Доклиническое изучение фармакокинетики лекарственной формы аналога гипоталамического гормона соматостатина (агг) Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»



ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ ДОКЛИНИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ... 33

УДК 615.014.2:615.357:616-092.9

Н.И. Зимакова1, Е.Ю. Колесникова1, А.П. Будько1, З.Г. Дейчман1, А.Е. Золотарев , Г.А. Бадун2, М.Г. Чернышева2 ДОКЛИНИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ ФАРМАКОКИНЕТИКИ ЛЕКАРСТВЕННОЙ ФОРМЫ АНАЛОГА ГИПОТАЛАМИЧЕСКОГО ГОРМОНА СОМАТОСТАТИНА (АГГ)

ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» РАМН, Москва 2МГУ им. М.В. Ломоносова

Контактная информация

Зимакова Наталья Ивановна, кандидат биологических наук, заведующая лабораторией фармакокинетики НИИ ЭДиТО

адрес: 115478, Москва, Каширское шоссе, 24; тел. +7(499)324-22-34 e-mail: zimakovan@mail. ru

Статья поступила 11.07.2012, принята к печати 31.08.2012.

Резюме

В рамках доклинического изучения фармакокинетики лекарственной формы аналога гипоталамического гормона соматостатина (АГГ) был разработан метод получения 3Н-АГГ синтетическим путем из 3Н-тетрапептида, полученного методом бомбардировки молекул вещества термически активным газообразным тритием, и цистеина. Фармакокинетические исследования АГГ в 15 тканях и органах мышей при пероральном введении в лекарственной форме показали хорошую доступность препарата ко всем органам и тканям, включая Са755, и высокую тропность к желудку и костному мозгу. Изучение выведения препарата из организма животных с мочой и калом показало, что кумулятивная экскреция составляет 16 и 78 % соответственно и в основном заканчивается к 24 ч наблюдения.

Ключевые слова: доклиническая фармакокинетика, аналог гипоталамического гормона соматостатина.

N.I. Zimakova1, E.Y. Kolesnikova1, A.P. Budko1, Z.G. DeychmanI,A.E. Zolotarev1, G.A. Badun2, M.G. Chernysheva2 PRECLINICAL STUDY PHARMACOKINETICS DRUG FORM OF ANALOG HYPOTHALAMIC HORMONE SOMATOSTATINE (AGG)

1FSBI «N.N. Blokhin RCRC» RAMS, Moscow

2M.V. Lomonosov Moscow State University, Moscow

Abstract

As part of pre-clinical pharmacokinetic study of the dosage form of the hypothalamic hormone somatostatin analogue has been developed a method for 3H-AGG by synthesis of 3H-tetrapeptide obtained by the bombardment of molecules thermally active substances with gaseous tritium, and cysteine. Pharmacokinetic studies AGG in 15 tissues and organs of mice when administered in the dosage form of the drug showed good accessibility to all organs and tissues, including Sa755, and a high affinity to the stomach and bone marrow. Withdrawal from the study of the animal organism in the urine and feces showed that the cumulative excretion of respectively 16 % and 78 %, and mostly ends in 24h surveillance.

Key words: pre-clinical pharmacokinetics, an analog of the hypothalamic hormone somatostatin.

Введение

Аналог гипоталамического гормона соматостатина был синтезирован в лаборатории химического синтеза ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» РАМН. Синтез пентапептида осуществляли постепенным наращиванием пептидной цепи, завершая стадией присоединения молекулы аминокислоты цистеина, предварительно защищенной по функциональным группам [1]. Была показана более высокая противоопухолевая активность синтезированного аналога соматостатина на ДМБА-индуцированных опухолях молочной железы и на РМ-1, перевиваемом раке молочной железы человека, у бестимусных мышей в сравнении с применяемым в клинической практике сандостатином [1]. По результатам изучения противоопухолевой активности препарат был рекомендован для широких доклинических исследований, в рамках которых проводилось изучение его фармакокинетики [2].

Целью работы было доклиническое изучение фармакокинетики АГГ в таблетированной лекарственной форме у мышей с перевитой внутримышечно аденокарциномой молочной железы мышей (Са755).

Задачи работы:

1. Получение 3Н-АГГ методом термической активации газообразного трития.

