CC BY
57УДК 502:75:582:577.21
Н. В. Савина1, С. В. Кубрак1, Л. В. Милько1, А. В. Кильчевский1, Е. В. Никитина2, К. Ш. Тожибаев2
ДНК-ШТРИХКОДИРОВАНИЕ КАК ИНСТРУМЕНТ ЭКОЛОГИЧЕСКОГО МОНИТОРИНГА И ОЦЕНКИ ВИДОВОГО РАЗНООБРАЗИЯ РЕДКИХ ВИДОВ РАСТЕНИЙ
Государственное научное учреждение «Институт генетики и цитологии Национальной академии наук Беларуси» Республика Беларусь, 220072, г. Минск, ул. Академическая, 27 e-mail: N.Savina@igc.by 2Институт ботаники Академии наук Республики Узбекистан Республика Узбекистан, 100128, г. Ташкент, ул. Дурмон йули, 32 e-mail: botany@academy.uz
Объектами данного исследования стали редкие и исчезающие виды семейств Амариллисовые (Amaryllidaceae), Лилейные (Liliaceae), Ирисовые (Iridaceae) и Яснотковые (Lamiaceae), произрастающие на территории Беларуси и Узбекистана и занесенные в национальные Красные книги. Редкие виды требуют особого внимания, регулярного мониторинга их природных популяций и всестороннего изучения как методами классической систематики, так и методами молекулярно-генетического анализа. Эффективным инструментом инвентаризации видового разнообразия редких растений является метод ДНК-штрихкодирования. В данной работе с помощью комбинаций ДНК-маркеров (ITS2, rbcL, psbA-trnH, matK) получено 39 консенсусных нуклеотидных последовательностей для 12 видов редких растений изучаемых семейств флоры Беларуси. Кроме того, проанализировано 18 видов редких растений изучаемых семейств, произрастающих на территории Узбекистана. Продемонстрирована возможность успешного использования ДНК-штрихкодирования при проведении экологического мониторинга на природоохранных территориях.
Ключевые слова: биоразнообразие, Красная книга, ДНК-штрихкодирование, ДНК-маркеры, ITS2, matK, psbA-trnH, rbcL.
Введение
Концепция биоразнообразия занимает важное место в современной науке и экологической политике. С 1992 года — времени подписания многими государствами Конвенции о биологическом разнообразии — это понятие получило международное звучание. Одно из определений термина «биологическое разнообразие», данное Всемирным фондом дикой природы, звучит как «все многообразие форм жизни на земле, миллионов видов растений, животных, микроорганизмов с их наборами генов и сложных экосистем, образующих живую природу» [1]. Говорят о трех уровнях (ветвях) биоразнообразия: генетическом (разнообразие генов и их вариантов — аллелей), видовом (разнообразие видов в экосистемах) и экологическом (разнообразие сообществ и экосистем). Видовой уровень разнообразия обычно рассматривается как
базовый, а вид является опорной единицей учета биоразнообразия. Видовое разнообразие должно быть систематизировано и нести максимум информации о виде. Инвентаризация видов представляет собой чрезвычайно сложную задачу, учитывая их огромное количество. Несмотря на обширную работу, проведенную систематиками по изучению биологического разнообразия планеты, до сих пор существуют определенные сложности с точной и однозначной идентификацией представителей некоторых таксонов [1, 2].
Генетическое разнообразие — основа непрерывности эволюционного процесса. Генетическая вариабельность позволяет видам адаптироваться в условиях изменяющейся среды, успешно приспосабливаться и оставлять потомство, передавая гены по наследству. Генетическое разнообразие исследуют с применением современных молекулярно-
генетических методов с использованием технологий полимеразной цепной реакции (ПЦР), ДНК-чипирования и секвенирования. Известные методы RAPD (Random amplified polymorphic DNA), RFLP (Restriction fragment length polymorphism), AFLP (Amplified fragment length polymorphism), ISSR (Inter simple sequence repeats), SSR (Simple sequence repeats), DNA-barcoding и др. на данный момент оказывают эффективную помощь систематикам как для оценки генетического разнообразия, так и в целях точной идентификации и систематизации генетических ресурсов [3, 4]. К настоящему времени угрозы биологическому биоразнообразию беспрецедентны: по расчетам, в мире ежедневно исчезает порядка 100-200 видов, а скорость их исчезновения на два порядка выше, чем во времена прошлых эпох массового вымирания видов, и на три порядка выше, чем естественный темп вымирания [5]. Редкие и исчезающие виды требуют особого внимания со стороны работников научных учреждений и природоохранных служб.
Объектами исследования данной работы являются представители семейств Амариллисовые (Amaryllidaceae), Лилейные (Liliaceae), Ирисовые (Iridaceae) и Яснотковые (Lamiaceae), произрастающие на территории Беларуси и Узбекистана и занесенные в национальные Красные книги. Большинство амариллисовых (Amaryllidaceae) является декоративными растениями, в то же время на основе биологически активных веществ, полученных из отдельных представителей рода Allium, производят препараты, оказывающие противомалярийное, фунгицидное, противопротозойное, противовирусное и противовоспалительное действие. Многие представители семейства Лилейных (Liliaceae) — популярные декоративные красивоцветущие растения (тюльпаны, лилии и т. д.). На территории Беларуси произрастает только один охраняемый вид рода Tulipa — тюльпан лесной. Ирисовые (Iridaceae) широко используются в садоводстве благодаря своей исключительной декоративности, некоторые виды нашли применение в парфюмерии и в пищевых целях. Дикорастущие виды Ирисовых являются лекарственными растениями благодаря уникальному набору биологически активных веществ, проявляющих антибиотическую, иммуностимулирующую,
противовирусную и др. активности. Многие Яснотковые (Lamiaceae) являются ценными эфиромасличными культурами, используются в медицине (пустырник, душица, мелисса, чабрец), парфюмерии (розмарин, лаванда, шалфей, мята), в качестве пряностей (базилик, майоран). Некоторые представители семейства медоносны и разводятся при пасеках. В декоративном садоводстве широко используется род Salvia, отдельные дикорастущие представители которого обладают биологически активными веществами инсектицидного действия, способными эффективно заменить химические препараты.
