CC BY
43
УДК 615.47: 621.37/39
БИОЛОГИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА ЭКОЛОГИЧЕСКОЙ ОПАСНОСТИ
ПРОДУКЦИИ
А.В. Пожаров
Санкт-Петербургский государственный электротехнический университет «ЛЭТИ»
Эл. почта: info@biotester.ru Статья получена редакцией 2.02.2010., принята к печати 5.03.2010
Анализ и контроль сложных сред, к которым могут быть отнесены, например, продукты питания, лекарственные вещества, косметические средства, представляет особую сложную задачу. Их возможное влияние на человека и компоненты окружающей среды наиболее эффективно оценивается через биологически значимые показатели, такие как токсичность, аллергенность, мутагенность, питательность и т.д., не выявляемые впрямую традиционными аналитическими средствами. Здесь особая роль принадлежит биологическим методам, в частности, методам биологического тестирования. Проанализированы уникальные возможности биотестирования. Рассмотрены принципы приборной реализации биотестовых методов. На примере серийных приборов «Биотестер» показаны реальные достижения биотестирования в различных ситуациях.
Ключевые слова: биологическое тестирование, микроорганизмы, инфузории, окружающая среда, экология.
BIOLOGICAL DIAGNOSTICS OF ECOLOGICAL HAZARD
A.V. Pozharov
Saint-Petersburg Electrotechnical University, Saint-Petersburg, Russia E-mail: info@biotester.ru
Analysis and control of complex media, e.g., foodstuff, drugs, and pharmaceuticals are very difficult. Possible effects of such media on humans and environment are best assessed by biologically significant parameters, such as toxicity, allergenicity, mutagenicity, sustenance etc., which cannot be detected by traditional analytical means. Here, the biological methods may have a especial role, in particular, biological testing. The unique advantages of biotesting are reviewed and exemplified with the serially manufactured device "Biotester".
Keywords: biological testing, microorganisms, ciliates, environment, ecology.
Введение
Предметом контроля и мониторинга в области охраны окружающей среды, пищевой промышленности, фармакологии зачастую являются объекты не просто переменного, но принципиально неопределенного состава, характеризующиеся большим числом многокомпонентных ингредиентов, способных к тому же изменять свои частные свойства под влиянием внешних факторов.
По данным американского Совета по качеству окружающей среды [44] ежегодно в мире синтезируется примерно четверть миллиона новых химических соеди -нений, из которых от пятисот до тысячи начинают изготавливаться промышленностью. Значительная часть этих соединений в тех или иных количествах попадает в окружающую среду и накапливается в воде, почве, растительности, животных организмах. Водные объек-
ты, атмосфера, почвы в промышленных регионах представляют собой, по существу, химические реакторы, где при сопутствующем воздействии солнечного излучения, радиации, тепловых полей могут взаимодействовать многие тысячи соединений самой различной природы. В результате протекающих в этих условиях химических и биохимических реакций образуются новые соединения, зачастую обладающие выраженной негативной биологической активностью.
Возможные негативные последствия влияния антропогенного загрязнения на природные экосистемы и человека обычно оцениваются по результатам измерения содержания конкретных веществ в атмосфере, воде, почве. Критерием оценки степени опасности воздействия при этом является соответствие величин измеряемых концентраций нормированным показателям -предельно допустимым концентрациям (ПДК). В осно-
ве системы контроля лежат методы и приборные средства, разработанные для аналитической химии и предназначенные для идентификации и количественного определения конкретных компонентов сложных смесей. Причем выделение определенных компонентов из одного и того же объекта требует использования самых различных методических приемов, сложных подготовительных процедур и, наконец, использования принципиально различной аппаратуры. Этот подход при контроле природных объектов встречает принципиальные трудности из-за чрезвычайно большого числа различных компонентов в объектах, подвергающихся промышленному, сельскохозяйственному и коммунальному загрязнению.
В настоящее время в наиболее оснащенных лабораториях ведущих государств мира методами аналитической химии может быть определено 5-25% всех органических веществ, попадающих в водоемы со сточными водами [5]. Несмотря на постоянно растущее число химических веществ, используемых в производственных циклах и, соответственно, попадающих в поверхностные воды с водами сточными, в странах Западной Европы и Скандинавии в природных экосистемах регулярно контролируется только 30-40 химических показателей загрязнения [10, 49].
В Российской Федерации наиболее технически оснащенные лаборатории, осуществляющие государственный эко-аналитический контроль вод, могут определять около 100-150 гидрохимических компонентов (т.е. имеют методики, средства измерений на их определение и т.д.), однако при контроле гидрохимического качества водоемов определяется, как правило, не более 25 органолептических, микробиологических, неорганических показателей из-за высокой стоимости и трудоемкости анализов и т.д. [10].
С другой стороны, как показывает практический опыт, даже при наличии сведений о динамике доступного анализу множества компонентов, на этой основе чрезвычайно сложно сделать вывод о динамике экологической ситуации в целом с точки зрения прогнозирования тенденции изменения ее параметров, важных для сохранения экосистемы, в особенности ее компонентов, влияющих на человека. При комплексном воздействии таких веществ некоторые из них сенсибилизируют организм по отношению к другим веществам, что приводит к катастрофическим реакциям. Контроль сложных сред по биологически значимым показателям представляет собой актуальную задачу, значимость которой, равно как и сложность, к сожалению, постоянно возрастает. Традиционные физико-химические средства анализа и контроля сред и материалов в подобных ситуациях оказываются неадекватными поставленной задаче.
Возможности биологического тестирования
Как показывают научные исследования и накопленный практический опыт, учесть специфические свойства таких сред можно только на основе соответствующих биологических методов [20-24, 43]. Объективная необходимость определения совокупного действия всего комплекса факторов требует введения новых оперативных средств контроля с использованием биологических систем, которые могут моделировать действие неблагоприятных факторов на живое и, в конеч-
ном счете, на человека. Живое воспринимает комплекс факторов в принципе не так, как физико-химические средства анализа и контроля. Существует определенный диалектический барьер между биологическими и физико-химическими структурами, которые не могут в полной мере моделировать реакцию живого организма на комплекс факторов воздействия. По этой причине традиционные физико-химические методы контроля сред по самой природе используемых в них эффектов (в сущности, примитивных по сравнению с процессами в биосистемах) не в состоянии выявить их биологическую специфичность. Естественно искать решение этой проблемы на пути моделирования реакции сложных биологических систем более простыми, но непременно биологическими системами [26]. Такой подход нашел выражение в так называемом БИОТЕСТИРОВАНИИ, т.е. в оценке свойств испытуемой среды по реакции специально подготовленных биологических тест-систем. Практическая эффективность этого подхода оказалась столь значительной, что различные его методы и их модификации нашли широкое применение во всех развитых странах, в том числе и в нашей стране [1, 2, 8, 18, 35, 41].
