CC BY
34DOI https://doi.org/10.47612/1999-9127-2022-33-7-17 УДК 502:75:582:577.21
Н. В. Савина, С. В. Кубрак, Л. В. Милько, А. В. Кильчевский
АНАЛИЗ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ TTS-РАЙОНА РИБОСОМНОЙ ДНК ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ РЕДКИХ ВИДОВ СЕМЕЙСТВА
RANUNCULACEAE
Государственное научное учреждение «Институт генетики и цитологии Национальной академии наук Беларуси» Республика Беларусь, 220072, г. Минск, ул. Академическая, 27 e-mail: N.Savina@igc.by
Продемонстрирована эффективность использования ITS-района в качестве ДНК-штрихкода для генетической идентификации растений редких и охраняемых видов семейства Лютиковые (Ranunculaceae), включенных в Красную Книгу Республики Беларусь. Методом ДНК-штрихкодирования с использованием как ITS-района, так и более компактного межгеного спейсера ITS2, показано, что 11 видов семейства Ranunculaceae, относящихся к 2 подсемействам и 7 родам, хорошо различимы на молекулярном уровне. Филогенетическое взаимоотношение 11 исследуемых видов, построенное на основании нуклеотидной вариабельности ITS-района, полностью согласуется с существующей таксономией этого семейства, основанной на морфологических и цитологических особенностях. Полученные результаты позволяют рассматривать участок ITS2 в качестве мини-штрихкода для быстрой или дополнительной видоидентификации.
Ключевые слова: биоразнообразие, Лютиковые, Ranunculaceae, ДНК-штрихкодирование, ITS-район, ITS2.
Введение
Мониторинг занесенных в Красную книгу Республики Беларусь видов растений и грибов является одним из важнейших направлений государственной политики в области охраны окружающей среды и обеспечивается за счет функционирования Национальной системы мониторинга окружающей среды [1]. Сбор, обобщение, анализ, хранение и накопление различных типов информации (литературной, фондовой, ведомственной и др.) об объектах растительного мира и среде их произрастания являются важными задачами подобного наблюдения. На основе полученных данных строятся прогнозы динамики растительного мира, помогающие в решении проблем сохранения биологического разнообразия, обеспечения его устойчивого состояния и рационального использования ресурсов [1-2]. Информация о генетическом разнообразии является необходимой составляющей знаний о состоянии окружающей среды, а ее накоплением и хранением занимается ряд научных учреждений Республики Беларусь. Деятельность Республиканского банка ДНК человека, растений, животных и микроорганизмов наряду со сбо-
ром и депонированием генетического материала сельскохозяйственных растений направлена на сохранение и изучение генофонда диких видов растений, произрастающих на территории Беларуси. ДНК-идентификация редких растений дает возможность исключить случаи неверного определения вида и может быть полезна при уточнении таксономического статуса образцов с конкретных территорий.
Семейство Лютиковые (Яапипси1асеае) занимает одно из центральных мест в системе покрытосеменных, включая в себя около 60 родов и свыше 2 000 описанных видов [3]. Большинство представителей семейства предпочитают умеренный и прохладный климат Северного полушария, до арктической области включительно. Значительное число видов обитает и в тропическом поясе, в основном в высокогорных районах. Основная масса видов — это растения, связанные с условиями достаточного и отчасти избыточного увлажнения или избыточного увлажнения в начале вегетационного периода.
Растения из семейства Лютиковых представляют интерес в качестве потенциального лекарственного сырья: с использованием фито-
химических методов исследований доказано наличие в них большого количества биологически активных соединений с широким спектром фармакологических свойств, в первую очередь дитерпеновых алкалоидов, кумари-нов и сапонинов. В народной медицине стран Восточной Азии давно используются антиаритмические, анестезирующие, противовоспалительные, психостимулирующие, спазмолитические и другие свойства представителей семейства. Отдельные представители рода Аконит и рода Живокость стали основой для получения препаратов конвенциональной медицины — антиаритмического Аллапинина и Мелликтина, используемого при неврологических заболеваниях [4]. В то же время функции большинства соединений специализированного обмена, синтезируемых растениями семейства Лютиковые, до настоящего времени изучены недостаточно.