Цель проведенных исследований — оценить использование ДНК-штрихкодирования как инструмента экологического мониторинга и изучения видового разнообразия редких видов растений. Сопровождение образцов редких растений ДНК-штрихкодом даст возможность исключить случаи неверного определения вида, обеспечит контроль чистоты образца и будет служить подтверждением качества биологического материала. Поэтому ДНК-штрихкоды являются неотъемлемой частью информации о редких видах растений, находящихся в условиях долговременного хранения в Республиканском банке ДНК человека, животных, растений и микроорганизмов Института генетики и цитологии. Кроме того, определение маркерных ДНК последовательностей может быть полезным при уточнении таксономического статуса отдельных видов. В отличие от методов молекулярной филогенетики, ДНК-штрихкодирование может рассматриваться только как подход для определения места данного организма в уже существующей классификации, а не для установления новых филогенетических связей.
В данной работе в качестве ДНК-штрихкодов использована ядерная последовательность ITS2 и три митохондриальные — rbcL, psbA-trnH, matK. Маркер ITS2 представляет собой участок ядерной последовательности, который входит в состав рибосомального кластера и локализуется между структурными генами рибосо-мальной РНК 5.8S и 28S. Участок пластидной ДНК rbcL кодирует большую субъединицу рибулозобисфосфаткарбоксилазы, ключевого фермента фиксации СО2 в темновой фазе
фотосинтеза. Некодирующий участок пла-стидной ДНК psbA-trnH представляет собой межгенный спейсер (IGS, Intergenic spacer regions) и расположен между геном, контролирующим синтез белка D1 фотосистемы II, и геном гистидиновой тРНК. Ген matK кодирует матуразу К — фермент сплайсинга интро-нов в хлоропластах, один из наиболее быстро эволюционирующих пластидных генов [6, 7].
При идентификации видов по ДНК-шрих-кодам исследователь полагается на справочные библиотеки штрихкодов, однако они могут быть неполными или содержать ошибки, что в свою очередь ведет к неправильным выводам. Основным критерием эффективности использования нами ДНК-штрихкодов для подтверждения видовой принадлежности является 98-100% совпадение полученной маркерной последовательности с данными NCBI для известного биологического вида. Определение маркерных последовательностей для редких видов растений (в том числе и эндемиков) — представителей флоры Беларуси и Узбекистана — позволит создать собственные региональные референсные базы ДНК-штрихкодов. Решение подобных исследовательских задач в сфере экологии актуально для обеих стран, как для государств, сталкивающихся со сходными проблемами в области сохранения биологического и генетического разнообразия.
Материалы и методы
Исследования выполнены на биологическом материале представителей редких видов семейств Amaryllidaceae, Liliaceae, Iridaceae, Lamiaceae, произрастающих на территориях Республики Беларусь и Республики Узбекистан. Сбор биологического материала на территориях Республики Беларусь (Национальные парки «Нарочан-ский» и «Беловежская пуща», охраняемые территории Брестской, Гомельской и Минской областей) выполнен сотрудниками природоохранных учреждений и специалистами-ботаниками без изъятия растений из мест произрастания согласно рекомендациям, регламентирующим сбор, хранение и транспортировку растительного материала для последующего выделения высококачественной ДНК [8]. Для каждого вида собран биологический материал трех растений, произрастающих удаленно друг от друга. Узбекскими коллегами представлен и совместно проанализирован биологический материал 18 видов растений, в том числе и в виде гербарных образцов. В таблицах 1 и 2 представлены редкие и исчезающие виды растений, включенные в исследование (по данным Красной книги Республики Беларусь, 2015 г. [9] и Красной книги Республики Узбекистан, 2009 г. [10]).