Ряд важнейших свойств загрязнителей окружающей среды и иных объектов, контактирующих с человеком, может быть выявлен только с помощью биообъектов. К подобным свойствам относятся:
- токсичность (общая биологическая вредность),
- мутагенность (способность вызывать мутации в последующих поколениях),
- тератогенность (воздействие на эмбрион),
- канцерогенность (способность вызывать раковые заболевания),
- биологическая активность (способность изменять функционирование различных форм живого),
- аллергогенность (способность воздействовать на иммунную систему),
- экологическая вредность (способность воздействовать на природные сообщества организмов).
Живое обладает интегральным восприятием качества среды, а также способно к избирательным реакциям на различные виды загрязнителей. Реакция живого позволяет прогнозировать новые вредные факторы, которые могут воздействовать на человека, и вырабатывать продукцию и технологии, улучшающие безопасность и качество жизни общества. Эволюционное развитие форм живого выработало у них механизмы приспособления и нормализации окружающей среды. Эти механизмы обладают высокой эффективностью и универсальностью, нередко требуя меньших затрат энергии и ресурсов, чем техника очистки и реабилитации, созданная человеком.
Биологические методы контроля и анализа сред используют в качестве первичного звена в системе, создающей информацию о биологически значимых параметрах испытуемой пробы, биологические структуры различного организационного уровня: молекулярного - например, через подавление активности ферментов; субклеточного - по митохондриям или хлоропла-стам; клеточного - например, по клеткам биологических тканей или микроорганизмам; тканевого - по ткани печени, мышечной, крови; организменном - вплоть до человекообразных обезьян; наконец, популяцион-ном - на репрезентативной выборке однородных организмов [4, 39, 45, 46, 48, 50]. В мировой практике по-
добные системы применяются для решения широкого круга информационно-прикладных задач в медицине, ветеринарии, микробиологической промышленности, сельском хозяйстве и других научных и практических областях, ориентированных на контроль состояния и прогнозирование развития ситуации в системах, органично включающих в себя биологические образования. В общем случае биотестирование может применяться для решения различных по сложности задач, которые условно можно разделить на три группы:
- определение концентрации некоторого конкретного вещества в бинарной или малокомпонентной смеси, когда известные физические и химические методы сложны, трудоемки, требуют использования дорогостоящих устройств и реактивов; по своему содержанию такое биотестирование полностью соответствует традиционному химическому анализу; таким образом, например, можно измерять концентрацию белковых растворов [29], некоторых пестицидов;
- определение биологически активного вещества в бинарной или малокомпонентной смеси, когда физико-химические методы неизвестны или ненадежны; это характерно для контроля антибиотиков [25], продуктов биотехнологических производств и т.п.;
- определение биологически значимых качеств сложных сред с точки зрения оценки их возможного влияния на биологические системы, в частности, человеческий организм, биоценозы или их биологические модели; в подобных случаях под оценкой качества может пониматься совокупность параметров, характеризующих, например, степень подавления жизненных функций (токсический эффект) или, напротив, их стимулирование и др.; подобные аналитические задачи характерны для санитарно-гигиенического и экологического контроля воды, воздуха, почв, продуктов питания и кормов.
Биотестовая система предполагает следующее преобразование информации: химические вещества в среде - реакция биообъекта - оценка реакции - заключение о биологических качествах среды [28]. В настоящее время большинство биотестовых методик использует традиционные лабораторные методы, включающие большое число рутинных операций. Согласно методологии токсикологического эксперимента токсичность среды оценивается по тест-реакции биообъекта на опытную и контрольную пробы. В качестве контроля используется заведомо безвредная по химическому составу среда, обычно культуральная или среда для поддержания организмов. И хотя такой подход неизбежно связан с удвоением количества тест-объектов и расходных материалов, сложность реакции живого на многофакторные воздействия вынуждает к этому. Возрастающая потребность экологического мониторинга водных и других объектов заставляет расширять границы использования биотестирования, пересматривать рутинные способы анализа и переходить к разработке аппаратурных методик.
Аппаратурное биотестирование
Анализ зарубежной и отечественной литературы по -казал, что наибольший интерес вызывают в биотестировании те подходы, которые могут обеспечить мониторинг производственной, бытовой, экологической сферы. Решить же задачу мониторинга можно при существенном удешевлении, упрощении, автоматизации
методов биотестирования. Эта задача связана с алгоритмизацией токсикологических методик и разработкой специализированной аппаратуры. Преимуществами аппаратурного биотестирования являются уменьшение трудоемкости методик, возможность использования реакций, визуальный контроль которых невозможен или затруднен, возможность включения данных в экологический информационный комплекс.
Создание аппаратуры, использующей биотестовые эффекты, опирается на общие принципы синтеза биотехнических систем, включающих биологические объекты в качестве воспринимающего чувствительного элемента [3, 11, 27]. Основная функция биотестового канала - получение численного показателя на выходе биотестовой системы с определенной достоверностью [34]. В такой постановке биотестирование среды может рассматриваться как измерительная задача со специфичным набором измеряемых параметров и особым метрологическим обеспечением [14, 30].
Биотестовой измерительной (приборной) системой является комплекс аппаратно-методических средств, предназначенных для оценки биологической активности и, в частности, токсичности веществ различной природы. Биотестовая система включает в себя следующие элементы:
- тест-объект;
- тест-реакцию - отклик на воздействие испытуемых сред;
приборные средства, предназначенные для регистрации информационных признаков, характеризующих реакции тест-объекта;
- набор методических приемов по культивации тест-объекта, организации тест-реакции, подготовки пробы;
- набор методических приемов, обеспечивающих достижение соответствующих метрологических характеристик;
- систему обработки измерений параметров тест-реакции для получения достоверной информации о качестве испытуемых проб.
При этом необходимо согласовать поток информации от биотестовых измерительных средств с профессиональными потребностями и психофизиологическим восприятием оператора, поскольку таковым является эколог, биолог, санитарный врач или другой специалист нетехнического профиля.
