CC BY
60
Серия «Биология. Экология»
Онлайн-доступ к журналу: http://isu.ru/izvestia
2016. Т. 17. С. 5-11
Иркутского государственного университета
И З В Е С Т И Я
УДК 575.852'113:57.082.132:57.063.7
Перспективы использования внутренних
транскрибируемых спейсеров (ITS1 и ITS2)
для идентификации редких видов растений
на примере рода Waldsteinia (Rosaceae)
1 12 М. В. Протопопова , В. В. Павличенко , А. Д. Коновалов ,
2 2 2 3
Е. Д. Золотовская , Э. М. Байрамова , В. В. Чепинога '
1 Сибирский институт физиологии и биохимии растений СО РАН, Иркутск
2 Иркутский государственный университет, Иркутск
3 Институт географии им. В. Б. Сочавы СО РАН, Иркутск E-mail: marina.v.protopopova@gmail.com
Аннотация. Работа направлена на оценку возможности использования нуклеотид-ных последовательностей ITS регионов для идентификации представителей рода Waldsteinia (Rosaceae). Выявленная в работе степень внутри- и межвидовой вариабельности ITS1 региона обеспечивает возможность его успешного применения для идентификации видов рода Waldsteinia. Выявляемые с помощью молекулярного клонирования низкокопийные варианты ITS1 региона могут быть использованы для идентификации отдельных популяций W. ternata. Для ITS2 региона была отмечена высокая внутривидовая и внутрипопуляционная вариабельность одновременно с низким числом систематических замен, что не позволяет однозначно различать близкородственные виды. Таким образом, ITS2 регион не может быть в полной мере рекомендован для использования в качестве молекулярного маркера для установления видовой принадлежности представителей рода Waldsteinia.
Ключевые слова: ДНК-штрихкодирование, молекулярные маркеры, Waldsteinia, Байкальская Сибирь, неморальные реликты, редкие и исчезающие виды, ITS 1, ITS2.
В настоящее время активное развитие получают методы молекулярной идентификации (DNA barcoding), которые позволяют по коротким нуклео-тидным последовательностям в геноме (ДНК-маркеры или молекулярные маркеры) определять видовую принадлежность организма [7]. С помощью этих технологий стало возможным проводить быструю идентификацию видов, определение которых с помощью морфологических критериев затруднено. Данный принцип лёг в основу глобального проекта по созданию генетической базы данных (Barcode of Life Data System - BOLD) для возможности идентификации всех живых организмов - «Штрихкод жизни» (от англ. Barcode of Life). ДНК-штрихкодирование имеет огромные перспективы как экспресс-метод определения видов (в том числе и по биологическим остат-
Введение
кам), что может найти широкое применение в экспертизе ряда товаров, при проведении таможенного и карантинного контроля, в экологическом мониторинге редких и исчезающих видов. Следует, однако, отметить, что в отличие от методов молекулярной филогенетики, ДНК-штрихкодирование может рассматриваться лишь как подход для определения места данного организма в уже существующей классификации, а не для установления новых филогенетических связей.
В качестве универсального маркера для ДНК-штрихкодирования животных используется последовательность 5'-фрагмента гена первой субъединицы цитохром с-оксидазы (CO1 или coxl) [6; 7]. Попытки использовать универсальные маркеры для растений оказались менее успешными. На сегодняшний день наиболее перспективными маркерами считаются внутренние транскрибируемые спейсеры ядерных генов рРНК (ITS 1 и ITS2), а также некоторые фрагменты пластидного генома (например, rbcL, matK, trnH-psbA, atpF-atpH, rpoB, rpoCl, psbK-psblи др.) [8; 12; 13].
Настоящее исследование направлено на оценку возможности использования нуклеотидных последовательностей ITS1 и ITS2 для идентификации представителей рода Waldsteinia (Rosaceae).