Таблица 1
Редкие и исчезающие виды растений семейств Amaryllidaceae, Liliaceae, Iridaceae, Lamiacea, произрастающие на территории Республики Беларусь
Название представителей семейств (русск. / лат.) Категория охраны
Амариллисовые (Amaryllidaceae)
1 Лук медвежий Allium ursinum III
2 Чемерица Лобеля Veratrum lobelianum III
3 Подснежник снежный Galanthus nivalis ПО*
Лилейные (Liliaceae)
4 Лилия кудреватая Lilium martagon IV
5 Тюльпан лесной Tulipa sylvestris ПО
6 Безвременник осенний Colchicum autumnale ПО
Ирисовые (Iridaceae)
7 Касатик безлистный Iris aphylla I
8 Касатик сибирский Iris sibirica IV
9 Шпажник черепитчатый Gladiolus imbricatus IV
Примечание. *ПО — растения из списка профилактической охраны
Таблица 2
Редкие и исчезающие виды растений семейств Amaryllidaceae, Liliaceae, Iridaceae, Lamiacea, произрастающие на территории Республики Узбекистан
Продолжение таблицы 1
Название представителей семейств (русск. / лат.) Категория охраны
Яснотковые (Lamiaceae)
10 Змееголовник Руйша Dracocephalum ruyschiana II
11 Кадило сарматское Melittis sarmatica (melissophyllum) III
12 Шалфей луговой Salvia pratensis IV
Название представителей семейств (русск. / лат. )
Яснотковые (Lamiaceae)
1 Шалфей Королькова Salvia korolkowii
2 Шалфей бухарский Salvia bucharica
3 Шалфей туповатый Salvia submutica
4 Шалфей колючий Salvia spinosa
5 Шалфей мускатный Salvia sclarea
6 Шалфей тянь-шанский Salvia tianschanica
7 Шалфей Маргариты Salvia margaritae
8 Шалфей лиловосиний Salvia lilacinocoerulea
9 Змееголовник продолговатолистный Dracocephalum oblongifolium
10 Змееголовник цельнолистный Dracocephalum integrifolium
11 Змееголовник нуратавикум Dracocephalum nuratavicum
Лилейные (Liliaceae)
12 Тюльпан Введенского Tulipa vvedenskyi
13 Тюльпан Королькова Tulipa korolkowii
14 Тюльпан родственный Tulipa affinis
15 Тюльпан сомнительный Tulipa dubia
16 Тюльпан двуцветковый Tulipa biflora
Амариллисовые (Amaryllidaceae)
17 Лук чашеносный Allium cupuliferum
Ирисовые (Iridaceae)
18 Касатик согдийский Iris sogdiana
На рисунке 1 представлены последовательные этапы ДНК-штрихкодирования изучаемых видов растений.
На этапе 2 предлагается преимущественно двухлокусный алгоритм видоидентификации с помощью маркеров ITS2 и rbcL, в случаях получения результатов с недостаточной
достоверностью (менее 98%) используется трех-, четырехлокусный алгоритм с подключением маркеров psbA-trnH и matK. Выбор пары ITS2-rbcL в качестве первоначальных маркеров обусловлен их успешной амплификацией для большинства растений и хорошим качеством сиквенсов.
Этап 1
сбор растительного материала выделение ДНК
> оценка качества ДНК с помощью ко нтр о л ьно й р еакции ПЦР
> амплификация двух маркерных последовательностей -ITS2 и rbcL для каждого растения
1 при необходимости проведение амплификации дополнительных маркерных последовательностей psbA-tmH и matK
■ секвенирование полученных маркерных последовательностей
■ анализ результатов в базе данных NCBI
Рис. 1. Алгоритм ДНК-баркодинга растений
Для выделения тотальной ДНК из растительного материала использовали коммерческий набор DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Германия). Оценку качества выделенной ДНК проводили как спектрофотометрически (по значениям коэффициента OD260/280), так и проведением контрольной реакции ПЦР с праймерами к генам «домашнего хозяйства» (в данном случае к гену большой субъединицы рибосомы 26S рРНК). Для последующей работы концентрации проб ДНК были выровнены путем разведения матрицы до 10-12 нг/мкл.
Последовательности праймеров и необходимые рекомендации по условиям проведения амплификации ДНК-штрихкодов ITS, rbcL, psbA-trnH и matK приведены в работах Савиной Н. В. и соавт. (2018) [11]; Dunning L.T. et. Savolainen V. [12]. ПЦР проводили в финальном объеме 8-10 мкл; смесь для амплификации включала готовый буфер для проведения ПЦР Quick-load Taq 2X Master Mix (ОДО «Праймтех», Республика Беларусь) [13], прямой и обратный праймеры в конечной концентрации 0,3 пмоль/мкл и бидистиллированную воду. Вносили 1 мкл матрицы ДНК в концентрации 6-10 нг/мкл. Амплификацию проводили в термоциклере C1000 Touch Thermal Cycler (BioRad, США). Результаты амплификации проверяли в 1% агарозном геле, для маркера psbA-trnH использовали 2% гель из-за значительной вариабельности продуктов амплификации.
Продукты амплификации очищали с помощью ферментов Exonuclease I и Shrimp Alkaline Phosphatase (Thermo Fisher Scientific,
США) согласно рекомендациям производителя. Терминирующую реакцию проводили с использованием коммерческого набора Brilliant Dye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Nimagen, Нидерланды) с последующей очисткой продукта реакции этанолом. Определение нуклеотидной последовательности проводили на автоматическом генетическом анализаторе ABI 3500 DNA Analyzer (Applied Biosystems, США). Хроматограммы сиквен-сов анализировали в программе ChromasPro 13.3. Для одного вида анализировали по три индивидуальных растения, для каждого ДНК-штрихкода получено по четыре хроматограммы — три с прямым и одна с обратным прай-мером. С помощью модуля Contig Express Project (программа Vector NTI) и программы MEGA 4 проведено выравнивание индивидуальных последовательностей каждого растения для получения результирующей (кон-сенсусной) маркерной последовательности. Консенсусные последовательности сравнивали с последовательностями ДНК аналогичных видов, хранящимися в международных базах данных NCBI BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) [14] и BOLD (Barcode of Life Data Systems) [15]. Выявление в NCBI нуклеотидной последовательности известного биологического вида, на 98-100% совпадающей с анализируемой, являлось подтверждением видовой принадлежности изучаемого растения. Множественное выравнивание последовательностей и построение дендрограмм проводили с помощью программы MEGA 4, дендрограм-мы строили на основе матрицы попарных генетических расстояний методом ближайшего соседа Neighbour-Joining.