2. Изучение кинетики распределения и элиминации 3Н-АГГ в крови, органах и тканях мышей после однократного перо-рального введения препарата в дозе 10 мг (0,762 мКи)/кг.

3. Изучение кинетики экскреции 3Н-АГГ и его метаболитов из организма животных с мочой и калом после однократного пе-рорального введения.

Материалы и методы

В исследовании использовали меченый тритием препарат, полученный с помощью метода термической активации газообразного трития [З3 4]. На первом этапе разработки метода получения 3Н-АГГ было показано, что радиохимический выход меченого АГГ оказался низким, а отделение целевого продукта от реактивных примесей затруднено из-за того, что при обработке вещества потоком атомов трития происходило отщепление защитных групп и раз-

рыв связи C-S в остатке цистеина. Для увеличения радиохимического выхода меченого продукта на втором этапе разработки тритиевую метку вводили в тетрапептид, а затем проводили стадию химического синтеза 3Н-тетрапептида с цистеином. Для очистки меченого препарата использовали пластинки TCX Silufol UV-254 и жидкостный хроматограф HP 1050, Hewlett-Packard, США.

Для контроля степени радиохимической чистоты 3Н-АГГ и уточнения его удельной радиоактивности была применена разработанная нами методика ВЭЖХ. Колонка YMC SiO2, 150*3 мм, 5 мкм. Подвижная фаза - 30 : 1,2 : 6 (по объему) гептан : метанол:хлороформ. Скорость подачи 0,4 мл/мин. Температура комнатная. Детектирование при 290 нм. Для количественного определения 3Н-АГГ использовали площадь пика стандартного раствора препарата с известной концентрацией (метод внешней калибровки). Результат измерения количества 3Н-АГГ: 6,76 мг/850 мКи. На рис. 1 представлена хроматограмма 3Н-АГГ и график распределения радиоактивности в собранных в процессе ВЭЖХ фракциях. Радиохимическая чистота полученного Н-АГГ составляла 90 %. Для биологических экспериментов 3Н-АГГ растворяли в микроколичестве ДМСО и в соответствующих аликвотах добавляли в лекарственную форму препарата, подготовленную для введения животным, после чего суспензию тщательно перемешивали.

В эксперименте использовали мышей СВА, самок, весом 21 г с перевитой внутримышечно Са755, на 7-й день после перевивки. Животных группировали по 6 особей на каждую временную точку. Забор образцов органов и тканей проводили отдельно у каждой особи через 0,25; 0,5; 1,0; 3,0; 5,0; 24,0; 48,0 и 96,0 ч после введения препарата. Препарат вводили с помощью желудочного зонда в виде суспензии гранулята таблетированной лекарственной формы в 1 % крахмальном геле в объеме 0,2 мл в дозе 0,21 мг (16 мкКи)/мышь, что составляет 10 мг (0,762 мКи)/кг. Концентрацию 3Н-АГГ определяли в 15 объектах: в крови, плазме, легких, печени, почках, селезенке, головном мозге, опухоли Са755, костном мозге, поджелудочной железе, стенке желудка, стенке кишечника, надпочечниках, лимфатических узлах, тимусе.

Для изучения экскреции 3Н-АГГ с мочой и калом группу животных в количестве 5 особей помещали в метаболическую клетку «Tecniplast», Италия. Мочу и кал мышей собирали раздельно в периоды 0-5 ч, 5-24 ч, 24-48 ч, 48-72 ч и затем обрабатывали.

Навески органов и тканей делали из полученных гомогенатов на весах «Sartorius laboratory L 420 S» в количестве 100±1 мг и подвергали щелочному гидролизу в 3М растворе KOH в объеме, равном 1 мл, при температуре 90 °С в течение 40 мин. Точные аликвоты в объеме 50 мкл вносили во флаконы, содержащие 15 мл сцинтилляционной жидкости «Ultimo-Gold», Perkin Elmer США (из каждого гидролизата в 3 флакона). До получения гемоге-натов образцы желудка и кишечника освобождали от содержимого и тщательно отмывали внутренние поверхности от сорбированных остатков. Образцы бедренной кости вместе с костным мозгом взвешивали и подвергали щелочному гидролизу, принимая весовое содержание костного мозга, равным 4 % от общего веса. Плазму крови стандартно получали из гепаринизированной крови центрифугированием. Кровь и плазму в количестве 100 мкл отбирали пипетками Brandt с постоянным объемом и добавляли

к 1 мл 3М раствора KOH. Образцы подвергали гидролизу в вышеуказанных условиях, затем из каждого гидролизата отбирали материал параллельно в 3 флакона. Таким образом, значение показателя радиоактивности для каждой пробы рассчитывали как среднее значение из 3 измерений.

