CC BY
11УДК 502:75:582:577.21
Н.В. Савина1, С.В. Кубрак1, Е.И. Кузьминова1, Л.В. Милько1, А.П. Колбас2, Н.М. Матусевич2, Е.П. Михаленко1, Е.Н. Макеева1, А.В. Кильчевский1
ПОДБОР МАРКЕРОВ ДЛЯ ДНК-БАРКОДИНГА ДИКИХ ВИДОВ СЕМЕЙСТВА ORCHIDACEAE НА ПРИМЕРЕ ANACAMPTIS MORIO L.
Институт генетики и цитологии НАН Беларуси Республика Беларусь, 220072, г. Минск, ул. Академическая, 27; e-mail: N.Savina@igc.by 2Брестский государственный университет им. А.С. Пушкина Республика Беларусь, 224016, г. Брест, бул. Космонавтов, 21
Представители флоры Беларуси из семейства Orchidaceae известны своими декоративными и фармакологическими свойствами. Одним из способов контроля за состоянием их природных популяций является ДНК-идентификация. На примере ятрышника-дремлика (Anacamptis morio L.) продемонстрирована возможность успешного использования комбинации трех маркеров (ITS2, rbcL и psbA-trnH) для ДНК-штрихкодирования растений семейства Orchidaceae. Наиболее информативными оказались ITS2 и rbcL, позволяющие с точностью 99,82-100% определить вид изучаемого растения. Использование маркерных последовательностей ITS2, rbcL и psbA-trnH позволит проводить массовый скрининг растений, произрастающих на охраняемых территориях.
Ключевые слова: ДНК-баркодинг, ДНК-штрихкод, Орхидные, ятрышник-дремлик.
Введение
Семейство Орхидные (ОтсЫёасвав), или Ятрышниковые, — одно из крупнейших среди цветковых растений, насчитывающее, по разным данным, от 20 до 35 тысяч видов. Орхидные широко распространены по всему земному шару вплоть до Северного Ледовитого океана, однако большинство видов произрастает в тропических лесах и высокогорьях. В составе флоры Беларуси встречается более 30 видов дикорастущих Орхидных. Из-за сложного и длительного цикла развития и чувствительности к изменениям окружающей среды число видов дикорастущих орхидей постепенно сокращается. В настоящее время в Красную книгу Беларуси внесено 24 представителя Orchidaceae, по степени риска исчезновения они относятся к 1-3 категориям национальной природоохранной значимости [1]. Представители семейства Орхидные в первую очередь известны как кра-сивоцветущие декоративные растения. Помимо этого, ОтсЫёасвав являются объектом пристального внимания в связи с изучением их фармакологических свойств. В народной медицине Орхидные издавна использовались в качестве тонизирующих, болеутоляющих,
иммуностимулирующих средств. В последнее время изучаются перспективы получения препаратов с противораковым действием на основе растений этого семейства.
Ятрышник-дремлик (Anacamptis morio L.) — один из представителей семейства ОтсЫёасвав, произрастающий в дикой природе на территории Беларуси. С яркой окраской околоцветника, широко применяемый в народной медицине, этот вид взят под государственную охрану в 1964 г. как исчезающее растение (категория охраны 2). Основными факторами, влияющими на выживание и распространение этого вида, являются хозяйственная трансформация земель, осуши-тельно-мелиоративные работы, чрезмерные рекреационные нагрузки (срыв цветущих растений). Помимо запрещения антропогенных воздействий на места произрастания вида, меры охраны предполагают постоянный контроль за состоянием известных популяций и поиск новых, а также сохранение генофонда вида в условиях культуры и расселение в естественные экотопы [2].
С появлением технологии ДНК-баркодинга задачи идентификации вида и контроля за природными популяциями решаются при
помощи молекулярно-генетического анализа стандартных небольших участков генома изучаемого вида (т. н. ДНК-штрихкодов). В исследованиях по ДНК-баркодингу представителей семейства Orchidaceae разными авторами предлагается до 11 маркеров (как по отдельности, так и комбинированных). В работе Tang H. и соавт. (2017) в качестве оптимальной предлагается комбинация маркеров matK+psbA-trnH+ITS2 [3], в исследованиях Xu S. и соавт. (2015) показана высокая эффективность двух маркеров ITS+matK [4], в работе корейских авторов Kim H.M. и соавт. (2014) преимущество отдано трехкомпонент-ной комбинации маркеров atpF-atpH+psbK-psbI+trnH-psbA [5]. Таким образом, подбор мультилокусных комбинаций 2-3 маркеров для ДНК-идентификации диких видов семейства Orchidaceae является необходимым предварительным этапом перед массовым скринингом популяций, произрастающих на охраняемых территориях.