Результаты и обсуждение
Использование маркерных последовательностей ITS2, rbcL, psbA-trnH и matK для идентификации представителей редких и исчезающих видов растений Республики Беларусь
В таблице 3 представлены результаты идентификации редких растений семейств Ama-ryllidaceae, Liliaceae, Iridaceae, Lamiacea по четырем маркерным последовательностям.
Как видно из таблицы, с целью максимальной эффективности видоидентификации и высокой достоверности результатов для всех видов выполнено трех-, четырехлокусное
Таблица 3
Результаты генетической идентификации редких растений семейств Amaryllidaceae, Liliaceae, Iridaceae, Lamiaceae с помощью ДНК штрихкодов (место произрастания — Республика Беларусь)
№ п/п Вид ДНК-штрихкод
ITS2 rbcL psbA-trnH matK
Амариллисовые (Amaryllidaceae)
1 Лук медвежий + + + -
2 Подснежник снежный + + N +
3 Чемерица Лобеля + + + +
Ирисовые (Iridaceae)
4 Касатик безлистный N (есть у авторов) N (есть у авторов) N +
5 Касатик сибирский + + + +
6 Шпажник черепитчатый + N есть у авторов + +
Яснотковые (Lamiaceae)
7 Змееголовник Руйша N (есть у авторов) + N (есть у авторов) N (есть у авторов)
8 Шалфей луговой + + - +
9 Кадило сарматское + + + -
Лилейные (Liliaceae)
10 Безвременник осенний - + + +
11 Лилия кудреватая + + + -
12 Тюльпан лесной - + - +
Примечание. «+» — эффективность видоидентификации 98-100%; «№> — последовательность получена авторами, но отсутствует в базе данных; «-» — данные секвенирования не получены
генотипирование. Для всех маркеров продемонстрирована хорошая воспроизводимость результатов амплификации. Размер маркерного участка ITS2 у изучаемых нами растений составлял 246-469 п. н., что превышает общеизвестные значения о его размерах у покрытосеменных — 220-240 п. н. Этот факт объясняется выбором праймеров, рекомендованных CCDB [16], обеспечивающих амплификацию не только межгенного спейсера ITS2, но частично и участков генов 5^ и 28& В базах данных NCBI, как правило, приведены длины именно объединенного участка ITS2, что облегчало для нас поиск и выравнивание последовательностей. Размеры последовательностей гЬ^ находились в диапазоне 519-582 п. н., psbA-trnH — 218-569 п. н. и matK — 627-859 п. н. Маркеры ITS2 и гЬ^ лучше отвечали требованию
«качество сиквенсов»: для них секвенированы последовательности с высокой длиной прочтения и незначительными ошибками с возможностью ручного исправления.
Согласно данным таблицы 3, набор из трех ДНК-штрихкодов позволил провести успешную идентификацию видов с точностью 98-100% (за исключением № 4 и 7). Неинформативным оказалось применение штрих-кода matK для видов № 1, 9 и 11; штрихкода psbA-trnH для видов № 8,12 и маркера ITS2 для видов № 10, 12. Наиболее успешным было применение маркера rbcL: во всех случаях консенсусные маркерные последовательности видов на 98-100% совпали с последовательностями NCBI. Как видно из таблицы 3, идентификация отдельных видов растений (№ 4, 7, 12) не укладывается в двух-, а иногда и четы-рехлокусный алгоритм. Во-первых, для ряда
изучаемых нами редких растений в международных базах отсутствуют интересующие нас маркерные последовательности, что не позволяет провести сравнительный анализ. Например, для Змееголовника Руйша (№ 7, категория охраны II) в базе данных NCBI приведены только два штрихкода rbcL, а в базе данных информационной платформы BOLD представлена только последовательность matK. Для Касатика безлистного (№ 4, категория охраны I) в NCBI есть информация только по маркеру matK. В связи с этим планируется депонировать полученные нами последовательности в международные базы данных. Во-вторых, из литературы известно, что в некоторых случаях полиморфизм используемых нами ДНК-штрихкодов оказывается недостаточным. Так, для многих семейств (Сложноцветные, Лилейные, Яснотковые и др.) в качестве ДНК-
штрихкода может использоваться вариабельный участок между генами транспортных РНК лейцина и фенилаланина — trnL-trnF спейсер, включая интрон гена trnL [17]. В исследованиях по ДНК-баркодингу видов семейства Орхидные предлагаются комбинации хлоро-пластных маркеров atpF-atpH (спейсер между генами, кодирующими субъединицы АТФ син-тазы) и psbK-psbI (спейсер генов, кодирующих компоненты фотосистемы II) [18]. Поиск и введение дополнительных маркеров необходим и в случае, когда полученный в результате ДНК-баркодинга результат видоидентифика-ции с имеющимися маркерами не совпадает с первоначальным ботаническим описанием.
В таблице 4 представлены результаты трех-локусной идентификации на примере вида Лук медвежий (Allium ursinum, семейство Amaryllidaceae).
Таблица 4
Результат идентификации вида Лук медвежий (Allium ursinum) с помощью трехлокусной панели
ДНК-штрихкод
Консенсусная нуклеотидная последовательность
Буквенная последовательность
QR-код
Идентификационный номер базы данных
ITS2
TGGGCTTCTCCCAGTTCGCTCGCCGTTACTATGGG
AATCCTTGTAAGTTTCTTCTCCTCCGCTTATTGATA
TGCTTAAACTCAGCGGGTGCCCCCGCCTGACCTG
AGGTCATGGTCCGAGCCTGCAAAATGTGCAAACA
TCGTCATCGGTTTTACTTCTTGTAAGTCGTGGCTA
GGGGTCTTATGCACAACTGGAGGCTTGATGCGCA
CAATCTATCCACCTTTCGTCGCATGCAAAACATAG
CAACGACCATCACTCAAACCCGCCGCACAACGA
AAGCACAAAGGGTCAATATCCACATCTACACACA
CCAATACGCACGTAATGGTTTACACGTGTTTGGA
GTGACAAAGGCGTGACGCCCAAGCAGACGTGCC
CTTGACCTGATGGTCTCGGGCGCAAC (403 п. н.)