Семейство Яапипси1асеае — одно из самых крупных по количеству и разнообразию видов, что создает трудности при выяснении родственных отношений среди подсемейств и их филогении. Для становления систематики семейства были использованы анатомо-морфологические исследования, данные по кариотипам, изучение ядерной 26S рибосомальной ДНК, серологические подходы. Дополнительно привлекались биохимические и медико-фармацевтические свойства. Кроме того, для установления статуса отдельных таксономических групп внутри ЯапипсиМсеае, оказалось полезно применение методов молекулярной генетики [3].
В базе данных Центрального Ботанического сада НАН Беларуси к настоящему времени содержится информация о 52 видах и внутривидовых таксонах семейства [5], произрастающих на территории нашей страны. В Красную книгу Республики Беларусь [6] внесено 11 видов семейства Лютиковые Г-ГУ категорий природоохранной значимости и 10 видов, нуждающихся в профилактической охране.
Цель нашего исследования — генетическая идентификация видовой принадлежности образцов растительного материала редких охраняемых видов семейства Лютиковые (Яапипси1асеае) методом ДНК-штрихкодиро-вания и пополнение региональной библиотеки ДНК-штрихкодов дикорастущих растений белорусской флоры.
Материалы и методы
Материал для исследования депонирован в Республиканском банке ДНК в коллекции редких и находящихся под угрозой исчезновения видов растений. Отбор, подготовка и фиксация биологического материала выполнены сотрудниками Института экспериментальной ботаники им. В. Ф. Купревича НАН Беларуси и Национального парка Нарочанский. Для каждого вида растений, помещенного на хранение, проведен маркер-специфический анализ ДНК по четырем локусам: ITS2, rbcL, psbA-trnH и matK.
Общую геномную ДНК выделяли из высушенной в силикагеле растительной ткани с использованием коммерческого набора DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Германия) согласно протоколу производителя; оценку качества выделенной ДНК проводили спектрофотометриче-ски (коэффициент OD260/280).
Амплификацию маркерных участков ДНК (rbcL, psbA-trnH, matK и ITS) проводили с помощью специфических праймеров [7]. Для ITS использовали пару ITS S2F / ITS_S3R, которая обеспечивает амплификацию не только межгенного спейсера ITS2, но частично и фрагментов соседних с ним участков 5.8S и 28S, т. н. ITS-район (5.8S-ITS2-28S). ПЦР проводили в финальном объеме 8 мкл; смесь для амплификации включала готовый буфер для проведения ПЦР Quick-load Taq 2X Master Mix (ОДО «Праймтех», Беларусь), прямой и обратный праймеры в конечной концентрации 0,3 пмоль/мкл и ddH2O. Вносили 1 мкл матрицы ДНК в концентрации 10 нг/мкл. Амплификацию проводили в термоциклере C1000 Touch Thermal Cycler (BioRad, США). Результаты амплификации проверяли в 1,5% агарозном геле. Последовательности прайме-ров для амплификации целевых продуктов и размеры ожидаемых фрагментов приведены в таблице 1.