Цель данного исследования — установить возможность применения отдельных маркерных последовательностей, используемых в качестве ДНК-штрихкодов, для идентификации редких дикорастущих растений семейства Orchidaceae. В работе были использованы два пластидных маркера rbcL и psbA-trnH и один маркер ядерной последовательности ITS2.
Материалы и методы
Сбор растительного материала ятрышни-ка-дремлика (3 растения, апикальная часть листьев) проведен сотрудниками Национального парка «Беловежская пуща» без изъятия
растений из мест произрастания. Собранный растительный материал до изоляции ДНК хранился при 4° C. Перед выделением растительный материал замораживали в жидком азоте и растирали в фарфоровой ступке. Для выделения тотальной ДНК использовали набор DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Германия). Оценку концентрации и чистоты полученных образцов нуклеиновых кислот выполняли с помощью спектрофотометра Implen P360 {Implen, Германия). Для визуальной оценки качества полученных матриц ДНК проводили электро-форетический анализ в 2%-ном агарозном геле. Концентрацию образцов растительной ДНК выравнивали путем разведения до 15 нг/мкл.
Амплификацию маркерных последовательностей rbcL, psbA-trnH и ITS2 проводили с использованием специфических праймеров (табл. 1) в финальном объеме реакционной смеси 10 мкл (термоци-клер C1000 Touch Thermal Cycler, BioRad, США). Количество ДНК, вносимое в реакционную смесь, — 30 нг/мкл. Состав ПЦР-смеси — стандартный (буфер 10х, 25M MgCl2, 2mM dNTPs, 3% DMSO, 10цМ каждого праймера, 5U/p,l Hi-Fi ДНК-полимераза), все компоненты ОДО «Праймтех» [6]. Последовательности праймеров и базовые рекомендации по условиям проведения амплификации представлены в свободном доступе на сайте международного центра по ДНК-баркодингу — CCDB (Canadian Centre for DNA Barcoding) [7]. Результаты амплификации проверяли в 2%-ном агарозном геле.
После амплификации проводили ферментативную очистку полученных маркерных после-
Таблица 1
Праймеры для амплификации маркерных последовательностей (ДНК-штрихкодов)
ДНК-штрихкод Последовательность праймеров Размер ПЦР продукта, п. н.
psbA-trnH 5'- GTTATGCATGAACGTAATGCTC -3' 5'- CGCGCATGGTGGATTCACAATCC -3' ~509 (226-934) [8]
rbcL 5'- ATGTCACCACAAACAGAGACTAAAGC -3' 5'- GTAAAATCAAGTCCACCGCG -3' ~654 [8]
ITS2 5'- ATGCGATACTTGGTGTGAAT -3' 5'- GACGCTTCTCCAGACTACAAT -3' ~494 (157-670) [9]
довательностей ITS2, rbcL иpsbA-trnH. Терминирующая реакция выполнена с использованием коммерческого набора BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, США) согласно рекомендации производителя с последующей очисткой проб этанолом. Сек-венирующую реакцию проводили в прямом (при необходимости и в обратном) направлении на генетическом анализаторе ABI 3500 Applied Biosystems. Хроматограммы сиквенсов просмотрены в ChromasPro 13.3 и сохранены в формате FASTA. Полученные нуклеотидные последовательности сравнивали с последовательностями ДНК, хранящимися в международных базах данных при помощи программы NCBI BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) для ITS2 и psbA-trnH [10]; для анализа rbcL дополнительно использовали программу BOLD Systems v.4 [11]. Обнаружение в NCBI нуклео-тидной последовательности известного биологического вида, полностью совпадающей с анализируемой нами, являлось подтверждением видовой принадлежности изучаемого растения.