GenBank Sequence ID: KX167936.1 Identities: 100%
rbcL
TAGACATTCGTAAACTGCTCTACCGTAGTTTTTTG
CGGATAATCCCAATTTTGGTTTAATAGTACATCCC
AATAGGGGACGTCCATACTTGTTCAATTTATCTCT
TTCAACTTGGATGCCGTGAGGCGGGCCTTGGAA
AGTTTTGGAATAAGCAGGGGGAATTCGCAGATCC
TCTAAACGTAGAGCTCGCAGGGCTTTGAAACCA
AATACATTACCCACAATGGAAGTAAACATGTTAG
TAACAGAACCTTCTTCAAAAAGGTCTAAAGGATA
AGCTATATAAGCAATAAATTGATTTTCTTCCCCAA
TAACGGCCTCAATGTGGTAGCATCGTCCTTTGTA
ACGATCAAGACTGGTAAGTCCATCAGTCCACACA
GTTGTCCAGGTACCAGTAGAAGATTCGGCGGCTA
CCGCAGCCCCTGCTTCTTCAGCGGGAACTCCGG
GTTGAGGAGTTACTCGGAATGCTGCTAAGATATC
AGTATCTTTGGTTTCGTAATCAGGAGTATAATAAG
TCAATCTGTAATCTTTAACACCAGCTTTAAATCCA
ACACTTGCTTTA (559 п. н.)
GenBank Sequence ID: KM360624.1 Identities: 100%
Продолжение таблицы 4
ДНК-штрихкод
Консенсусная нуклеотидная последовательность
Буквенная последовательность
QR-код
Идентификационный номер базы данных
psbA-trnH
TTCCATCTACAAATGGATAAGACTTTTGTCTTAA
TGTATTAAGAATTGTCSAACGAAGGAGCTGTAC
CTAATATCTATTGGGTATAGCTCCCGTTATTTTTC
TTTATCATAAGGTTATCCCCCGCCAATGAATGAT
AAGTATCTATTTTTTTTTTCAAAATTAACGACGA
GATTTATTATCGTTTCTCGCATGTCTCGCGAAAG
TCARAGTAGGCGCGAATTCTCCCAATTTGTGAC
CTACCATACGATCTGTTATATAAATAGGTAAATG
TTCCTTTCCATTATGAATAGCGATTGTATGGCCA
ATCATTTTGGGTATAATGGTARATGCCCGARAC
CAAGTTACTATTATTTCTTTCTCCTCCCTCATGT
TGAGTTTTTCAATTTTTCTTGATAAATGATTAGC
TACAAAAGGGTTTTTTTTTAG (427 п. н.)
GenBank Sequence ID: HF572800.1 Identities:
99%
В таблице 4 представлены консенсусные последовательности, полученные в результате сравнения четырех сиквенсов для отдельных растений вида Лук медвежий (Allium ursinum), которые в каждом случае достоверно (98-100%) определяют вид Лук медвежий (Allium ursinum, Семейство Amaryllidaceae). Наряду со стандартным форматом видовые маркерные последовательности представлены в виде QR-кодов (Quick Response Code, код быстрого реагирования). Стандартный формат представления — это длинная буквенная последовательность (в нашем исследовании для отдельных видов до 900 п. н.), полученная в результате секвениро-вания. Такой формат неудобен для хранения данных, учитывая, что каждый образец может сопровождаться дополнительной геоботанической и таксономической информацией, что в конечном итоге приводит к большим объемам совокупных данных. С целью сжатия информации, полученной в ходе ДНК баркодирования, в 2012 г. появились предложения использовать двумерные штрихкоды. Использование с этой целью одномерных ID-кодов оказалось неэффективным из-за их недостаточной мощности кодирования и степени сжатия. Среди нескольких типов 2Б-штрихкодов QR оказался наиболее подходящим, его эффективность сжатия — одна из лучших [19].
Используемый нами в работе набор ДНК-штрихкодов — ITS2, rbcL, psbA-trnH, matK — позволил провести успешную идентификацию видов растений семейств Amaryllidaceae, Liliaceae, Iridaceae, Lamiacea, при этом сход-
ство с аналогичными последовательностями в базе данных NCBI составило не менее 98%. Совпадение последовательностей дает возможность составления референсной библиотеки ДНК-штрихкодов для редких и исчезающих видов растений, произрастающих на территории Республики Беларусь.
Сравнение маркерных последовательностей видов семейств Amaryllidaceae, Liliaceae, Iridaceae, Lamiaceae, произрастающих на территории Беларуси и Узбекистана
Проведено сравнение результатов секвени-рования последовательностей ITS2 и matK у представителей двух родов Salvia (Шалфей) и Dracocephalum (Змееголовник) семейства Lamiaceae.