Кал взвешивали и подвергали щелочному гидролизу при температуре 90 °С с последующим измерением содержания радиоактивности в аликвотах гидролизата. Измеряли объем мочи и концентрацию радиоактивности в аликвотах, помещенных во флаконы со сцинтилляционной жидкостью.

Флаконы с содержащейся в них радиоактивностью обсчитывали на счетчике 1219 Rack beta (spectral) LKB Wallac. Расчет концентраций препарата в крови или ткани:

A х1000 50

+ 2,2 X106 XK X10, где

С - концентрация мкг/мл крови или мкг/г ткани;

А - (dpm) - значение счета радиоактивности;

1000 - мкл - объем пробы (гидролизата 100 мг ткани или 100 мкл крови);

50 - мкл - объем пробы (гидролизата), помещенный в флакон для счета радиоактивности;

2,2 • 106 - dpm - значение счета (количество распадов в минуту, соответствующее 1 мкКюри);

К - соотношение доза/радиоактивность (мкг/мкКюри на животное);

10 - коэффициент перехода к 1 мл крови или грамму ткани.

Величины концентраций АГГ в органах и тканях рассчитывали как средние из 6 параллельных значений концентрации препарата в каждом образце материала от 6 животных, условно относя всю имеющуюся радиоактивную метку к молекуле исходного продукта. Величину радиоактивности каждого образца получали как среднее значение из 3 параллельных измерений.

Результаты

В табл. 1 представлены результаты измерения концентрации 3Н-АГГ в органах и тканях мышей для каждой временной точки, выбранной для отбора образцов. Для сравнительной оценки концентраций 3Н-АГГ в органах и тканях были рассчитаны их соотношения к концентрации препарата в крови (табл. 2).

В табл. 3 представлены расчетные фармакокинетические параметры: площади под AUC, построенными по результатам измерения концентраций препарата в интервале времени 15 мин - 96 ч; соотношение площадей для органа и крови, показывающие величину тропности препарата к объекту исследования, и средние времена его удержания (MRT) органами и тканями животных.

Кинетические кривые на рис. 2-7, описывающие изменения концентрации 3Н-АГГ в крови, плазме и органах животных, и построенные по данным, представленным в табл. 1, были характерными для перо-рального введения: с первой фазой всасывания, когда происходит повышение уровней концентрации препарата, затем фазами распределения и выведения. 3Н-АГГ сравнительно быстро всасывался и поступал в органы и ткани животных: максимальные значения концентраций препарата измеряли в основном через 0,5ч после введения препарата.

Таблица 1

Средние значения концентрации 3Н-АГГ в органах и тканях мышей после однократного перорального введения в дозе 10 мг (0,762 мКи)/кг______________________________________________________________________

Орган, ткань ГС|*, мкг/г ткани

время, ч

0,25 0,5 1,0 3,0 5,0 24,0 48,0 96,0

кровь** 0.50±0.08 0.76±0.10 0.68±0.11 0.48±0.05 0.63±0.05 0.59±0.06 0.51±0.03 0.29±0.03

плазма** 0.75±0.11 1.06±0.12 0.95±0.33 0.62±0.08 0.74±0.07 0.70±0.04 0.55±0.04 0.30±0.03

легкие 1.38±0.04 0.97±0.06 0.92±0.08 0.83±0.19 0.63±0.20 0.58±0.08 0.47±0.07 0.18±0.03

печень 0.60±0.10 1.54±0.08 1.23±0.19 0.94±0.13 0.81±0.10 0.65±0.07 0.58±0.07 0.33±0.08

почки 1.21±0.15 1.81 ±0. 16 1.53±0.50 0.82±0.19 0.76±0.08 0.62±0.03 0.51±0.04 0.28±0.06

селезенка 0.44±0.08 0.74±0.12 0.59±0.08 0.51±0.06 0.59±0.09 0.58±0.07 0.50±0.04 0.28±0.06

головной мозг 0.21±0.02 0.45±0.04 0.48±0.10 0.40±0.07 0.43±0.03 0.51±0.04 0.40±0.04 0.23±0.06