Продукты амплификации очищали с помощью ферментов Exonuclease I и Shrimp Alkaline Phosphatase (Thermo Fisher Scientific, США) согласно рекомендациям производителя. Терминирующую реакцию проводили с использованием коммерческого набора Brilliant Dye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Nimagen, Нидерланды) с последующей очисткой продукта реакции этанолом. Опре-
Таблица 1
Праймеры для амплификации маркерных последовательностей ДНК-штрихкодов
ДНК-штрихкод Последовательность праймеров (прямой / обратный) Ожидаемый размер ПЦР продукта, п. о.
psbA-trnH psbA3 F 5'-GTTATGCATGAACGTAATGCTC-3' trnHf_05 5'-CGCGCATGGTGGATTCACAATCC-3' ~350-400 п. н.
rbcL rbcLaF 5'-ATGTCACCACAAACAGAGACTAAAGC-3' rbcLaR 5'-GTAAAATCAAGTCCACCGCG-3' ~500-900 п. н
ITS-район ITS S2F 5'-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3' ITS S3R 5'-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3' ~600 п. н.
matK matK-xF 5'-TAATTTACGATCAATTCATTC-3' MALPR1 5'-GTTCTAGCACAAGAAAGTCG-3' ~740-800 п. н.
деление нуклеотидной последовательности проводили на автоматическом генетическом анализаторе ABI 3500 DNA Analyzer (Applied Biosystems, США). Для одного вида выполнен анализ в трех повторностях (три индивидуальных растения), для каждого ДНК-штрихкода получено четыре хро-матограммы: три прямого и одна обратного прочтения. Хроматограммы сиквенсов проанализированы в Sequence Scannerl.0., с помощью модуля ContigExpress Project проведено выравнивание индивидуальных последовательностей каждого растения для получения результирующей (консенсусной) маркерной последовательности вида. Полученные кон-сенсусные последовательности сравнивали с последовательностями в международных базах данных NCBI BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) [8] и BOLD (Barcode of Life Data Systems) [9]. Выявление в NCBI нуклеотидной последовательности известного биологического вида, на 98-100% совпадающей с анализируемой, являлось подтверждением видовой принадлежности изучаемого нами растения. Множественное выравнивание последовательностей и построение ден-дрограмм проводили с помощью программы MEGA 4, дендрограммы строили на основе матрицы попарных генетических расстояний методом ближайшего соседа Neighbour-Joining.
Результаты и обсуждение
Лютиковые, будучи крупным семейством по количеству описанных видов, имеют разнообразную систематику, претерпевшую многочисленные изменения, начиная с XIX века. Первоначально создание филогенетической системы опиралось исключительно на морфологические признаки, позже стали учитывать цитологические критерии, в частности, внешний вид хромосом — изгибаемые R(anunculus) и изогнутые T(halictrum), что послужило основой деления на подсемейства. Последующие варианты систематики Лютиковых учитывали жизненные формы представителей семейства, кариотип, особенности формирования плодов и др. В настоящее время существующая систематика семейства Ranunculaceae уточняется с помощью методов молекулярной биологии [3,10].
В данной работе использован биологический материал 11 представителей семейства Ranunculaceae, произрастающих на территории Беларуси и имеющих различный охранный статус (табл. 2): Борец обыкновенный (Aconitum lycoctonum L.) относится к I-й категории национальной природоохранной значимости (CR — находящиеся на грани исчезновения); Борец шерстистоу-стый (Aconitum lasiostomum Reichenb.), Ломонос прямой (Clematis recta L.) и Равноплод-ник василистниковый (Isopyrum thalictroides
L.) — ко II-й категории (EN — угрожаемые / исчезающие); Живокость высокая (Delphinium elatum L.) и Шелковник Кауфмана (Batrachium kauffmannii (Clere) V. Krecz.) — к III-й (VU — уязвимые); Ветреница лесная (Anemona sylvestris L.), Прострел луговой (Pulsatilla pratensis (L.) Mill.), Прострел раскрытый (Pulsatilla patens (L.) Mill.) относятся к IV-й категории охраны (NT — потенциально уязвимые) [6]. Ветреница дубравная
(Anemone nemorosa L.) и Прострел обыкновенный (Pulsatilla vulgaris Mill.) находятся в списке видов, нуждающихся в профилактической охране.