Наибольший интерес для узбекской стороны представляет генетическая идентификация видов семейства Яснотковые (шалфеи, змееголовники) и Лилейные (тюльпаны). Узбекистан является одним из ключевых участков видового разнообразия тюльпанов, флора этой страны насчитывает 34 дикорастущих вида, 18 из которых вошли в последнее издание Красной книги Узбекистана. Большой интерес представляют и виды рода Salvia (шалфей). В настоящее время для республики Узбекистан отмечено 25 видов рода Salvia, объединенных в 4 подрода (Salvia, Sclarea, Macrosphace и Perovskia), из них 3 вида эндемичны для Узбекистана, 6 видов краснокнижных. С точки зрения практического использования в медицине интерес представляют препараты шалфея лекарственного в качестве
противовоспалительных и антисептических средств при заболеваниях верхних дыхательных путей; трава шалфея эфиопского входит в состав сбора, применяемого при некоторых опухолевых заболеваниях, анацидном гастрите, язве; весьма перспективным является шалфей мускатный (Salvia sclarea L.), эфирное масло которого используется как ароматическое, антисептическое и противогрибковое средство [20].
Виды рода Salvia, изученные в данной работе, являются представителями трех подродов: под-род Salvia (S. korolkowii Regelet Schmalh., S. sub-mutica Botsch. et Vved., S. lilacinocoeruleaNevs-ki), подрод Sclarea (S. spinosa L., S. sclarea L.) и подрод Macrosphace (S. margaritae Botsch.). S. submutica—эндемик Памиро-Алтая (сбор — горы Нуратау), S. lilacinocoerulea—эндемик Западного Памиро-Алтая (сбор — горы Байсун), S. korolkowii — эндемик Тянь-Шаня (сбор — горы Чаткал), S. margaritae — эндемик Памиро-Алтая, S. sclarea и S. spinosa — распространены в Средней Азии и на Кавказе.
По результатам генотипирования вида Salvia pratensis (Республика Беларусь) сходство с последовательностями в базах данных по штрих-коду ITS2 составляет 100% (код сходной последовательности KX166755.1), по штрихкоду matK — 99% (JN95092.1). Для ряда видов растений флоры Узбекистана, включенных в исследование, в базах данных NCBI и BOLD не представлены выбранные маркерные последовательности (для S. submutica, S. lilacinocoerulea, S. tianschanica, D. oblongifolium).
Анализ дендрограмм (рис. 2, 3), построенных на основании нуклеотидной вариабельности в областях двух маркеров (ядерном ITS2 и хлоропластном matK), выделил несколько кластеров для таксонов рода Salvia, по составу совпадающих с таксономической классификацией рода, основанной на морфологических признаках. По вариабельности хлоропласт-ного маркера matK виды с широким ареалом S. sclarea и S. pratensis, принадлежащие подроду Sclarea, составили отдельную группу (рис. 2). Виды подрода Salvia: S. submutica, S. lilacinocoerulea, S. korolkowii выделились в отдельные ветви. Вид S. margaritae (подрод Macrosphace) из флоры Узбекистана образовал самостоятельную ветвь, генетически обособленную от остальных видов.
Сравнение вариабельности маркера ITS2, являющегося фрагментом ядерного генома, показало, что шалфей луговой (Salvia pratensis), единственный охраняемый вид шалфея, произрастающий на территории Беларуси, является сестринской группой по отношению к остальным видам подрода Sclarea — шалфею колючему (S. spinosa) и шалфею мускатному (S. sclarea), произрастающим на территории Узбекистана (рис. 3). Однако шалфей луговой генетически обособлен от этих видов (колючего и мускатного), что объясняется его биогеографической принадлежностью, подтверждая иной процесс видообразования и эволюцию морфологических признаков. Вместе виды с широким ареалом S. sclarea, S. spinosa, S. pratensis, принадлежащие подроду Sclarea, составили отдельную группу.
- 7BY-S pratensis-mat
- 49UZ-S sclarea-mat
-6UZ-S.kor-mM
-26UZ-S submut-mal
- 63UZ-S lilac i-mat
-62UZ-S.margarit-mat
Рис. 2. Иерархическая кластеризация 6 таксонов рода Salvia, выполненная по данным сравнения последовательности участка matK 7BY — Шалфей луговой / Salvia pratensis; 49 UZ — Шалфей мускатный / Salvia sclarea; 62UZ — Шалфей Маргариты / Salvia margaritae; 6UZ — Шалфей Король-кова / Salvia korolkowii; 26 UZ — Шалфей туповатый / Salvia submutica; 63 UZ — Шалфей лиловосиний / Salvia lilacinocoerulea; BY — Беларусь; UZ — Узбекистан
- 62UZ-rez-Sniargar-ITS -6UZ-rez-S.korol-ITS
-44UZ-rezS. spinosa-ITS -49UZ-rez-S.sclarea-ITS -7BY-r5z-S-pratensrs-ITS
Рис. 3. Иерархическая кластеризация 5 таксонов рода Salvia, выполненная по данным сравнения последовательности участка ITS2 7BY — Шалфей луговой / Salvia pratensis; 44UZ — Шалфей колючий / Salvia spinosa;49 UZ — Шалфей мускатный / Salvia sclarea; 62UZ — Шалфей Маргариты / Salvia margaritae; 6UZ — Шалфей Королькова / Salvia korolkowii; BY — Беларусь; UZ — Узбекистан
В мировой флоре встречаются более 70 видов рода Dracocephalum, во флоре Центральной Азии — 26 видов, во флоре Узбекистана род представлен 15 видами, которые в основном распространены в северо-восточной и юго-восточной частях страны, большинство из видов являются эндемичными, а три внесены в Красную Книгу Республики Узбекистан (2009) [21]. Центром распространения рода считаются горы Памиро-Алтая и Тянь-Шаня. D. nuratavicum — эндемик Узбекистана (сбор — горы Нуратау), D. Ше^Отт — эндемик Узбекистана (сбор — Западный Тянь-Шань, Угамский хребет), D. оЬ-longifolium — ареал охватывает некоторые хребты Западного Тянь-Шаня и Памиро-Ал-тая (сбор Западный Тянь-Шань, Пскемский хребет). В фонде Национального гербария Узбекистана (TASH) хранится более 1700 гер-барных образцов 22 видов рода Змееголовник (Dracocephalum, семейство Lamiaceae).