опухоль Са755 0.26±0.05 0.66±0.04 0.58±0.04 0.39±0.06 0.49±0.04 0.56±0.08 0.45±0.05 0.27±0.05

костный мозг 13.45±3.18 10.69±1.79 13.67±2.59 8.73±2.20 8.16±0.65 7.99±0.81 10.53±2.6 7.57±1.50

подж. железа 0.48±0.03 1.00±0.12 1.08±0.20 0.64±0.10 0.70±0.10 0.56±0.01 0.48±0.02 0.28±0.04

желудок 79.49±11.2 52.17±13.0 50.95±8.3 50.95±1.9 25.24±1.86 0.76±0.2 0.59±0.15 0.18±0.05

кишечник 3.81±1.87 15.78±1.33 6.71±1.29 1.75±0.49 1.80±0.59 0.36±0.05 0.31±0.05 0.08±0.02

надпочечники 0.36 0.83 0.61 0.35 0.38 0.26 0.23 0.17

лимф. узлы 0.23 0.49 0.52 0.33 0.40 0.39 0.40 0.19

тимус 0.26 0.61 0.45 0.40 0.47 0.49 0.48 0.19

В надпочечниках, лимфатических узлах, тимусе не показан доверительный интервал, так как количественное определение проводили по одному объединенному образцу. *± величина доверительного интервала; ** мкг/мл.

Таблица 2

Соотношение концентраций 3Н-АГГ в органах и тканях мышей к крови после однократного перорального введения в дозе 10 мг (0,762 мКи)/кг________________________________________________________________

Орган, ткань ГС| орган/ [С1 кровь

время, ч

0,25 0,5 1,0 3,0 5,0 24,0 48,0 96,0

кровь 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0

плазма 1,50 1,39 1,39 1,29 1,17 1,18 1,08 1,03

легкие 2,76 1,27 1,35 1,73 1,00 0,98 0,92 0,62

печень 1,20 2,02 1,81 1,96 1,28 1,10 1,14 1,14

почки 2,42 2,38 2,25 1,71 1,21 1,05 1,0 0,96

селезенка 0,88 0,97 0,87 1,06 0,94 0,98 0,98 0,96

головной мозг 0,42 0,59 0,70 0,83 0,68 0,86 0,78 0,79

опухоль Са755 0,52 0,87 0,85 0,81 0,78 0,95 0,51 0,93

костный мозг 26,9 14,06 20,10 18,19 12,95 13,54 20,65 26,10

поджелудочная железа 0,96 1,31 1,59 1,33 1,11 0,95 0,94 0,96

желудок 158,98 68,64 74,85 106,14 40,06 1,29 1,16 0,62

кишечник 7,62 20,76 9,87 3,65 2,86 0,61 0,61 0,27

надпочечники 0,72 1,10 0,89 0,73 0,60 0,44 0,45 0,58

лимфатические узлы 0,46 0,64 0,76 0,69 0,63 0,66 0,78 0,65

тимус 0,52 0,80 0,66 0,83 0,75 0,83 0,94 0,65

Таблица 3

Фармакокинетические параметры 3Н-АГГ для крови и органов мышей после однократного перорального введения в дозе 10 мг (0,762 мКи)/кг__________________________________________________________________

Орган, ткань Фармакокинетические параметры

АиС, мкг-ч/г AUC орган/АиС кровь MRT, ч

кровь 46,97 1,0 40,48

плазма 52,62 1,12 38,90

легкие 43,71 0,93 35,67

печень 55,38 1,18 38,78

почки 50,72 1,08 37,33

селезенка 45,42 0,97 40,45

головной мозг 36,92 0,78 40,82

опухоль Са755 41,83 0,89 41,31

костный мозг 858,68 18,28 46,90

поджелудочная железа 46,64 0,99 35,79

желудок 501,73 10,68 7,01

кишечник 57,93 1,23 17,65

надпочечники 23,76 0,50 39,83

лимфатические узлы 33,07 0,70 40,94

тимус 38,93 0,83 39,75

AUC - площадь под фармакокинетической кривой; MRT - среднее время удержания

Таблица 4

Экскреция 3Н-соединений с мочой и калом мышей при однократном пероральном введении 3Н-АГГ в дозе 10 мг (0,762 мКи)/кг________________________________________________________________________________