Результаты поиска референсных видовых последовательностей ITS, rbcL, psbA-trnH и matK для изучаемых нами Лютиковых в международных базах данных показали, что для большинства видов информация представлена достаточно полно (табл. 2). Однако для от-
Таблица 2
Редкие виды семейства Лютиковые (Яапшси1асвав), депонированные в Республиканский банк ДНК, и результаты ДНК-штрихкодирования
Фото***
Вид
ДНК-штрихкод
/IS-район
rbcL
%
psbA-trnH
%
matK
%
Борец обыкновенный Aconitum lycoctonum
435
98,9
543
99,5
247
100
472
92
Борец шерстистоустый Aconitum lasiostomum
392
99,6
545
нет
691
Ветреница дубравная Anemone nemorosa
456
90
549
99,8
273
829
99,3
Ветреница Лесная Anemona sylvestris
453
100
554
99,6
281
449
Живокость высокая Delphinium elatum
409
100
531
100
265
100
812
98,9
Окончание таблицы 2
Фото***
Вид
ДНК-штрихкод
/IS-район
rbcL
%
psbA-trnH
%
matK
%
Ломонос Прямой Clematis recta
383
100
552
99,8
195
97,1
719
Прострел Луговой Pulsatilla pratensis
445
98,1
543
100
320
99,7
802
Прострел обыкновенный Pulsatilla vulgaris
287
92
543
99,5
312
99,7
724
Прострел раскрытый Pulsatilla patens
299
99,7
525
100
352
100
нет
Равноплодник василистниковый Isopyrum thalictroides
445
99,8
541
99,8
210
777
Шелковник Кауфмана Batrachium kauffmannii
245
98
539
393
нет
Примечание. *п. н. — длина маркерной последовательности; **% — эффективность видоидентификации; *** — фото растений доступны на сайтах http://plantcadastre.by/index.php; http://hbc.bas-net.by/plantae/ и http:// belpriroda.mrsanych.ru; «-» — последовательность отсутствует в базах данных NCBI и BOLD; «нет» — сиквенсы авторами не получены
дельных видов такая информация отсутствует: для Шелковника Кауфмана (Batrachium kauffmannii) представлена лишь ядерная последовательность ITS; для Ветреницы лесной (Anemona sylvestris) — информация о последовательностях ITS и rbcL. Отсутствие референс-ных последовательностей в международных
базах данных, с одной стороны, затрудняет сравнение полученных результатов с верифицированными источниками, но, с другой стороны, самостоятельно полученные нукле-отидные последовательности пополняют региональную библиотеку ДНК-штрихкодов дикорастущих растений белорусской флоры.
В результате работы для 11 представителей семейства Ranunculaceae получена 41 консен-сусная последовательность по четырем филогенетически значимым ДНК-штрихкодам (табл. 2). Наибольший интерес для генетической идентификации видовой принадлежности растений семейства Лютиковые представляют последовательности внутренних транскрибируемых спейсеров генов рРНК, которые считаются весьма эффективными для установления таксономической структуры и уточнения филогенетических связей. Согласно недавним исследованиям, область спейсера ITS1-5.8S-ITS2 рибосомного оперона успешно используется для идентификации растений как на межвидовом, так и на внутривидовом уровнях [11-13]. Данные о последовательностях внутреннего транскрибируемого ядерного спейсера ITS легли в основу построения филогенетического дерева 92 видов растений семейства Лютиковых в работе Y. Cai и со-авт [14]; аналогичные данные представлены
в работе И. Ю. Евдокимова [15], где филогенетическое дерево построено на основе области рибосомного оперона ITS1-5.8S-ITS2 для 46 представителей Яапипси1асвав.
В данной работе с целью генетической идентификации видов и проведения филогенетического анализа проанализирована последовательность /Т£-района 11 представителей семейства Лютиковых. Протяженность выравненных и используемых для анализа последовательностей /Т£-района у изучаемых растений составляла 245-456 п. н. (табл. 2). Используемые в работе праймеры обеспечивают амплификацию межгенного спейсера /Т82 (размер которого у покрытосеменных составляет около 220-240 п. н.) и частично участков генов 5.8S и 28S (рис. 1).