Разработка биотестовой приборной системы -сложная комплексная задача, включающая проведение биологических, токсикологических, технических и математических исследований [14, 27]. Построение биотестового канала предусматривает три направления, по которым идет поиск и усовершенствование методик биотестового анализа: во-первых -поиск универсальных, чувствительных тест-организмов; во-вторых-поискновых информативных,биологически значимых изменений в организме, которые легко и надежно, а главное, количественно можно регистрировать; в-третьих - разработка оригинальных приборных средств для количественной оценки изменений в тест- организме при воздействии на него загрязнителем и получения интегральной токсикологической оценки исследуемого объекта.
Уровень приборного оснащения биотестовых методов развит пока слабо как за рубежом, так и в нашей стране. Первые приборные средства в биотестовом
анализе были разработаны для измерения тест-реакций рыб и бактерий. Первоначальные несовершенные конструкции в настоящее время заменяются сложными автоматизированными системами с использованием всех достижений современной техники и электроники для измерения изменений в тест-организме на различных уровнях (физиологическом, морфологическом, биохимическом, поведенческом).
Например, описан оригинальный прибор для регистрации воспринимаемого форелью загрязнения по биоэлектрической активности мозга. Используемый для этого миниатюрный аппарат имеет два электрода, имплантируемых в обонятельные доли мозга, и передающее устройство, сигналы которого улавливаются на расстоянии приемно-регистрирующей системой и автоматически выдаются в форме цифровой информации и графиков [59].
Немецкие ученые предлагают иной прибор для измерения качества воды по реакции рыб [52]. Прибор имеет соответствующий контур, в котором осуществляется циркуляция контролируемой воды. В контур включена кювета с рыбами. При появлении в воде токсикантов рыбы стремятся уйти от них, движутся по потоку и толкают при этом специальную решетку, являющуюся задней стенкой кюветы. Возникающие при толчках импульсы регистрируются как сигнал токсичности поступающей воды.
Описана также конструкция прибора для ежеминутных измерений 16 параметров (кислород, рН, температура, электропроводность, аммиак, нитраты, мутность и т.д.) [51]. Реакцию рыб на воздействующий стимул определяют по частоте дыхания. Сигнал от мышц свободно плавающей рыбы улавливается электродами, вмонтированными в стенки аквариума, сигнал преобразуется, поступает в процессор, регистрируется на дисплее, печатающем устройстве и терминале. Устройство используется для контроля воды.
Анализ приборных методов с использованием рыб показал, что они имеют некоторые достоинства при решении рыбохозяйственных задач, но для экологического мониторинга неперспективны, так как отличаются высокой стоимостью, большой трудоемкостью, но, главное, ненадежны по воспроизводимости из-за малой выборки.
Разработаны автоматизированные биотестовые системы с использованием моллюсков. Эти тест-объекты дают более представительную выборку, хорошо работают при решении частных задач, например контроле сточных вод, но не обеспечивают, как и тесты на рыбах, достаточной точности и оставляют много рутинной работы по сбору тест-организмов [56].
Делаются попытки по автоматизации биотестовых методик с использованием мелких рачков, в частности дафний, причем для выявления токсикологичесого воздействия используют приборные средства для регистрации суммарной двигательной активности группы рачков или для измерения периода биения сердца. Приборные биотестовые методы с использованием дафний отнести к перспективным нельзя, так как при работе с этим тест-объектом остается много рутинной работы по отбору однородного, одновозрастного материала, выборка составляет порядка 10 организмов, высокая чувствительность культуры часто становится недостатком метода, так как дафнии могут погибнуть на фоне полного благополучия как при культивировании, так и при перевозке.
Приведенный краткий перечень далеко не исчерпывает постоянно возникающие в периодических изданиях публикации по этой теме и носит чисто иллюстративный характер. Общая ситуация в том, что все они дальше экспериментальных разработок или опытных образцов не пошли из-за существенных недостатков, связанных как с выбором тест-объекта (крупные организмы, сложные в выращивании в лабораторных условиях), так и регистрируемого параметра, который не обеспечивает количественных характеристик как в силу своей природы, так и по причине непредставительной выборки.
Микроорганизмы - перспективный тест-объект
В мире живого не существует двух совершенно одинаковых индивидуумов. Поэтому использование при биотестировании крупных высокоразвитых организмов в принципе не может быть точным из-за индивидуального разброса свойств, даже без учета психофизических факторов, неизбежно проявляющихся в реакциях высших организмов.
В этом отношении системы, построенные на использовании реакций микроорганизмов, имеют то важнейшее преимущество, что позволяют получить групповую оценку по состоянию популяции микроорганизмов, то есть по репрезентативной выборке. Микробные популяции отличаются многочисленностью (например, свыше 1 млрд бактерий в 1 мл суспензии), что определяет статистическую достоверность наблюдаемой реакции даже при наличии определенного распределения членов популяции по индивидуальным свойствам. Контроль на по-пуляционном уровне позволяет выработать интегральные критерии качества среды, проследить ее влияние на многих поколениях тест-объектов за короткое время, выявить специфические биологические изменения аллергенного и мутагенного характера.
Итак, в первом направлении при разработке биотестового метода анализа наблюдается тенденция перехода от крупных тест-объектов (рыбы, моллюски, дафнии и т.п.) с их полуколичественной или даже качественной ответной реакцией на токсиканты к микроорганизмам, тканевым и молекулярным структурам. По многим причинам предпочтение отдается именно микроорганизмам. В частности, тканевые клетки труднее культивировать, молекулярные структуры не могут моделировать целостный организм и т.д. В группу микроорганизмов входят миниатюрные организмы различных систематических групп: бактерии, водоросли, грибки, простейшие. К хорошо изученным тест-реакциям микроорганизмов можно отнести такие, как изменение количества организмов под действием биоцидных факторов или из-за торможения процессов генерации, изменение интенсивности метаболических процессов, например, по параметрам фотосинтеза и дыхания или показателям ферментативной активности (в основном, для водорослей и бактерий); к менее изученным - таксисы, биолюминесценцию (для бактерий), замедленную флуоресценцию (для водорослей), подвижность.
В создании биотестовых приборных средств на основе реакций микроорганизмов в мире также имеется определенный опыт. Широко известны приборы для оценки токсичности воды по подавлению биолюминесценции. Это, например, «Микротокс» (США) и ряд российских приборов, созданных в Красноярске, Москве, Иркутске.