Так как в базах данных не представлены последовательности ITS2 для белорусского вида Dracocephalum ruyschiana, аналогичное сравнение для видов рода Dracocephalum, произрастающих на территориях Беларуси и Узбекистана, выполнено только по последовательностям matK для Змееголовника Руйша (О. ruyschiana, флора Беларуси) и трех видов змееголовника флоры Узбекистана (О. nuratavicum.l О. oblongifolium, О. integrifolium). На рисунке 4 представлена дендрограмма, отражающая взаимоотношения внутри рода Оracocephalum при сравнении участка matK.
Полученные результаты в представленной дендрограмме согласуются с секционным делением рода на два подрода. Так, рассматрива-
Рис. 4. Иерархическая кластеризация 4 видов рода Оracocephalum, выполненная по данным сравнения участка тоК
6BY — Змееголовник Руйша /Оracocephalum ruyschiana; 42И2 — Змееголовник нуратавикум / Оracocephalum nuratavicum; 54И2 — Змееголовник продолговатолист-ный / Оracocephalum oblongifolium; 55И2 — Змееголовник цельнолистный / Оracocephalum integrifolium;
ВУ — Беларусь; Ш — Узбекистан
емые таксоны D. oblongifolium, D. integrifolium, D. nuratavicum формируют отдельную группу, демонстрирующую принадлежность к одному подроду Dracocephalum. Исключительное положение вида D. ruyschiana объясняется принадлежностью данного таксона к подроду Ruyschiana и территориальной изолированностью, тем самым подтверждая морфологическую таксономию данного рода [22].
Заключение
На примере образцов редких видов растений, представителей четырех семейств Amaryllidaceae, Liliaceae, Iridaceae, Lamiacea, продемонстрирована возможность успешного использования ДНК-штрихкодирования при проведении инвентаризации биологических ресурсов и экологического мониторинга природоохранных территорий. С помощью двухлокусных - четырехлокусных комбинаций ДНК-маркеров (ITS2, rbcL, psbA-trnH, matK) получено 39 консенсусных нуклеотидных последовательностей для 12 видов редких растений изучаемых семейств, произрастающих на территории Республики Беларусь, что дает возможность создания собственной региональной референсной базы ДНК-штрихкодов. Маркеры ITS2 и rbcL лучше отвечали требованиям, предъявляемым к штрихкодам по успешности амплификации и качеству сиквенсов.
Наряду со стандартным общепринятым буквенным форматом полученные видовые маркерные последовательности могут быть представлены в виде актуальных в настоящее время QR-кодов. Учитывая, что при создании QR-кода для каждого образца может быть включена дополнительная геоботаническая и таксономическая информация, подобный формат представления данных более предпочтителен.
Проведено сравнение результатов секвени-рования последовательности ITS2 и matK у представителей двух родов Salvia (Шалфей) и Dracocephalum (Змееголовник) семейства Lamiaceae, произрастающих на территории Беларуси и Узбекистана. Полученные результаты согласуются с морфологической таксономией родов Salvia и Dracocephalum.
Работа выполнена при финансовой поддержке Белорусского Республиканского Фонда Фундаментальных Исследований (договор с БРФФИ№ Б19УЗБГ-015 от 21.06.2019 г.).
Список использованных источников
1. Примак, Р. Основы сохранения биоразнообразия / Р. Примак ; пер. с англ. О. С. Якименко, О. А. Зиновьевой. - М.: Издательство Научного и учебно-методического центра, 2002. - 256 с.
2. Barcoding of life: Беларусь - участник глобальной инициативы по ДНК-штрих-кодированию жизни / Н. В. Воронова [и др.] // Труды БГУ. - 2014. - Т. 9, ч. 1. - С. 167-171.
3. Нигматуллина, Н. В. Молекулярные маркеры, применяемые для определения генетического разнообразия и видоидентификации дикорастущих растений / Н. В. Нигматуллина, А. Р. Кулуев, Б. Р. Кулуев // Биомика. - 2018. -Т. 10, № 3. - С. 290-318. doi: 10.31301/2221-6197.bmcs.2018-39.
4. Рябушкина, Н. А. Специфика выделения ДНК из растительных объектов / Н. А. Рябуш-кина, М. Е. Омашева, Н. Н. Галиакпаров // Биотехнология. Теория и практика. - № 2. -2012. - С. 9-26.
5. Бродский, А. К. Глобальный экологический кризис: взгляд на проблему через призму биоразнообразия / А. К. Бродский, Д. В. Сафронова // Междисциплинарный научный и прикладной журнал «Биосфера». -2017. - Т. 9, № 1. - С. 48-70. doi: 10.24855/ biosfera.v9i1.323/www.21bs.ru.
6. Kress, W. J. A two-locus global DNA barcode for land plants: the coding rbcL gene complements the non-coding trnH-psbA spacer region / W. J. Kress, D. L. Erickson // PLoS One. - 2007. -Vol. 2, № 6. - P. 1-10.