Время отбора экскрементов, ч Среднее значение кумулятивной экскреции в % от введенной дозы

Моча кал сумма

5,0 3,16 30,90 34,06

24,0 12,91 72,25 85,16

48,0 15,59 77,4 92,99

72ч 16,05 78,05 94,1

Соотношение кал/моча - 4,86 -

Рис. 1. Хроматографический анализ 3Н-АГГ Рис. 2. Фармакокинетическая кривая 3Н-АГГ для

и график распределения радиоактивности по крови мышей при однократном пероральном введе-

соответствующим фракциям. нии препарата в дозе 10 мг (0,762 мКи)/кг

время, ч

Рис. 3. Фармакокинетическая кривая 3Н-АГГ для легких мышей при однократном перо-ральном введении препарата в дозе 10 мг (0,762 мКи)/кг.

печень

[С], мкг/г

время, ч

Рис. 4. Фармакокинетическая кривая 3Н-АГГ для печени мышей при однократном пероральном введении препарата в дозе 10 мг (0,762 мКи)/кг.

Рис. 5. Фармакокинетическая кривая 3Н-АГГ для стенки желудка мышей при однократном пероральном введении препарата в дозе 10 мг (0,762 мКи)/кг.

Рис. 6. Фармакокинетическая кривая 3Н-АГГ для стенки кишечника мышей при однократном пероральном введении препарата в дозе 10 мг (0,762 мКи)/кг.

Рис. 7. Фармакокинетическая кривая 3Н-АГГ для костного мозга мышей при однократном пероральном введении препарата в дозе 10 мг (0,762 мКи)/кг

Исключение составили легкие, костный мозг и стенка желудка, где фаза нарастания концентрации 3Н-соединений была короче и приходилась на период 0-15 мин. После достижения максимальных концентраций наблюдалось медленное снижение концентрации препарата практически во всех органах и тканях, кроме стенок желудка и кишечника. В желудке и кишечнике происходило быстрое снижение содержания радиоактивных продуктов, практически на порядок к 24 ч наблюдения, при этом к 5 ч в стенке желудка оставалось 31,7 % от максимального уровня, а в стенке кишечника уже к 3 ч определяли только 11,0 % от максимальной 30 мин концентрации.

Необычно высокие концентрации 3Н-АГГ отмечены в легких в начальный момент наблюдения (15мин) - 1,38 мкг/г, что более, чем в 2 раза больше, чем в печени, крови или плазме. Затем, только к 5 часам, концентрация 3Н-соединения снижалась до уровня крови - 0,63 мкг/мл. В поджелудочной железе концентрация препарата достигала максимальной величины к 1 ч и превышала таковую для крови в 1,6 раза; затем снижалась до уровня крови только к 24 ч после введения препарата. В опухоли Са755 максимальные концентрации отмечались к 0,5 ч - 0,66 мкг/г, далее происходило их медленное уменьшение к 48 ч на 30-35 %.

В желудке (стенке без содержимого) концентрация препарата через 15 мин после введения составила 79,5 мкг/г и за 5 часов снизилась в 3 раза, что отражает как процессы всасывания, так и накопления препарата в исследуемой ткани. Так, в период наблюдения с 0,5 до 3 ч концентрация 3Н-АГГ практически не изменялась, что, видимо, является следствием связывания препарата с рецепторами, содержащимися в стенке желудка. В стенке кишечника происходит подъем концентрации с 3,8 мкг/г к 0,25 ч до 15,78 мкг/г через 0,5 ч, что отражает поступление препарата из желудка; далее к 3 ч наблюдения концентрация 3Н-соединения уменьшается в 9 раз от 15,7 до 1,75 мкг/г. Вероятно, в кишечнике наряду с эвакуацией происходит и всасывание препарата и/или его метаболитов, так как к 5 ч в крови, плазме, селезенке, опухоли, поджелудочной железе и головном мозге было отмечено некоторое увеличение концентрации 3Н-соединений.

Тканями, накапливающими препарат, можно считать костный мозг и желудок, так как коэффициенты тропности (соотношение площадей под АиС к крови) составляют: костный мозг/кровь 18,28 и желудок/кровь 10,7, в то время как для всех других органов величины коэффициентов или незначительно превышали, или были меньше 1.