В приборной разработке японских ученых [55] использована методика, основанная на фотоотражении от ядер клеток, мигрирующих через фильтр Кис1еороге. Фотоотражение регистрируется с помощью сканирующего денситометра, связанного специальным интерфейсом с компьютером. Величина сигнала соответствует количеству клеток. Исследования образцов на 48-луночном устройстве дало удовлетворительные результаты. Такая система позволяет проводить количественный анализ быстрее и точнее, чем подсчет под микроскопом. Она достаточно чувствительна для выявления ответа клеток гладких мышц и фибропластов на различные токсиканты. Может быть применена для лаборатории медицинского и биологического скрининга препаратов и клонов.
Известна автоматическая проточная установка по измерению замедленной флюоресценции. Установка для измерения угасания подвижности спермы быка под действием токсиканта разработана в системе МЗ РФ. Она используется в качестве стандартизованного средства для оценки токсичности медицинских материалов. Установку, биологическим датчиком которой служит клетка харовой водоросли, разработали ученые Института экспериментальной ботаники [24]. Известны и другие попытки, однако широко применяются буквально единичные решения. Причины рассмотрим ниже.
Решающую роль играют обоснованность, мотивированность и организация тест-системы. Выбор микроскопического тест-объекта, пригодного для биотестирования, основывается на следующих требованиях:
- биологическая значимость: тест-объект должен быть типичным представителем природной экосистемы региона;
- безвредность для человека и животных;
- хорошая изученность;
- высокая чувствительность к токсичным веществам;
- доступность культивирования для любой практической лаборатории;
- низкая стоимость получения.
Включение микроорганизмов как наиболее перспективных тест-объектов в измерительную систему требует решения принципиально важных взаимосвязанных биологических и технических задач, главные из которых: сохранение биологической специфичности культуры микроорганизмов на протяжении одного опыта и воспроизводимость ее свойств в ряде опытов; подвод воздействующей (измерительной) энергии в измерительный микробиологический преобразователь (ИМБП); вопрос оптимизации процесса съема информации, обработка совокупности частных параметров с выходом на интегральный параметр, характеризующий процесс взаимодействия культуры микроорганизмов с испытуемой пробой в целом [12, 14, 42].
Главная особенность проектируемых биотехнических средств - функционирование в них живых организмов в изначально заданном состоянии. Это условие накладывает особые требования на все звенья измерительной цепи. Можно говорить о наличии в рассматриваемой биотехнической системе двух подсистем, выполняющих равно необходимые, но принципиально различные функции. Первая призвана обеспечить эффективное воздействие испытуемого вещества на тест-объект. Уровень выполнения этой подсистемы определяется задачей дозирования воздействия, проведении его до воспринимающего звена в тест-объекте, контро-
лировании сопутствующих факторов, стандартизации условий опыта. Вторая подсистема имеет задачей оценить результат воздействия пробы на тест-объект. Ее построение определяется условиями включения воспринимающих элементов в измерительную цепь, выбором способа преобразования, совокупностью регистрируемых параметров и, наконец, получением объективных показателей групповой оценки параметров качества объекта окружающей среды с заданной степенью достоверности.
Одноклеточные водоросли и грибки очевидно имеют ограничения в биотестировании и могут применяться только для решения некоторых специальных задач в силу специфики их физиологии. Более широкие возможности имеют бактерии из-за их разнообразия, но бактерии достаточно неудобный с практической точки зрения тест-объект, потому что требуют применения специальных дорогостоящих мясопептонных бульонов, состав которых, строго говоря, неопределенным образом зависит от исходных компонентов корма, воды и неконтролируемых примесей. Иногда возникают трудности в интерпретации некоторых специфичных реакций бактерий, например, биолюминесценции, которую весьма трудно соотнести с какой-либо физиологической реакцией человека и животных. То же относится и к бактериям, не свойственным реальным биоценозам. Относительно низкая чувствительность к токсикантам проявляется у бактерий, обладающих плотной полисахаридной или липидной оболочкой.
Биотестовые измерительные системы на основе реакций инфузорий
Интересные перспективы открывает использование простейших. Этим микроскопическим животным присущи сложные функции, и потому их реакции могут хо -рошо моделировать воздействие токсикантов на многоклеточные организмы. Клетки в теле многоклеточного организма - это часть целого, и их функционирование подчинено всему организму. В противоположность этому, клетка простейшего - самостоятельный организм, которому свойственны все жизненные функции: обмен веществ, раздражимость, движение, размножение и другие. И к условиям окружающей среды простейшее приспосабливается как целостный организм. Простейшие - важное трофическое звено любого водного биоценоза и активных илов. Поэтому как тест-объект простейшие представляют наибольший интерес, поскольку, обладая всеми преимуществами микроскопического объекта (простота и дешевизна культивирования, популя-ционный уровень исследования, высокая чувствительность), они наиболее близко моделируют действие химиката или сложного комплекса на биологические компоненты экосистем [4, 7, 46, 54, 57, 58].
Одним из наиболее перспективных для использования в измерительном процессе типов реакций являются поведенческие реакции. Это обусловлено тем, что поведенческие реакции, свойственные большинству видов биологических объектов, относятся к наиболее быстро протекающим. Поведенческие реакции, как правило, являются откликом на воздействие весьма малых (сублетальных) доз вредных веществ, что обеспечивает самую высокую чувствительность методик, основанных на использовании реакций этого типа.
Простейшие, как и все подвижные организмы, обладают реакцией направленного перемещения популя-
ции под воздействием химических веществ - хемотаксисом. Хемотаксис имеет токсикологическую интерпретацию: микроорганизмы «уходят» из зоны опасности в безопасную зону или к источникам корма [47, 48, 53]. В СПбГЭТУ «ЛЭТИ» системно ведется исследование и разработка биотестовых средств на основе хемотаксиса инфузорий и бактерий. На основе указанного подхода была разработана оригинальная методика и соответствующие технические средства в форме приборов серии «Биотестер».
Методика теста включает в себя наслоение водной пробы в вертикальной кювете на взвесь инфузорий в среде с загустителем. Загуститель предотвращает перемешивание взвеси клеток с пробой, но не препятствует свободному перемещению инфузорий. Если проба нетоксична, то наверх, в пробу вплывает большее число инфузорий, если токсична - то наверх всплывает тем меньше инфузорий, чем выше токсичность пробы.
