из рис.1., на высоких плотностях культуры смещение распределения Itox в область отрицательных значений компенсировалось параллельным увеличением доли наиболее токсичных проб, что проявилось появлением дополнительной моды на гистограмме распределения в области Itox=0,5-0,75.
га -2 -1,5 -1 -0,5 0 0,5 1
5 30 г
С
■2 -1,5 -1 -0,5 0 0,5 1
Индекс токсичности
Рисунок 1. Гистограммы распределения
индексов токсичности проб снега, проанализированных с использованием разных концентраций культуры инфузорий
Таким образом, на первом этапе анализа был выявлен эффект влияния концентрации
инфузорий (плотности культуры) на результаты биотестирования. Поскольку на высокой и низкой плотностях оценивалась токсичность хоть и случайных, но разных проб, пока можно
Вестник Совета молодых учёных и специалистов Челябинской области №3(10) 2015 29
лишь несколько спекулятивно предполагать увеличение контраста хемотаксической реакции инфузорий при использовании плотности культуры 800 шт./мл и более. Тем не менее, учитывая существенные различия
распределений (критерий отношения правдоподобия G [8] =18,19; p=0,020), было
решено анализировать данные, полученные на низкой и высокой плотностях культуры раздельно.
В таблице 1 представлены результаты оценки корреляции Itox с показателями химического состава снега для материала, разделённого на 2 части.
Таблица 1
Связь между индексом токсичности и химическим составом снега в сериях определений с низкой и высокой плотностью культуры инфузорий: коэффициенты корреляции Спирмена rS и оценка значимости p____________________________________________________________________
Показатели Низкая плотность (n=84) Высокая плотность (n=66)
rS р rS р
pH 0,04 0,751 -0,04 0,751
Взвеси 0,11 0,310 0,00 0,994
Mg 0,20 0,074 0,10 0,408
Ca 0,27 0,013 0,05 0,715
Cr 0,23 0,037 0,07 0,565
Mn 0,19 0,081 -0,03 0,799
Fe 0,13 0,238 0,03 0,795
Co 0,04 0,722 -0,13 0,298
Ni 0,07 0,511 -0,14 0,249
Cu 0,06 0,576 -0,14 0,279
Zn 0,16 0,138 0,05 0,696
As 0,09 0,415 0,19 0,120
Sr 0,07 0,521 0,05 0,688
Cd 0,22 0,048 -0,11 0,396
Pb 0,15 0,182 -0,05 0,693
Видно, что в пробах, тестированных на культуре инфузорий невысокой плотности, были обнаружены 3 слабые (rS<0,30) но статистически значимые связи (Ca, Cr, Cd), а также 2 тенденции к связям (Mg, Mn). Во второй группе проб ни связей, ни тенденций выявить не удалось. Хотя само по себе наличие связей между токсичностью и содержанием исследованных веществ не является доказательством правильности результатов биотестирования (токсичность могли обеспечить не исследовавшиеся нами компоненты состава проб и/или сложные сочетания веществ), их полное отсутствие во второй группе на фоне отчётливого наличия в первой представлялось сомнительным. Поэтому было принято решение отказаться от результатов анализа, полученных на высоких плотностях культуры и рассматривать в дальнейшем только 84 пробы.
Величина Itox варьировала в 84 пробах от-0,71
до 0,89 и составила в среднем 0,12±0,037 (95% ДИ: 0,04 - 0,19). Согласно инструкции к прибору "Биотестер-2" среднее значение индекса токсичности попадает в категорию " нетоксично" . При этом доля проб категории "токсично" (Itox>0,35) составила 25,0% (95% ДИ: 16,2 - 35,6).
В ходе пространственной интерполяции значений индексов токсичности на территории г. Челябинска было выявлено 7 зон с Itox>0,5 (рис. 2). Вероятно, 3 из них не связаны непосредственно с деятельностью
многочисленных промышленных предприятий города и являются скорее результатом высокой автотранспортной нагрузки. Это - небольшая зона в северо-западной части города (выезд из города по Свердловскому тракту), в западной части (район пос. Градский прииск, Терема и Интернационалист) и в южной части (выезд из города по Троицкому тракту). Остальные 4 зоны имеют чёткую привязку к промышленным
30 Вестник Совета молодых учёных и специалистов Челябинской области №3(10) 2015
зонам города: 1) в северной части - зона влияния Челябинского металлургического комбината, 2) в восточной - промзона и зона влияния Челябинского
электрометаллургического комбината, ЖБИ-1 и ряда др. заводов, 3) в северо-западной - самая крупная промзона и зона влияния Челябинского цинкового завода, лакокрасочного завода, Челябвтормета, электровозоремонтного завода, Уральского дроболитейного завода и др. предприятий, 4) в юго-западной - промзона и зона влияния Челябинского асфальтного завода, завода минеральных плит, завода железобетонных шпал, щебёночных и др. предприятий.