Результаты и обсуждение
Для идентификации растений ятрышника были использованы три маркера, рекомендуемые для анализа растений семейства Orchidaceae. Маркер ITS2 представляет собой участок ядерной последовательности, который входит в состав рибосомального кластера и локализуется между структурными генами
рибосомальной РНК 5.8S и 28S. Ген rbcL — наиболее подробно охарактеризованный хло-ропластный ген растений. Участок пластидной ДНК rbcL кодирует большую субъединицу рибулозобисфосфаткарбоксилазы, ключевого фермента фиксации СО2 в темновой фазе фотосинтеза [12]. Некодирующий участок пластидной ДНК psbA-trnH представляет собой межгенный спейсер (psbA-trnH от англ. Intergenic spacer (IGS) regions of psbА-trnH) и расположен между геном, контролирующим синтез белка D1 фотосистемы II, и геном ги-стидиновой тРНК [13]. На рис. 1 представлены электрофореграммы результатов амплификации маркерных последовательностей с ДНК растений ятрышника (3 растения).
При амплификации ДНК растений ятрышника с маркером ITS2 был получен фрагмент размером ~500 п. н., с rbcL ~600 п. н., с psbA-trnH получен продукт ~900 п. н.
Продукты амплификации, представляющие собой маркерные последовательности ITS2, rbcL и psbA-trnH, были секвенированы в прямом направлении, помимо этого для ITS2 выполнено секвенирование в обратном направлении. Для трех растений ятрышника получено 4 качественных сиквенса участка ITS2 (2 прямых/2 обратных), 3 качественных сиквенса (прямых) участка rbcL и 2 качественных сиквенса (прямых) участка psbA-trnH. В табл. 2 представлены результаты секвенирования ам-пликонов по одной последовательности для
М 1 2
600
б
rbcL
psbA-trnH
Рис. 1. Результаты амплификации ДНК растений ятрышника с маркерами ITS2 (а), гЬ€Ь (б), psbA-trnH (в)
в
каждого ДНК-штрихкода, так как буквенные сиквенсы разных растений ятрышника по одному и тому же маркеру были идентичны.
Маркерная последовательность rbcL для ятрышника из Национального парка «Беловежская пуща» практически полностью (сходство 99%) совпала с представленной в NCBI последовательностью KF997322.1 для вида Anacamptis morio (ятрышник-дремлик) — из проанализированных 553 п. н. только 4 п. н. (выделены в табл. 2 серым) не совпадают с оригинальным сиквенсом из базы данных BLAST. Дополнительно мы сравнили полученную последовательность rbcL изучаемых растений ятрышника с данными информационной платформы BOLD Systems v. 4 (The Barcode of Life Data System), которая позволяет вести поиск маркерных последовательностей rbcL и matK по секвенированным участкам не менее 500 п. н. [11, 14]. Результаты сравнения
доказывают, что с вероятностью 99,82% изучаемые растения относятся к семейству Орхидные (Orchidaceae), род Анакамптис (Anacamptis), вид Anacamptis morio L. (ятрыш-ник-дремлик) (рис. 2).
Маркерная последовательность ITS2 на 100% совпала с представленной в NCBI последовательностью Z940992.1 для вида Anacamptis morio (ятрышник-дремлик). Последовательность, представленная в NCBI, содержит 240 п. н., тогда как в нашем исследовании получен качественный сиквенс размером 424 п. н. В дальнейшем планируется зарегистрировать эту последовательность в базе BLAST.
Использование маркера psbA-trnH для идентификации растений ятрышника-дремлика из Национального парка «Беловежская пуща» было для нас недостаточно информативным — а 126 представителей семейства Орхидные
Таблица 2
Результаты секвенирования маркерных последовательностей ДНК (гЬ^, ITS2 и tmH-psbA) у ятрышника-дремлика из Национального парка «Беловежская пуща»
ДНК-штрихкод Последовательность
rbcL CTGGGGTGTTTAAGATTACAAATTGACTTATTATACTCCTGACTACGAAACCAAAGATA CTGATATCTTGGCAGCATTCCGAGTAACTCCTCAACCGGGAGTTCCGCCTGAAGAAGC AGGCGCTGCGGTAGCAGCCGAATCTTCTACTGGTACATGGACAACTGTGTGGACTGAT GGACTTACCAGTCTCGATCGTTACAAAGGACGATGCTACCACATCGAGGCCGTTGTTG CCTTCGTTATACCGTTACATCGAGTAGATGTATTACCTTGTCCGCAATATTGTCTGCCGCGCTTAGATCGTTTATTTTTCTCGAGATTATACCATATATCGCCATACTGGGCTGCACGG CCTCATGGCATCCAAGTTGAAAGAGATAAATTGAACAAGTACGGTCGTCCCCTATTGG GATGTACTATTAAACCAAAATTGGGATTATCCGCAAAAAACTACGGTAGAGCGGTTTAT GAATGTCTACGCGGTGGACTTGATK (553 п. н.)