В стандартную фотометрическую кювету (45'х13'х13 мм) вносят 2 мл взвеси инфузорий (500-1000 кл/ мл) и на нее наслаивают без перемешивания 2 мл водной пробы. Через 15-30 мин. (продолжительность тест-реакции) измеряют концентрацию инфузорий в верхней зоне кювет в опытных и контрольных (заведомо безвредных) пробах и на этой основе рассчитывают «индекс токсичности» как безразмерный параметр, определяемый выражением
Т = (С - С ) / С , где
V контр опыт/ ' контр7 **
С и С - концентрации (в условных единицах)
контр опыт
инфузорий в «контрольной» и «опытной» кюветах соответственно. Например, для раствора сульфата меди в концентрации 0,1 мг/л индекс токсичности дает значение около 0,5. Очевидно, что водные пробы, оцениваемые меньшими значениями индекса токсичности, можно считать менее токсичными. Соответственно, степень загрязнения любой пробы можно оценить путем сопоставления с раствором стандартного токсиканта при равных индексах токсичности. Например, вода в водоеме X токсична так же, как раствор сульфата меди в 7 ПДК (или 0,6 ПДК) и т.п.
Возможности практического использования биотестовой аппаратуры обусловлены следующими обстоятельствами:
- оперативность получения биотестовой оценки (для серийной модели «Биотестер-2» время однократного анализа составляет 15-30 мин., производительность на серии проб - до 10-15 анализов в час);
- количественное выражение степени токсичности в виде безразмерного параметра;
- возможность сопоставить биотестовую оценку с токсичностью стандартного раствора с нормированной концентрацией (например, по ПДК);
- наличие аттестованной органами Госстандарта методики метрологической поверки, доступной любой региональной лаборатории (модель «Биотестер-2» прошла государственные испытания и включена в Государственный реестр измерительных средств);
- возможность широкого модифицирования базовой методики оценки токсичности в зависимости от потребностей пользователя.
Приборы серии «Биотестер» позволили получить ряд ранее труднодостижимых результатов. Так, например, при обнаружении массовой гибели рыбы в реке Томь по невыясненной причине (Кемерово) было протестировано порядка 30 проб воды, отобранных в раз-
ных точках системы Томи, причем пробы поступали на анализ в анонимных флаконах без сопроводительной информации. Наложение результатов тестирования на карту города позволило однозначно выявить источник отравы и, кроме того, обнаружить аномальный выход токсичных вод к поселку ниже города и оценить уровень токсичности, что дало основания санитарным службам объяснить причины наблюдаемых массовых желудочно-кишечных расстройств и выработать оперативные рекомендации по использованию воды, не дожидаясь результатов химических анализов.
При обследовании речки Карповки с привлечением лучших лабораторий Санкт-Петербурга было показано убедительное соответствие биотестовых и химико-аналитических результатов при выявлении влияния на воду производств с ограниченным числом загрязняющих веществ.
При сложной картине загрязнений биотестовые методы оказываются значительно надежнее других в выявлении опасных ситуаций. Так, в рамках государственных научно-практических программ проводилось исследование загрязненности воды в Неве и Невской губе, водоемах Карельского перешейка, накопления загрязнений в снежном покрове и почвах. Основные методические приемы были наработаны при выполнении совместных работ с Институтом озероведения РАН (Санкт-Петербург). При этом зоны повышенной токсичности были выявлены, в том числе, в тех местах, где химический анализ по неизбежно ограниченному кругу веществ не показал опасных уровней загрязнения. Это касается в первую очередь воды Невской губы (в особенности после шторма) и почв в черте города. В то же время, биотестовый контроль при высокой чувствительности к токсикантам не дает ложных оценок. Например, все пробы снега с Карельского перешейка оказались нетоксичными, что и подтвердил химический анализ как петербургских лабораторий, так и лаборатории Лаппеенрантского университета (работа выполнялась по российско-финской программе, возглавляемой СПбГЭТУ). Нетоксичны все пробы воды из водоемов системы Вуоксы, за единственным исключением нетоксична вода на водозаборах Санкт-Петербургского водопровода (1998-2001).
Широкое исследование аккумулирования загрязнений в снежном покрове выполнено Башкирским госуниверситетом в городах Уфе, Стерлитамаке, Салавате. Анализ кернов снега, отобранных на удалении до 20 км, показал прямую зависимость уровня загрязненности от розы ветров, рельефа и высоты труб конкретных предприятий. Типичное распределение токсичности имеет следующую картину: относительно высокий уровень в городах, снижение до минимума на радиусе 1 -5 км, вторичный максимум на расстоянии 5-15 км и снижение до пренебрежимо малых величин по мере удаления от города за этими пределами.
Систематически проводилось обследование системы озер Вуоксы (совместно с Университетом растительных полимеров). При обследовании одновременно изучались данные биоиндикации о составе природных биоценозов пресных вод. Характерно, что в водных объектах с токсичной водой заметно уменьшается количество гидробионтов, особенно молодых форм. При этом ни в одном из обследованных водоемов не наблюдается полное отсутствие обитателей. Это обусловлено высокой адаптационной способностью ги-
дробионтов. Не случайно инфузории и ракообразные составляют основное население активных илов в очистных сооружениях, выдерживая высокие токсические нагрузки. Анализ этих данных показывает, что методы биоиндикации, в отличие от биотестовых, не всегда оказываются достаточно надежными. В каждом конкретном случае необходимо отслеживать особые маркерные организмы: некоторые виды рыб, моллюсков, сине-зеленые водоросли и т.п. Таким образом, биотестирование и биоиндикация являются взаимно дополнительными в получении биологически значимой информации.
Перспективы биотестового подхода
При всей сложности и разнородности устройств, образующих биотестовый канал, его уникальные в аналитическом отношении возможности позволяют говорить о высокой экономичности в сравнении с традиционными средствами экологического мониторинга. При оперативной оценке экологической ситуации такой канал решает те же задачи, что и полностью укомплектованная химико-аналитическая лаборатория, но, в отличие от нее, использование биотестовых методов значительно снижает вероятность необнаружения опасной ситуации. При этом вид и количество доступных контролю вредных веществ и их сочетаний практически не ограничены.