Выбор /Г£-района в качестве филогенетического маркера удобен тем, что у растений именно ядерные гены наиболее вариабельны, особенно некодирующие области интронов, а также спейсеры между тандемно повторяю-
Рис. 1. Схема строения структурной единицы кластера рРНК [16] 18S, 5.8S, 28S — гены рРНК; ITS1 и ITS2 — внутренние транскрибируемые спейсеры; ETS — внешние транскрибируемые спейсеры; NTS - нетранскрибируемый спейсер, разделяющий структурные единицы кластера рРНК
щимися генами, как в кластерах рибосомаль-ной РНК. Сами гены рибосомальной РНК состоят из чередующихся консервативных и вариабельных участков, что позволяет использовать для их изучения универсальные праймеры [17]. Рибосомы эукариот включают в себя четыре функциональных рРНК: 28S, 18S, 5.8S и 5S. Первые три гена транскрибируются в виде одной молекулы, состоящей из генов, окруженных внешними (ETS, external transcribed spacers) и внутренними (ITS, internal transcribed spacers) спейсера-ми, которая затем разрезается на отдельные рРНК (рис. 1).
В базах данных NCBI приводятся суммарные размеры нескольких участков ITS-района (ITS1 / 5.8S / ITS2 / 28S) в различных вариациях, что облегчает поиск аналоговых видовых
последовательностей. В таблице 3 приведены данные о размерах ядерных маркерных последовательностей, полученные в ходе выполнения анализа.
Нами получено 33 последовательности ITS-района для 11 анализируемых видов. В результате выравнивания индивидуальных последовательностей сгенерировано 11 результирующих видовых (табл. 4). Полученная информация в формате FASTA включена в региональную библиотеку ДНК-штрихко-дов дикорастущих растений белорусской флоры. В таблице 4 видовые последовательности представителей семейства Лютиковых приведены в виде двумерных QR-кодов (Quick Response Code, код быстрого реагирования).
При проведении филогенетического анализа в качестве референсных нами взяты видовые
Таблица 3
Длина маркерных последовательностей ITS-района у видов семейства Лютиковые
(Ranunculaceae)
№ п/п Вид Размер ДНК-штрихкода (п. н.)
/TS-район /TS2*
1 Борец обыкновенный / Aconitum lycoctonum 435 245
2 Борец шерстистоустый /Aconitum lasiostomum 392 220
3 Ветреница дубравная / Anemone nemorosa 456 225
4 Ветреница лесная / Anemona sylvestris 453 216
5 Живокость высокая / Delphinium elatum 409 220
6 Ломонос прямой / Clematis recta 383 244
7 Прострел луговой / Pulsatilla pratensis 445 219
8 Прострел обыкновенный / Pulsatilla vulgaris 287 **
9 Прострел раскрытый / Pulsatilla patens 299 **
10 Равноплодник василистниковый / Isopyrum thalictroides 445 217
11 Шелковник Кауфмана / Batrachium kauffmannii 245 **
Примечание. последовательность участка ITS2 определена с помощью ресурса http://its2.bioapps.biozentrum. uni-wuerzburg.de/; **получен неполноразмерный участок ITS2
Таблица 4
Результирующие последовательности ITS-района представителей 11 видов редких растений
семейства Лютиковые (Ranunculaceae)
Окончание таблицы 4
Вид растения
QR-код
Вид растения
QR-код
Вид растения
QR-код
Aconitum lasiostomum
Delphinium elatum
Pulsatilla pratensis
Aconitum lycoctonum
Isopyrum thalictroides
аналоговые последовательности ITS-района из международной базы данных NCBI BLAST, в качестве внешней группы использована последовательность ITS-района Iris sibirica (семейство Ирисовые) (табл. 5). Из анализа при выравнивании исключены последовательности концевых участков исследуемого нами ITS-района с целью избежания ошибок
секвенирования околопраймерных областей.