ITS2 TCGACGCAAGTTGCGCCTGAGGCCAGCTGGCCAAGGGCACGTCCGCCTGGGCGTCA AGCATTGTGTCGCTCCATAGGACCTTCGCGGCCACGCGGCTGTCTCATCATGGATGCG GAGAATGGCCTGTCATGCGCTTATGTGTGGCTGGCTGAAGAGCGGGATGATACTCTCT TGGCAATGGCCGATTAATGGGTGGGATGGAAGCCCCGTTGATTCATCGTCCGGTTGCT CTGAGAAATTATTGGATATTCCAGCTAACCCAATACAGTTGTCATCGCAAGACAATTG ACATGCGACCCCAGGATGGGCGGGATGACCCGCTGAGTTTAAGCATATCAATAAGCG GAGGAGAAGAAACTTACGAGGATTCCCCTAGTAACGGCGAGCGAACCGGGATTTGC CCAGCTTGGGAATCGGGCTGCTT (424 п. н.)
psbA-trnH GAAGATATAAATCCCCCAATATCTTGTTCTAAGAACAAGATATTGGGGGATTGTTGAGC TACCACTTTTGCTTCTTTATCCGAATCCGAATTTTCGTTTTTTATCATAAAAGAAAGTTC TCCCCTGCCAATGAATGATAAGTGTCTAGGTGAAGTATAGTATAAGATAAGTAAGAAAA GTCTAAGTCTTAGTATACTAGAAAAAGAAAAGAAAATACTATACCTATACTCTTACTCT AAGATAAAGACTCTTAAGTCTAATAAGATAAGACTTTTCACATGAATACTTAGCAGAA CGACTAACGACGAGATTTATTATCGTTTCTCGCATGTCTCACGAAAGTGAGAGTAGGT GCGAATTCTCCCAATTTGTGACCGACCATACGATCTTTTATATAAATAGGTAAATTGTT CCTTTCCATTATGAATAGCGATTGTATGGGCAATCMTTGTGGGTATAATGGTAGATGCC CGARACCCAASTMCCTATTATTTCCYTTCCTCCTCCCCTCCTGGTTGAGTTTTTTCATT TTTTCCCGGATAAAATGATTA (690 п. н.)
Рис. 2. Результат поиска в BOLD Systems v.4 по маркерной последовательности rbcL для ДНК растений ятрышника из Национального парка «Беловежская пуща»
(ОгеШ^евав) из базы данных NCBI буквенный сиквенс исследуемого участка на 95-97% был идентичен полученному нами, что сузило идентификацию до определения семейства. Этот факт не противоречит исследованиям других авторов, которыми отмечена недостаточная вариабельность маркерной последовательности psbA-tmH для этого таксона [3-5, 12].
Заключение
Таким образом, на примере образцов ДНК ятрышника-дремлика (Anacamptis топо L.) нами продемонстрирована возможность успешного использования комбинации трех маркеров (ITS2, гЬ^ и psbA-trnH) для идентификации растений семейства Orchidaceae. Наиболее информативными в качестве ДНК-штрихкода оказались фрагмент ядрДНК ITS2 и фрагмент хплДНК гЬа. Использование гЬ^ в качестве самостоятельного маркера позволило достоверно определить вид изучаемого расте-
ния — сходство с существующими базами данных составило 99,82%, а в случае самостоятельного применения маркера ITS2 — 100%. В то же время, участок хплДНК psbA-tmH показал недостаточную разрешающую способность для самостоятельного использования, однако для него в процессе работы показана высокая воспроизводимость результатов амплификации. Это сокращает время на отработку условий для получения целевых последовательностей, и, при совместном применении с другими маркерами, psbA-trnH будет полезен для проведения первичного скрининга растений.
Список использованных источников
1. Красная книга Республики Беларусь. Растения: редкие и находящиеся под угрозой исчезновения виды дикорастущих растений / редкол.: И.М. Качановский [и др.]. — 4-е изд. — Минск: Беларус. энцыкл. iм. П. Броую, 2015. — 448 с.
2. Электронная версия Красной книги Республики Беларусь [Электронный ресурс]. — Режим доступа: http://redbook.min-priroda.gov.by. — Дата доступа:17.05.2017.