Применение биотестовой аппаратуры позволяет с высокой надежностью ранжировать контролируемые объекты по степени опасности и подключать химико-аналитические средства только в тревожных случаях, тем самым существенно повышая оперативность контроля при экономии временных и материально-финансовых ресурсов. Приборы серии «Биотестер» успешно используются при решении таких задач, как:
- оперативное обследование и оценка экологического состояния объектов окружающей среды;
- выявление мест сброса опасных загрязнений;
- картирование территорий по степени загрязнения выбросами промышленных предприятий (по почвам и снежному покрову);
- контроль процессов очистки воды в системах водоснабжения;
- оценка эффективности бытовых фильтров доочист-ки питьевой воды;
- выбор источников хозяйственно-питьевого водоснабжения;
- контроль за процессами водоподготовки;
- предварительный контроль сточных вод, направляемых на биологическую очистку;
- контроль уровня загрязнения кормовой и пищевой продукции токсическими веществами;
- оценка токсичности лекарственных препаратов и биологических субстратов;
- оценка токсичности строительных материалов, изготовленных из отходов различных производств;
- контроль качества природных вод, донных отложений;
- оценка степени токсичности сточных вод на разных стадиях формирования при проектировании локальных очистных сооружений;
- обоснование нормативов предельно допустимых концентраций загрязняющих компонентов;
- определение класса опасности отходов;
- проведение токсико-экологической экспертизы
новых материалов, веществ и изделий.
Особую роль могут играть биотестовые методы в медицине. При патологических процессах имеет место эндогенная интоксикация: в тканях появляются вещества, являющиеся продуктами автолиза отмирающих клеток, метаболитами болезнетворных микроорганизмов. Это отражается в изменении биологической активности крови.
Биохимические анализы дороги и трудоемки. Наряду с тем, существует метод, основанный на реакции свободно движущихся инфузорий. Данный метод является высокоинформативным и экспрессным. Широкое его применение сдерживалось из-за утомительной процедуры визуального контроля. Показано, что определенная модификация технических решений, заложенных в приборах серии «Биотестер», позволяет корректно решать эту задачу [15, 40].
Наличие поведенческой реакции как формы отклика на внешние воздействия открывает перспективы управления популяцией микроорганизмов. Одно из направлений развития приборов серии «Биотестер» опирается на исследование закономерностей движения инфузорий под действием электрического поля. Показано, что использование эффекта гальванотаксиса позволяет сократить время тест-реакции с 30 до 2-5 мин.; правда, за счет существенного усложнения техники [16, 17].
Ни один тест-объект не может выявить все биологически значимые свойства испытуемых сред, материалов и изделий. Повысить достоверность оценок можно на пути построения совокупности биотестовых методик на организмах разных, но непременно связанных, трофических уровней. Это могут быть различные по сложности трофические цепи, но первичное звено - это чаще всего одноклеточные гетеротрофы. Для инфузорий, в частности, они являются кормом, например, бактерии. Многие из них обладают функцией движения, что позволяет использовать эффекты хемотаксиса. Оптико-электронные модули приборов серии «Биотестер» позволили обеспечить контроль популяции бактерий в биотестовой методике полосового хемотаксиса. Как и в стандартной методике, на взвесь бактерий в вертикальной кювете наслаивается без перемешивания водная проба. Перемещаясь вверх, бактерии формируют слой в виде компактной полосы. Ее положение впрямую зависит от свойств пробы. Токсичность оценивается таким же безразмерным параметром, но в данном случае характеризующим относительное уменьшение высоты перемещения полосы в пробепо сравнениюсконтролем [38, 39, 42].
Создание научной базы построения средств контроля динамики биологических взвесей [13, 19, 40] дает возможность развития упомянутой совокупности методов и на последующее трофическое звено, в частности, на микроскопических ракообразных и моллюсков.
Разработанные для приборов серии «Биотестер» методики отличаются исключительно высокой чувствительностью: достаточной для определения подпорого-вых концентраций опасных веществ в соответствии с международными стандартами. При рутинных анализах она многократно повышает производительность лабораторий. При обработке серии проб производительность составляет 10-15 проб в час.
Заключение
Биотестовая аппаратура, реализующая биологические методы контроля, является по существу новой, дающей со -вершенно новые возможности при анализе сложных сред. Она пока мало известна возможным пользователям, хотя уже накапливается опыт в нестандартном применении, например « Биотестера- 2 », для обследования качества зерна, мяса, картофеля, кормов и др. [6, 9, 31-33, 36, 37].
Биологическая диагностика экологической опасности продукции имеет самые серьезные перспективы. В 1997 г. в США были сформулированы приоритетные задачи в области охраны среды в XXI в., предполагающие расширение использования биологического контроля. К этим задачам относятся следующие:
1. Совершенствование стратегий оценки экономического риска для выбора наилучших альтернатив развития. Классические методы не позволяют учитывать эффекты взаимодействия вредных веществ, не позволяют разделить степень риска для разных биосистем.
2. Достижение с помощью технических средств лучшего понимания развития экосистем. Разработка системы мониторинга загрязнения воды, почвы, атмосферы должна способствовать выявлению общих закономерностей изменения среды и климата планеты.
3. Уменьшение воздействия химических технологий на среду. Решение этой задачи связывается экспертами прежде всего с созданием комплексов биотестов для выявления острой и хронической токсичности новых веществ. Наибольшее внимание ученых привлекает путь синтеза заведомо безвредных материалов. Особую опасность представляют малораспа-дающиеся токсиканты, которые способны к биоаккумуляции, а также вещества, вызывающие хронические заболевания. Предполагается осуществить переход от выявления токсического действия отдельных веществ к анализу токсичности бинарных смесей, чтобы учитывать эффект взаимодействия химических элементов-загрязнителей.
4. Переход от контроля стоков и выбросов к производству продукции из заведомо протестированных на биологическую вредность материалов.
Эффективность применения биотестовых приборов показывает, что биологический контроль с соответствующим метрологическим обеспечением является органичным и необходимым дополнением и развитием ныне действующей системы обеспечения экологической безопасности на всех стадиях производства, использования и утилизации продукции.
Литература
1. Ахутин В.М., Пожаров А.В., Захаров И.С., Папутская Н.И. Бортовая биотестовая система для контроля морских акваторий // Изв. СПбГЭТУ «ЛЭТИ». Спецвыпуск «Человек и море». - 1994. - С. 83-88.
2. Ахутин В.М., Пожаров А.В., Попечи-телев Е.П. Биотестовое измерение параметров среды как основа оценки антропоэколо-гической ситуации // В кн.: Антропоэколо-гическая оценка и формирование оптимальной городской среды. - Л.: Изд-во АН СССР, 1988. - С. 59-62.
3. Ахутин В.М., Немирко А.П., Пожаров А.В. и др. Биотехнические системы: Теория и проектирование. - Л.: Изд-во Ленинградского ун-та, 1981. - 220 с.