Множественное выравнивание последовательностей участков ITS ядерного генома 11 видов семейства Лютиковых позволило оценить различия на межвидовом уровне. Среди 435 сайтов выявлено 189 вариабельных позиций, из которых 93 — парсимонически-ин-формативные. На рисунке 2 представлены дан-
Таблица 5
Референсные последовательности ITS-района отдельных видов семейства Лютиковые
(Ranunculaceae)
Вид Код последовательности в NCBI
Anemona sylvestris KJ819803.1
Anemone nemorosa KX167066.1
Pulsatilla patens MG237345.1
Trollius europaeus AY148270.1
Pulsatilla vulgaris MK341851.1
Batrachium kauffmannii MG098949.1
Clematis recta GU732622.1
Pulsatilla pratensis MN997015.1
Cimicifuga europae Z98286.1
Isopyrum thalictroides GU257977.1
Aconitum lycoctonum AF216546.1
Aconitum lasiostomum AF216534.1
Delphinium elatum MT137602.1
Iris sibirica MF543721.1
ные о генетическом взаимоотношении между видами в пределах семейства Капппси1асеае.
Согласно современной классификации, семейство Лютиковые (Яапипси1асеае) включает 5 подсемейств: Hydrastidoideae, Coptidoideae, Helleboroideae, Thalictroideae, Ranunculoideae и насчитывает около 60 родов [18]. Изучаемые нами виды редких растений семей-
ства Лютиковых принадлежат к двум подсемействам. Подсемейство Ranunculoideae является самым крупным в таксоне по количеству видов и представлено в нашей коллекции 6 родами: род Ветреница (Anemone) — виды A. sylvestris и A. nemorosa; род Лютик, подрод Шелковник (Ranunculus subgen. Batrachium) представлен видом B. Kauffmannii;
Рис. 2. Филогенетическое дерево, построенное на основе фрагментов /ТЗ-района ядерной ДНК представителей семейства Ranunculaceae: А — дендрограмма, построенная на основе сравнения фрагментов Б — дендро-грамма, построенная на основе сравнения последовательностей /ТЗ-района
к роду Прострел (Pulsatilla) относятся виды P. patens, P. vulgaris, P. pratensis; к роду Аконит (Aconitum) — виды A. Lycoctonum и A. lasiostomum; род Живокость (Delphinium) — D. elatum; род Ломонос (Clematis) — C. recta. К подсемейству Thalictroideae относится род Равноплодник (Isopyrum) — вид I. thalictroides. Дендрограмма, построенная на основании нуклеотидной вариабельности ITS-района (рис. 2Б), согласуется с принятой таксономией Лютиковых. Виды сгруппировались в 7 кластеров, соответствующие родам семейства. Последовательности из NCBI (табл. 5) при кластеризации заняли те же позиции, что и аналогичные образцы из нашего исследования, в соответствии с высоким процентом сходства между ними (табл. 2).
Дендрограмма на рисунке 2А представляет филогенетическую характеристику коллекции изучаемых редких видов на основе полноразмерных участков ITS2 и демонстрирует раз-
деление на кластеры, аналогичное построению по вариабельности последовательностей /ТЗ-района. Таким образом, маркер /Т$>2 отвечает всем необходимым требованиям к штрих-коду: (1) высококопийность; (2) успешная амплификация участка при малом количестве материала и даже у гербарных образцов; (3) высокое качество сиквенсов; (4) высокая разрешающая способность на межвидовом уровне. Этот участок ДНК можно использовать в качестве так называемого мини-штрихкода для быстрой или дополнительной идентификации видов. Мини-штрихкодирование ДНК может заполнить пробелы, оставленные другими методами в области молекулярной идентификации растений [19-21].