Таким образом, в ходе биотестирования снегового покрова, сформировавшегося на территории города в зимний период 2005-2006 гг., хорошо интерпретируемые результаты (характер распределения, связи с содержанием в пробах металлов, привязка к промзонам) удалось получить при исключении из анализа проб, оцененных с использованием культуры инфузорий в концентрациях 800-1100 шт./мл. Учитывая, что методикой рекомендуется использовать концентрации порядка 500-1000 шт./мл, полученные данные о
неинформативности результатов
биотестирования на плотностях культуры свыше 800 клеток/мл следует признать отчасти противоречащими методике. Поэтому нами был спланирован и проведён специальный эксперимент по оценке влияния плотности культуры инфузорий на результаты биотестирования.
Вестник Совета молодых учёных и специалистов Челябинской области №3(10) 2015 31
Рисунок 2. Распределение значений индекса токсичности снега по территории г. Челябинска (интерполяция методом минимального искривления)
31
32 Вестник Совета молодых учёных и специалистов Челябинской области №3(10) 2015
2. Экспериментальная оценка влияния плотности культуры инфузорий на результаты биотестирования. Для
эксперимента были выбраны 2 элемента: хром и кадмий. Оба они токсичны для гидробионтов [2, 7] и обнаружили статистически значимую корреляцию с Лох снега в 2006 г (см. выше). Опыту предшествовал пилотный поиск области концентраций токсикантов, охватывающей диапазон от максимальной токсичности до её отсутствия.
Для растворов бихромата калия близкие к нулю и отрицательные значения индекса токсичности регистрировались вплоть до увеличения концентрации до 100 мг/дм в расчёте на Cr (5000 ПДКВР [7]), после чего пилотный опыт был прекращён. Таким образом, такой известный токсикант, мутаген и канцероген как шестивалентный хром не проявил токсических свойств в биотестировании с использованием реакции хемотаксиса инфузорий. Положительная хемотаксическая реакция парамеций к слабым растворам солей и кислот известна более века и была подробно изучена Дженнингсом и Робертсоном. В частности, эффект был обнаружен для солей сульфата меди, хлорида ртути, серной кислоты, соляной кислоты, уксусной и азотной кислот в низких концентрациях [8, 9]. Это в очередной раз доказывает несостоятельность суждений о степени биокондиции среды на основании результатов её оценки лишь одной тестсистемой и о необходимости использования батареи тестов. Что же касается связи Itox снега с содержанием в нём хрома в натурных исследованиях 2006 г., то она не является простой. Её возникновение можно объяснить иной формой нахождения хрома в талом снеге (например, в виде ионов Cr ) или его вхождением в паттерн токсикантов, обладающих выраженным острым токсическим эффектом.
Результаты лабораторного эксперимента с кадмием представлены на рис. 3. Величина индекса токсичности зависела от сочетания плотности культуры инфузорий и концентрации токсиканта, что проявилось в статистически значимом взаимодействии факторов "Плотность х Концентрация" в ходе
дисперсионного анализа: F [б;ю8] =27,11;
р< 0,001.
Рисунок 3. Изменение индекса токсичности в зависимости от концентрации токсиканта плотности культуры (шт./мл): 1 - 600, 2 - 300, 3 - 150
Как видно из рис. 3, ожидаемая динамика снижения Itox по мере разбавления токсиканта наблюдалась на минимальной плотности культуры инфузорий (около 150 шт./мл). На более высоких плотностях отмечались: существенное расхождение оценок токсичности для концентрации нитрата кадмия 0,1 мг/л, а также статистически значимый рост Itox после десятикратного разбавления концентрации 0,01 мг/л. Таким образом, проведённый эксперимент, подтвердив само существование эффекта влияния плотности культуры тестобъекта на результаты биотестирования, не прояснил ситуацию с характером такого влияния и поставил ряд новых вопросов, обсуждение которых выходит далеко за рамки данной статьи. Отметим только, что явление нелинейности ответа в области воздействий физических и химических факторов сверхнизкой интенсивности хорошо известно, однако многочисленные гипотезы о его механизмах в настоящее время только обсуждаются [1]. Способ измерения хемотаксиса, применяемый в использованной методике биотестирования, указывает на то, что эффект плотности культуры реализуется не пассивно - через изменение физикохимических свойств раствора с инфузориями,
32
Вестник Совета молодых учёных и специалистов Челябинской области №3(10) 2015 33
что также возможно [4], а с активным участием самих инфузорий, демонстрирующих на высоких плотностях иные модели поведения, вероятно, - группового. Не исключено, что при высокой концентрации инфузорий их реакция на токсическое воздействие модифицируется известным как в макро-, так и микромире "чувством кворума" организмов.