4. Бойкова Э.Е. Применение простейших в токсикологических исследованиях // Экспериментальная водная токсикология. Вып.15. -Рига: Зинатне, 1991. - С. 155-164.
5. Бородин В.С. Гигиеническая экспресс-диагностика токсичности дезинфектантов питьевой воды с помощью биотестирования / / Гигиена и санитария. - 1994. - № 9. - С. 3-5.
6. Виноходов Д.О. Токсикологические исследования кормов с использованием инфузорий. - СПб.: Изд-во СПбГТИ, 1995. - 80 с.
7. Виноходов Д.О., Пожаров А.В. Методологические особенности токсикологических тестов с инфузориями // Изв. СПбГЭТУ «ЛЭТИ». Сер. Биотехнические системы в медицине и экологии. - 2006. - Вып. 3 - С. 60-67.
8. Гусева С.С., Аксенова Е.И., Идрисова Н.Х., Бакаева Е.И., Корпакова И.Г. Оценка качества водной среды методами физиолого-экологического биотестирования // Экспе-
риментальная водная токсикология. - Вып. 15.
- Рига: Зинатне, 1991. - С. 165-171.
9. Долгов В.А. Методические аспекты и практическое применение ускоренной биологической оценки кормов, продуктов животноводства и других объектов ветеринарно-санитарного и экологического контроля: Ав-тореф. дис... д-ра ветеринар. наук. - М.: ВНИ-ИВСГЭ РА сельхоз. наук, 1992. - 41 с.
10. Жмур Н.С. Государственный и производственный контроль токсичности вод методами биотестирования в России. - М.: Международный дом сотрудничества, 1997. - 117 с.
11. Завгородний А.В., Захаров И.С., Пожаров А.В. Проектирование аппаратуры для комплексного биотестирования среды / / Изв. СПбГЭТУ «ЛЭТИ».- Сер. Биотехнические системы в медицине и экологии. - 2006. -Вып. 3. - С. 78-84.
12. Завгородний А.В. Биотехническая система для контроля популяции микроорганизмов // Изв. СПбГЭТУ «ЛЭТИ». Сер. Биотехнические системы в медицине и экологии.
- 2008. - Вып. 2. - С. 55-61.
13. Завгородний А.В., Захаров И.С. Биотестовые аппаратурные средства и методы контроля локомоций инфузорий // Изв. Южного федерального ун-та: Технические науки.
- 2008. - № 5 (82). - С. 205-209.
14. Захаров И.С., Пожаров А.В., Папутская Н.И., Лепяхов А.Ю. Биотестовый измерительно-вычислительный комплекс // Медицинская техника. - 1995. - № 1. -С. 32-36.
15. Захаров И.С., Ваганов А.В. Измерение концентрации подвижных микроорганизмов
в макро- и микрообъемах // Научное приборостроение. - 2005. - Т. 14. - № 3. - С. 93-96.
16. Захаров И.С., Пожаров А.В., Голядкин С.В., Ковалевская А.С. Биотехническая биотестовая система с использованием реакции гальванотаксиса // Изв. СПбГЭТУ «ЛЭТИ». Сер. Биотехнические системы в медицине и экологии.- 2005.- Вып. 1. - С. 44-48.
17. Захаров И.С., Ковалевская А.С., Казанцева А.Г. Аппаратурно регистрируемые характеристики и математическая модель галь-ванотаксического сигнала // Изв. СПбГЭТУ «ЛЭТИ». Сер. Биотехнические системы в медицине и экологии. - 2006. -Вып. 1. - С. 52-57.
18. Захаров И.С., Пожаров А.В., Сидоренко В.М., Суворова Т.В. Экспрессные методы интегральной оценки экологического состояния объектов окружающей среды: Учебное пособие. - СПб.: Изд-во СПбГЭТУ «ЛЭТИ», 2007. - 80 с.
19. Захаров И.С. Математические модели локомоций микроорганизмов, используемые для создания биотестовой аппаратуры // Изв. Южного федерального ун-та: Технические науки. - 2008. - №5 (82). - С. 202-205.
20. Захарченко М.П., Ткачук С.М., Яковлев Л.Е. и др. Гигиеническая экспресс-диагностика токсичности дезинфектантов питьевой воды с помощью биотестирования // Гигиена и санитария. - 1994.- № 9. - С.3-5.
21. Илюшенко В.П. Быстрое тестирование токсичности, основанное на определении респираторной активности // Экология. - 1995. - № 1. - С. 63-67.
22. Котелевцев С.В., Степанова Л.И. Биотестирование канцерогенных и мутагенных соединений в водных системах // Российский химический журнал. - 1994. - Т. 38. -№ 1. - С. 42-49.
23. Красовский Г.Н., Алексеева П.В., Егорова Н.А. Биотестирование в гигиенической оценке качества воды // Гигиена и санитария. -1991. - № 9. - С.13-16.
24. Методы биотестирования вод / Ред. А.Н. Крайнюкова и др. - Черноголовка, Изд-во ОИФХ, 1988. - 128 с.
25. Папутская Н.И., Пожаров А.В., Захаров И.С. и др. Способ определения активности стрептомицина. Авторское свидетельство 1621514, приоритет от 29.06.88.
26. Пожаров А.В. Об использовании биотехнической модели для прогнозирования со -стояния человека при внешних воздействиях // В кн.: Методы и приборы биоинформации и контроля параметров окружающей среды. Межвузовский сборник. - Л.: ЛИАП, 1981. -С. 77-82.
27. Пожаров А.В. Биотехнические проблемы разработки и эксплуатации систем с измерительными микробиологическими преобразователями // В кн.: Биомедицинские технические системы: межвузовский сборник. - Л.: ЛИАП, 1983. - С.11-16.
28. Пожаров А.В. Об информативном содержании биотестового процесса // Изв.
ЛЭТИ, вып. 367. Адаптивные биотехнические системы. - 1986. - С. 79-83.
29. Пожаров А.В., Папутская Н.И. Биотестовое определение белка в воде // В кн.: Анализ окружающей природной среды. Межвузовский сборник. - Горький: Изд-во ГГУ, 1987.
- С. 128-132.
30. Пожаров А.В. Формирование сигнала в измерительном микробиологическом преобразователе // Изв. ЛЭТИ. Вып. 405. Вопросы синтеза биотехнических измерительно-вычислительных систем. - 1988. - С. 86-90.