Заключение
Таким образом, использование /ТЗ-района в качестве молекулярно-филогенетического маркера показало, что виды Ranunculaceae хо-
рошо различимы на молекулярном уровне. Параллельное использование морфологических и молекулярных методов позволяет более точно провести идентификацию растений и уточнить существующую систематику семейства Лютиковые. Аналогичные результаты можно получить, сравнивая не полноразмерный регион ITS, а только межгенный спейсер ITS2, что делает ДНК-маркер удобным для целей филогении и систематики.
Список использованных источников
1. Главный информационно-аналитический центр Национальной системы мониторинга окружающей среды Республики Беларусь (ГИ-АЦ НСМОС) [Электронный ресурс]. - Режим доступа: http://www.nsmos.by/content/177.html. - Дата доступа: 20.06.2022.
2. Мониторинг растительного мира в Республике Беларусь: результаты и перспективы / И. В. Бордок [и др.]; науч. ред.: А. В. Пугачевский, А. В. Судник; Нац. акад. наук Беларуси, Ин-т эксперим. ботаники им. В. Ф. Купреви-ча. - Минск: Беларуская навука, 2019. - 491 с. ISBN 978-985-08-2379-3.
3. Евдокимов, И. Ю. Молекулярная филогения семейства Ranunculaceae на основе rbcL и trnL-F последовательностей хлоропластной ДНК / И. Ю. Евдокимов // Проблемы ботаники Южной Сибири и Монголии: сб. науч. ст. по материалам XVI междунар. науч.-практ. конф. (Барнаул, 5-8 июня 2017 г.) / АГУ, Юж.-Сиб. ботан. сад, Алтайское отд-ние Рус. ботан. о-ва ; ред.: А. И. Шмаков, Т. М. Копытина. - Барнаул: Изд-во АлтГУ, 2017. - С. 240-245.
4. Белых, О. А. Биологически активные вещества и полезные свойства представителей семейства Ranunculaceae juss. (обзор) / О. А. Белых // Известия вузов. Прикладная химия и биотехнология. - 2014. - № 5 (10). - С. 25-32.
5. Информационно-поисковая система Центрального ботанического сада Национальной Академии наук Беларуси [Электронный ресурс]. - Режим работы: http://hbc.bas-net.by/ plantae/. - Дата доступа: 01.06.2022.
6. Красная книга Республики Беларусь: редкие и находящиеся под угрозой исчезновения виды дикорастущих растений / гл. редкол. : И. М. Качановский (предс.). М. Е. Никифоров, В. И. Парфенов [и др.]. - Мн.: «Беларуская Энцыклапедыя» iмя Петруся Броую. -
2015. - 448 с. - ISBN 978-985-11-0843-1.
7. The Canadian Centre for DNA Barcoding http://ccdb.ca/site/wp-content/uploads/2016/09/ CCDB_PrimerSets-Plants.pdf. CCDB [Electronic resource] : Canadian Centre for DNA Barcoding.
- Mode of access: http://ccdb.ca/. - Date of access: 04.04.2022.
8. NCBI BLAST [Electronic resource]: National Center for Biotechnology Information, Basic Local Alignment Search Tool. - Mode of access: https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi. -Date of access: 04.04.2022.
9. BOLD Systems [Electronic resource]: The Barcode of Life Data Systems / CCDB (The Canadian Centre for DNA Barcoding). - Mode of access: http://ccdb.ca/http://boldsystems.org/ index.php / Public_Primer_PrimerSearch. - Date of access: 04.04.2022.
10. Tamura, M. Angiospermae. Ordnung Ranunculales. Fam. Ranunculaceae. Systematic Part. II / M. Tamura. - Berlin. Duncker and Humbolt, 1995. - Vol. 17a, IV. - P. 223-519.
11. Authentication of Medicinal Herbs using PCR-Amplified ITS2 with Specific Primers / S.-J. Chiou [et al.] // Planta Medica.
- 2007. - Vol. 73, № 13. - P. 1 421-1 426. doi:10.1055/s-2007-990227.