Заключение. Натурные исследования токсичности снегового покрова г. Челябинска и результаты лабораторного эксперимента по оценке токсичности раствора нитрата кадмия с использованием измерения хемотаксической реакции инфузории-туфельки указывают на существование в области высоких концентраций тест-культуры (свыше 300-500
шт./мл) эффектов, затрудняющих
интерпретацию результатов биотестирования. Полагаем, что исследования по оценке влияния плотности культуры инфузорий на восприятие ими химических веществ должны быть продолжены, для чего результаты экспериментов целесообразно дублировать с использованием низких концентраций тестобъектов. С практической точки зрения, во избежание влияния неконтролируемых зависящих от плотности факторов на оценку токсичности объектов окружающей среды в мониторинговых исследованиях, желательно использовать близкие концентрации культуры инфузорий, а исследование проводить, по возможности, в один рабочий день.
Список литературы
1. Бурлакова Е. Б., Конрадов А. А., Мальцева Е. Л. Действие сверхмалых доз биологически активных веществ и низкоинтенсивных физических факторов // Проблемы регуляции в биологических системах / Под ред. А. Б. Рубина. М.-Ижевск: НИЦ "Регулярная и хаотическая динамика", 2006. С. 390-424.
2. Вредные химические вещества. Неорганические соединения элементов I - IV групп: Справ. изд./ А.Л. Бандман, Г.А. Гудзовский, Л.С. Дубейковская и др.; Под ред. В.А. Филатова и др. Л.: Химия, 1988. 512 с.
3. Ивашкин В.Т., Минасян Г.А., Уголев А.М. Теория функциональных блоков и проблемы клинической медицины. Л.: "Наука", 1990. 303 с.
4. Лобышев В.И. Вода как сенсор слабых воздействий физической и химической природы // Рос. хим. ж-л. 2007. Т. LI, № 1. С. 107-114.
5. Методика экспресс-оценки степеней токсического загрязнения водных проб с помощью прибора "Биотестер". Москва, 1991. 26 с.
6. Пожаров А.В., Шелемотов С.А. Использование экспресс-биотестирования для оценки антропоэкологической ситуации // Экология. 1992. № 2. С. 94-95.
7. Приказ от 28 апреля 1999 г. № 96 "О рыбохозяйственных нормативах" и "Перечень предельно допустимых концентраций (ПДК) и ориентировочно безопасных уровней воздействия (ОБУВ) вредных веществ для воды рыбохозяйственных водоемов". Государственный комитет РФ по рыболовству.
8. Jennings H.S. Studies on reactions to stimuli in unicellular organisms. I. Reactions to chemical, osmotic and mechanical stimuli in the ciliate infusoria // J. Physiol..1897. V. 21, № 4-5. P. 258-322. (URL: http://jp.physoc.org/content/21/4-5/258.long)
9. Robertson T.B. Investigation on the reactions of Infusoria to chemical and osmotic stimuli // J. Biol. Chem.. 1906. № 1. P. 185-202. (URL: http://www.jbc.org/content/1/2/185.full.pdf)
10. Yoshioka K. KyPlot - a user-oriented tool for statistical data analysis and visualization // Computational Statistics. 2002. V.17, №3. P. 425-437.
33
34 Вестник Совета молодых учёных и специалистов Челябинской области №3(10) 2015
DENSITY EFFECT OF THE TEST FACILITY'S CULTURE IN THE INSTRUMENTAL BIOTESTING USING PARAMECIUM CAUDATUM
M.G. MOSKVICHEVA, Chelyabinsk State University, Chelyabinsk, Russia D.YU. NOKHRIN, Ural Branch of All-Russia Research Institute of Veterinary Sanitary, Hygiene, and
Ecology, Chelyabinsk, Russia e-mail: nokhrin8@mail.ru
Abstract
The toxicity of snow cover in Chelyabinsk and cadmium nitrate solution in the experiment, using the device "Biotester-2" and the culture of the ciliates P. caudatum, were evaluated. It is shown, that by using the density of the culture more than 300-500 cells/ml, the distribution of the toxicity index Itox becomes asymmetric, the correlation between the Itox and the content of heavy metals in samples disappears, the Itox in the ultra-low concentrations of toxicant increases, in this experiment. It is recommended to continue the study of this phenomenon.
Keywords: biological testing, Biotester-2, ciliates, cell culture density, methodology.
34