31. ПожаровА.В., ЗахаровИ.С., Папутская Н.И. О некоторых практических возможностях биотестовой аппаратуры // Рациональное использование природных ресурсов и охрана окружающей среды. - Л.: ЛПИ, 1989.
- С. 15-19.
32. Пожаров А.В., Шелемотов С.А. Использование экспресс-биотестирования для оценки антропоэкологической ситуации // Экология. - 1992. - № 2. - С. 94-95.
33. Пожаров А.В., Шелемотов С.А. Экспресс-биотестирование при оценке качества материалов // Дефектоскопия. - 1992.
- № 4. - С. 88-90.
34. Пожаров А.В. Метрологические аспекты биотестирования / / Изв. СПбГЭТУ «ЛЭТИ».
- 1994. - Вып. 468. Биомедицинские измерительные системы и приборы. - С. 94-100.
35. Пожаров А.В., Рахманин Ю.А., Шелемотов С.А., Михайлова Р.И. Прикладные аспекты аппаратурного биотестирования воды // Гигиена и санитария. - 1994. - № 8. - С. 18-21.
36. Пожаров А.В., Попечителев Е.П. Возможности биотестирования при контроле промышленных загрязнений // Экологическая химия. - 1996. - Т. 5. - № 3. - С. 217-222.
37. Пожаров А.В., Захаров И.С., Ивакина А.В. Принцип биотестовой оценки качества бытовых фильтров воды // Гигиена и санитария. - 1998. - № 4. - С. 46-50.
38. Пожаров А.В., Гурская Т.В., Ананьева Е.П., Захаров И.С. Быстрый токсикологический метод, основанный на эффекте «бактериальной шкалы» // Труды Международной конференции по мягким вычислениям и измерениям, Т. 2 .- СПб.: Гидрометеоиздат, 2002.
- С. 230-233.
39. Пожаров А.В., Суворова Т.В., Ананьева Е.П. и др. Оценка возможности использования бактериального хемотаксиса для аппаратурного биотестового анализа // Вестник Северо-Западного регионального отделения Академии медико-технических наук. Вып. 7. -СПб.: ООО «Агентство «ВиТ-принт», 2003.
- С. 198-201.
40. Пожаров А.В., Ваганов А.В., Захаров И.С. Проблемы построения оптической модели взвеси инфузорий в сыворотке крови // Изв. СПбГЭТУ «ЛЭТИ». Сер. Биотехнические системы в медицине и экологии. - 2006.
- Вып. 3. - С. 45-49.
41. Сазонова.В.Е., Зализняк Л.А., Савельев Л.М. и др. Использование биотестов при раз-
работке мониторинга водной экосистемы // Экология. - 1997. - № 3. - С. 207-212.
42. Суворова Т.В., Захаров И.С., Ананьева Е.П., Пожаров А.В. Устройство для исследования биотеста на основе хемотаксической «бактериальной шкалы // Труды Международной конференции по мягким вычислениям и измерениям, Т. 2.- СПб.: Гидрометеоиз-дат, 2003. - С. 202-204.
43. Туманов А.А. Биологические методы анализа // Аналитическая химия. - 1988. -Т. 43. - № 1. - С. 20-36.
44. Худобина О.А., Сафонова И.Л. Проблемы контроля токсичности химических продуктов в США // Химическая промышленность за рубежом. - 1976. - Вып. 5. - С. 27-31.
45. Чурилов Ю.С., Белоиваненко В.И. Черноморская креветка Palaemon abpersus Pall. как токсикологический тест-объект // Гидробиологический журнал. - 1986. - Т. 22. -№ 5. - С. 77-79.
46. Этлин С.Н., Лахонина Г.М., Ирлина И.С. Ускоренная оценка химических веществ с помощью тест-объекта инфузории // Актуальные проблемы медицинской токсикологии ЭССР. Матер. научно-практической конф. Таллинн. 22-23 апреля 1986. - Таллинн, 1989. - С. 16-18.
47. Berk S.G. Reversal of phenol and naphthalene hemoattraction // Bull. Env. Contam. Toxicol.- 1980. - Vol. 44. - P. 181-184.
48. Berk S.G. Effect of cadmium and copper on chemotaxis of marine and freshwater ciliates // Bull. Environ. Contam. Toxicol. - 1985. - Vol. 49. - P. 97-903.
49. Biomonitoring in the water environment 1997. Prepared by Task Force on Biomonitoring in the Water Environment under the direction of the Water Quality and Ecology Subcommittee of the Technical Practice Committee. Alexandria, VA : Water Environment Federation. - 1997. LC: QH90.57.B5 B5895 1997 Dewey: 628.1/61.
50. Cui K. The effect of six heavy metals on marine fish larvae hatching and survival // Oceanol. Limnol. Sin. -1987. - Vol. 18. -No. 2. - P. 38-144.
51. Huve J.-L. Un detecteur original de pollution: la truite // Recherche. -1981. -P. 108-110.
52. Justel K. Fischtest sichert Wasserqualitat // Umwelt. - 1987. - № 7-8. - S. 396-398.
53. Nelson D.L., Kung C. Behavior of Paramecium: chemical, physiological and genetics studies // in: Hazelbauer G.L. (ed) Receptors and recognition. Series B. Vol.5. Taxis and behavior. - New York: Halsted Press-Wiley, 1978. - P. 75-100.
54. Norikazu M., Tomonori K. and Miho T. Use of Paramecium species in bioassays for environmental risk management: Determination of IC50 values for water pollutants // Journal of Health Science. - 2007. - No 49(6). -P. 429-435.
55. Shimura J., Suzuki K., Nitsuka M. An automated analysis of water quality using a computer-assisted scanning densitometer // nal. Biochem. - 1989. - № 1. - P. 72-77.
56. Shultz T.W. Ecotoxicology and environmental physiology: Biological effect of contaminants on bivalve molluscs // Inst. Mar. Environ. Res. (Plymouth). - 1985. - P. 86-103.
57. Svensmark B., Larsen J. Determination of the labile species of zinc by anodic stripping staircase voltametry, with special reference to correlation with the toxicity to tetrahymena // Talanta (G.B.). - 1988. - Vol. 35.- P. 953.
58. Ujwala G., Shanti N, and Prakash V. Toxic effects of monocrotophos on Paramecium caudatum // African J. Biotechnol. - 2003. -Vol. 6 (19). - P. 2245-2250.
59. Wikes R.W.H. Water quality protection with fish monitor // Proc. 7th Int. Water Conf. - Pittsburgh, 1989. - P. 39-48.
J