12. Validation of the ITS2 Region as a Novel DNA Barcode for Identifying Medicinal Plant Species / S. Chen [et al.] // PLoS ONE. - 2010.
- Vol. 5, № 1. - e8613. doi:10.1371/journal. pone.0008613.
13. Кирьянов, П. С. Структурная организация генов 18S и 28s рибосомной РНК карельской березы / П. С. Кирьянов, О. Ю. Баранов // Молекулярная и прикладная генетика. - 2020.
- Т. 28. - С.46-56.
14. Molecular phylogeny of Ranunculaceae based on internal transcribed spacer sequences / Y. Cai [et al.] // African Journal of Biotechnology.
- 2009. - Vol. 8, № 20. - P. 5 215-5 224.
15. Евдокимов, И. Ю. Обзор систем семейства Ranunculaceae Juss. в хронологической последовательности / И. Ю. Евдокимов // Проблемы ботаники Южной Сибири и Монголии: Сборник науч. ст. по материалам XIV междунар. науч.-практич. конф. - Барнаул: Изд-во АГУ. - 2015. - С. 140-144.
16. Молекулярные маркеры для видои-дентификации и филогенетики растений / Т. В. Матвеева [и др.] // Экологическая гене-
тика. - 2011. -Т. IX, № 1. - С. 32-43.
17. Шнеер, В. С. ДНК-штрихкодирование -новое направление в сравнительной геномике растений / В. С. Шнеер // Генетика. - 2009. -Т. 45, № 11. - С. 1 436-1 448.
18. Molecular phylogeny of Ranunculaceae based on rbc L sequences / Y-F. Cai [et al.] // Biologia. - 2010. - Vol. 65, № 6. - P. 997-1003. DOI: 10.2478/s11756-010-0105-8.
19. DNA Mini-Barcoding: A Derived Barcoding Method for Herbal Molecular Identification / Z. Gao Z. [et al.] // Front. Plant Sci. - 2019. -
Vol. 10. - Article 987, P. 1-11. doi: 10.3389/ fpls.2019.00987.
20. Species identification of poisonous medicinal plant using DNA barcoding / M. Liu [et al.] / Chin J Nat Med. - 2019. - Vol. 17, № 8.
- P. 585-590.
21. Using the ITS2 sequence-structure as a DNA mini-barcode: A case study in authenticating the traditional medicine "Fang Feng" / W. Zhang [et al.] // Biochemical Systematics and Ecology.
- 2016. - Vol. 69. - 188e194 doi: 10.1016/j. bse.2016.10.007.
N. V. Savina, S. V. Kubrak, L. V. Milko, A. V. Kilchevsky
ANALYSIS OF ITS REGION SEQUENCES OF RIBOSOMAL DNA FOR THE IDENTIFICATION OF RARE RANUNCULACEAE SPECIES
State Scientific Institution "Institute of Genetics and Cytology of the National Academy of Sciences of Belarus" 27 Akademicheskaya St., 220072 Minsk, Republic of Belarus e-mail: N.Savina@igc.by
The effectiveness of using of the ITS region as a DNA barcode for the genetic identification of plants of rare and protected species of Ranunculaceae included in the Red Book of the Republic of Belarus was demonstrated. The DNA barcoding technique allowed, using both the ITS region and a more compact intergenic spacer ITS2, demonstrating that 11 Ranunculaceae species belonging to two subfamilies and seven genera are clearly distinguishable at the molecular level. The phylogenetic relationship between eleven studied species built on the basis of the nucleotide variability of the ITS region is fully consistent with the existing taxonomy of this family based on morphological and cytological features. The results obtained make it possible to consider the ITS2 region as a mini barcode for rapid or additional identification.
Keywords: biodiversity, Ranunculaceae, DNA barcoding, ITS region, ITS2.
Дата поступления в редакцию: 05 сентября 2022 г.