3. DNA barcoding identification of endangered medicinal plants of Orchidaceae / Tang H. [et al.] // Zhongguo Zhong Yao Za Zhi. — 2017. — Vol. 42, № 11. — Р. 2058-2067. — doi:10.19540/j.cnki.cjcmm.2017.0090.
4. Evaluation of the DNA Barcodes in Dendro-bium (Orchidaceae) from Mainland Asia / S. Xu [et al.] // PLoS One. — 2015. — Vol. 10, № 1: e0115168. — doi:10.1371/journal.pone.0115168.
5. DNA barcoding of Orchidaceae in Korea / Kim H.M. [et al.] // Mol. Ecol. Resour. — 2014. — Vol. 14 № 3. — Р. 499-507. — doi: 10.1111/1755-0998.12207.
6. ОДО «Праймтех» — реагенты и материалы для молекулярной биологии [Интернет-сайт компании Электронный ресурс]. — Режим доступа: http://www.primetech. by. — Дата доступа: 07.06.2017.
7. CCDB [Electronic resource] / Canadian Centre for DNA Barcoding. — Mode of access: http://ccdb.ca/site/wp-content/uploads/2016/09/ CCDB_PrimerSets-Plants.pdf. — Date of access: 12.04.2017.
8. Hollingsworth, P.M. Choosing and using a plant DNA barcode / P.M. Hollingsworth, S.W. Graham, D.P. Little // PLoS One. — 2011. — Vol. 6, № 5: e19254. — doi: 10.1371/
journal.pone.0019254
9. Use of ITS2 Region as the Universal DNA Barcode for Plants and Animals / H. Yao [et al.] // PLoS One. — 2010. — Vol. 5, № 10: e13102. — doi: 10.1371/journal.pone.0013102
10. NCBI BLAST [Electronic resource] / National Center for Biotechnology Information, Basic Local Alignment Search Tool. — Mode of access: https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast. cgi. — Date of access: 24.06.2017.
11. BOLD Systems [Electronic resource] / The Barcode of Life Data Systems / CCDB (The Canadian Centre for DNA Barcoding). — Mode of access: http://ccdb.ca/http://boldsystems.org/in-dex.php/Public_Primer_PrimerSearch. — Date of access: 24.06.2017.
12. Молекулярные маркеры для видоиден-тификации и филогенетики растений / Т. В. Матвеева [и др.] // Экологическая генетика. — 2011. — Т. IX, № 1. — С. 32-43.
13. Дегтярева, Г. В. Анализ соответствия молекулярных и морфологических данных при анализе филогении на примере семейств бобовые (Leguminosae) и зонтичные (Umbel-liferae): дис. ... канд. биол. наук: 03.00.03 / Г. В. Дегтярева. — 2007. — 212 с.
14. Ratnasingham, S. Bold: The Barcode of Life Data System (http://www.barcodinglife. org) / S. Ratnasingham, P.D.N. Hebert // Mol. Ecol. Notes. — 2007. — Vol. 7. — P. 355364. — doi:10.1111/j.1471-8286.2007.01678.x.
N.V. Savina1, S.V. Kubrak1, KI. Kuzminova1, L.V. Milko1, A.P. Kolbas2, N.M. Matusevich2, E.P. Mikhalenko1, E.N. Makeyeva1, A.V. Kilchevsky1
CHOOSING DNA-BARCODING MARKERS FOR WILD SPECIES OF THE ORCHIDACEAE FAMILY BY THE EXAMPLE OF ANACAMPTISMORIO L.
institute of Genetics and Cytology, NAS of Belarus Minsk BY-220072, the Republic of Belarus 2Brest State University named after A.S. Pushkin Brest BY-224016, the Republic of Belarus
Representatives of Belarus flora belonging to the Orchidaceae family are known for their ornamental and pharmacological properties. DNA-identification is the method to monitor the state of their natural populations. By the Anacamptis morio L. example, we demonstrated that there is the possibility of effective use of three markers' (ITS2, rbcL andpsbA-trnH) combination for DNA-barcoding of Orchidaceae. The most effective were ITS2 and rbcL, allowing to determine the plant species under study with an accuracy of 99.82-100%. Use of ITS2, rbcL and psbA-trnH marker sequences will enable to perform mass screening of plants growing in protected areas.
Key words: DNA-barcoding, DNA-barcode, Orchids, Green-winged orchid.
Дата поступления статьи: 26 декабря 2017 г.