Таким образом, препарат быстро распределялся в организме животных, АиС для большинства органов и тканей варьирует от 30,0 до 47,0 мкг-ч/мл,г, в печени и почках АИС несколько больше 50-55 мкг-ч/г ,что характерно для экскретирую-щих органов. Накопление препарата отмечено в костном мозге, где АиС больше в 18 раз,3 чем в крови и МЯТ=46,9ч. Высокие концентрации Н-соединения отмечаются (более 10 часов) в стенке желудка 79,510 мкг/г, что, вероятно, обусловлено его связыванием с рецепторами.

Литература

Величины среднего времени удержания (MRT) для большинства органов и тканей были близки по своим значениям: 36ч-41ч. Сравнительно быстро освобождались от 3Н-соединений желудок и кишечник, 7,0ч и 17,65ч, соответственно.

В табл. 4 представлены данные анализа 3Н-радиоактивности фракций мочи и кала животных.

Как видно, максимальное количество 3Н-соединений было выведено мышами в интервале времени 5-24 ч, всего за 24 ч было выведено от введенной дозы 12,91 % с мочой и 72,25 % с калом, а за 72 ч кумулятивная экскреция составляла 94,1 %, в т.ч. 16,05 % с мочой и 78,05 % с калом. Соотношение выведенного количества 3Н-соединений с калом и мочой составляло 4,86 раза.

Средняя скорость экскреции была наибольшей с калом (6,16 % в ч) и мочой (0,63 % в ч) в период 0-5ч от введения препарата.

Заключение

В работе представлены результаты фармакокинетических исследований нового противоопухолевого препарата, пентапептида, аналога гипотала-мического гормона соматостатина. Для идентификации АГГ и его количественного определения в биологических объектах был разработан метод получения меченого тритием препарата, путем химического синтеза 3Н-тетрапептида и цистеина. Для введения радиоактивной метки молекулы тетрапептида подвергались бомбардировке термически активированным газообразным тритием с последующей очисткой целевого продукта.

3Н-АГГ вводили мышам линии СВА с перевитой внутримышечно Са755 перорально в лекарственной форме в дозе 10 мг (761,96 мКи)/кг. Определение концентрации 3Н-АГГ проводили в 15 органах и тканях мышей, включая Са755. Образцы крови и органов для анализа отбирали в 8 временных точках в интервале времени 15мин - 96 ч после введения препарата, а кал и мочу собирали в периоды 0-5 ч, 5-24 ч, 24-48 ч, 48-72 ч.

Фармакокинетические исследования показали доступность 3Н-АГГ для всех изученных органов и тканей, в том числе для головного мозга и Са755. Препарат быстро всасывался и поступал в органы и ткани животных.

Максимальные концентрации 3Н-АГГ в легких, стенке желудка и костном мозге достигались до 15 мин., а в остальных органах и тканях - через 30 мин. после введения препарата.

Величины максимальных концентраций 3Н-АГГ в стенках желудка и кишечника, костном мозге, легких, печени и почках превышали таковую в крови, соответственно, в 104,6 и 20,8; 18,0; 2,0; 2,0 и 2,4 раза.

По соотношению площадей под AUC орган/кровь органами-мишенями для 3Н-АГГ были костный мозг и желудок, для которых величины показателей составляли 183,3 и 10,7, соответственно. Кумулятивная экскреция 3Н-АГГ с мочой и калом мышей в основном завершалась к 24 ч после введения препарата и к 72 ч составляла 16 и 78 %, соответственно, суммарно 94 % от введенной дозы.

1. Кубасова И.Ю., Борисова ЛМ, Киселева М.П. и др. Поиск потенциальных противоопухолевых соединений среды аналогов гипоталамического гормона соматостатина // Российский Биотерапевтический журнал. - 2006. - Т. 5, № 3. - С. 123-7.

2. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / Под общей ред. член-корр. РАМН проф. Р.У. Хабриева. - 2 изд., перераб. и доп. - М.: ОАО изд. «Медицина», 2005. - 832 с. (Методические указания по проведению доклинических исследований фармакокинетики фармакологических веществ и лекарственных средств. - С. 217-229).

3. Budun G.A., Chernysheva M.G., Tyasto Z.A. et. al. A new technique for tritium labeling of humic substances // Radiochimica Acta. - 2010. -98(3). - P. 161-6.