7. Hollingsworth, P. M. Choosing and using a plant DNA barcode / P. M. Hollingsworth, S. W. Graham, D. P. Little // PLoS One. - 2011. -Vol. 6, № 5. - P. 1-28.
8. Памятка по сбору биологического материала редких и находящихся под угрозой исчезновения на территории Республики Беларусь видов растений с целью молекуляр-но-генетических исследований / Н. В. Савина [и др.]; Институт генетики и цитологии НАН Беларуси. - Минск, 2017. -7 с.
9. Красная книга Республики Беларусь. Растения: редкие и находящиеся под угрозой исчезновения виды дикорастущих растений / гл. редкол.: И. М. Качановский [и др.]. - 4-е изд. - Минск: Беларус. Энцыкл. iм.П. Броую, 2015. - 448 с.
10. Красная книга Республики Узбекистан. Растения и грибы / редкол.: Н. М. Ума-ров [и др.]. Ташкент: Chinor ENK, 2009. -356 с.
11. Подбор маркеров для ДНК-баркодинга диких видов семейства Orchidaceae на примере Anacamptis morio L. / Н. В. Савина [и др.] // Молекулярная и прикладная генетика: сб. науч. тр. / Институт генетики и цитологии НАН Беларуси. - 2018. - Т. 24. -С 5-11.
12. Dunning, L. T. Broad-scale amplification of matK for DNA barcoding plants, a technical note / L. T. Dunning, V. Savolainen // Bot J Lin Soc. - 2010. - Vol. 164. - P. 1-9.
13. ОДО «Праймтех» - реагенты и материалы для молекулярной биологии [Интернет-сайт компании Электронный ресурс]. - Режим доступа: http://primetech.by. - Дата доступа 18.05.2020.
14. NCBI BLAST [Electronic resource] / National Center for Biotechnology Information, Basic Local Alignment Search Tool. - Mode of access: https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast. cgi. - Date of access: 11.05.2020.
15. BOLD Systems [Electronic resource]: The Barcode of Life Data Systems / CCDB (The Canadian Centre for DNA Barcoding). - Mode of access: http://ccdb.ca/http://boldsystems.org/in-dex.php / Public_Primer_PrimerSearch. - Date of access: 18.05.2020.
16. CCDB [Electronic resource] / Canadian Centre for DNA Barcoding. - Mode of access: http://ccdb.ca/. - Date of access: 17.01.2018.
17. Species identification using sequences of the trnL intron and the trnL-trnF IGS of chloro-plast genome among popular plants in Taiwan / Tsai Li-Chin [et al.] // Forensic Sci Int. - 2006. -Vol. 164 (2-3). - P. 193-200. doi: 10.1016/j. forsciint.2006.01.007.
18. DNA barcoding of Orchidaceae in Korea / Kim H.M. [et al.] // Mol. Ecol. Resour. - 2014. -Vol. 14(3). - Р. 499-507. doi: 10.1111/17550998.12207.
19. DNA Barcode Goes Two-Dimensions: DNA QR Code Web Server / Liu C. [et al]. -PLoS One. - 2012. - Vol.7, № 5. - e35146. doi: 10.1371/ journal.pone.0035146.
20. Губанова, Е. А. Фармакогностиче-ское изучение травы шалфея мускатного (Salvia sclarea L.): дис. ... канд. фарм. наук
14.04.02: 21.12.2010 / Е. А. Губанова. -2010. - 157 с.
21. Абдуллаева, Н. С. Род Dracocephalum L. (Lamiaceae) во флоре Узбекистана / Н. С. Абдуллаева, О. К. Ходжиматов // Бюл-
летень Брянского отделения РБО. - 2016. -№ 2(8). - С. 3-8.
22. Буданцев, А. Л. Система рода Dracocephalum (Lamiaceae) / А. Л. Буданцев // Бот. журн. - 1987. - Т. 72, № 2. - С. 260-267.
N. V. Savina1, S. V. Kubrak1, L. V. Milko1, A. V. Kilchevsky1, E. V. Nikitina2, K. Sh. Tojibaev2
DNA BARCODING AS A TOOL FOR ECOLOGICAL MONITORING AND ASSESSING OF SPECIES DIVERSITY OF RARE PLANT SPECIES
1State Scientific Institution "Institute of Genetics and Cytology of the National Academy of Sciences of Belarus" 27, Akademicheskaya St., 220072 Minsk, the Republic of Belarus e-mail: N.Savina@igc.by institute of Botany of the Academy of Sciences of the Republic of Uzbekistan 32, Durmon Yuli St., 100125, Tashkent, the Republic of Uzbekistan e-mail: botany@academy.uz
Objects of the study were rare and endangered species of the Amaryllidaceae, Liliaceae, Iridaceae and Lamiaceae families growing in the territories of Belarus and Uzbekistan and listed in National Red Books. Rare species require special attention, regular monitoring of their natural populations and comprehensive study, both by the methods of classical taxonomy and molecular-genetic analysis. DNA barcoding as a tool for inventorying the species diversity of rare plants was used in work. Using the combinations of DNA markers (ITS2, rbcL, psbA-trnH, matK), 39 consensus nucleotide sequences were obtained for 12 rare plant species of the studied flora families of Belarus. The successful application of DNA barcoding during environmental monitoring in nature conservation areas was demonstrated as possible.
Keywords: biodiversity, Red Book, DNA barcoding, DNA markers, ITS2, matK, psbA-trnH, rbcL.
Дата поступления статьи: 14 сентября 2020 г.