Материалы и методы
В качестве основного объекта исследования была выбрана Waldsteinia ternata (Steph.) Fritsch. Вид является эндемиком Южной Сибири, относится к неморальным реликтам и включён в Красные книги Иркутской области и Республики Бурятия [2-4]. Сбор образцов проводили из нескольких популяций в предгорьях хр. Хамар-Дабан (поймы рек Безымянная, Дулиха, Выдри-ная и Снежная) и Восточного Саяна (пойма р. Белая Зима). В работе также использованы образцы из приморских популяций дальневосточного вида W. maximowicziana (Juz. ex Teppner) Probat. (Надеждинский район, окрестности посёлков Раздольное и Сиреневка) и европейского вида W. geoides Willd. (Ботанический сад ИГУ). Свежие неповреждённые листья растений фиксировали (высушивали) в силикагеле, затем образцы засыпали свежим дегидратированным силикагелем и хранили в темноте до момента проведения молекулярно-генетических анализов. В работе были также использованы несколько экземпляров W. ternata из гербариев СИФИБР СО РАН и ИГУ. Анализ проводили минимум для пяти особей из каждой популяции. ДНК выделяли из высушенных листьев СТАВ-методом [9] с авторскими модификациями [1]. Амплификацию ITS1-ITS2 региона проводили в финальном объёме реакционной смеси 20 мкл с использованием ДНК-полимеразы GoTaq Flexi (Promega, США), универсальных праймеров [11; 14] с финальной концентрацией каждого 250 нМ и отжиге при 52 °С в течение 20 с. Для выявления основных нуклеотидных вариантов ITS1-ITS2 региона полученные ампликоны электрофоретически отделяли от компонентов реакции в агарозном геле, очищали с помощью набора GenJet Gel Extraction Kit (Thermo Fisher Scientific, США) и использовали в качестве ДНК-матрицы для реакции терминирования. Для выявления низкокопийных нуклеотидных
Известия Иркутского государственного университета 2016. Т. 17. Серия «Биология. Экология». С. 5-11
вариантов ITS1-ITS2 региона очищенные ампликоны лигировали в плаз-мидный вектор pTZ57R/T (Thermo Fisher Scientific, США) с последующей трансформацией E. coli. Плазмиды и исходные ампликоны секвенировали по методу Сэнгера с использованием набора реагентов для терминирования BigDye Terminator v. 3.1 (Applied Biosystems, США) на генетическом анализаторе ABI3500 (Applied Biosystems, США). Выравнивание и анализ нуклео-тидных последовательностей, а также расчёт генетических дистанций осуществляли в программе MEGA 7 v. 7.0.16. Для выравнивания нуклеотидных последовательностей использовали алгоритм MUSCLE, расчёт генетических дистанций проводили исходя из оптимальной модели нуклеотидных замен (модель Кимуры).
Результаты и обсуждение
Анализ ITS1 региона у особей из всех исследованных популяций не выявил внутривидовой вариабельности его основных нуклеотидных вариантов в пределах рода Waldsteinia. В то же время были выявлены существенные межвидовые различия. На рис. 1 представлены ДНК-штрихкоды ITS1 региона у трёх видов рода Waldsteinia. Так, было выявлено 7 нуклеотидных замен между W. ternata и W. geoides, 1 - между W. ternata и W. maximowicziana, 6 - между W. geoides и W. maximowicziana.
1 W. ternata 229
Т A TG С CG |
III lllllllllllllllllíllllllllllllllllllllllinilllllll
1 W. maximowicziana 229
С A TG С С G I
III ШИШ
1 W. geoides 229
С G CA T T A I
III llllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllliy
Рис. 1. ДНК-штрихкоды видов рода Waldsteinia, сгенерированные на основе нуклеотидных последовательностей ITS1 региона. Нуклеотиды представлены в виде полос, окрашенных в различные оттенки чёрно-белого спектра (А - белый; С -светло-серый; T - тёмно-серый; G - чёрный). Цветная маркировка и буквенные обозначения указывают на сайты, для которых выявлены межвидовые различия. Цифрами обозначена длина фрагмента в парах оснований
Таким образом, межвидовые дистанции в пределах рода достигали 1-4 %, а различия с наиболее близкими последовательностями представителей других родов сем. Rosaceae - 2-5 % (рис. 2). Использование метода молекулярного клонирования в клетках E. coli позволило дополнительно выявить несколько низкокопийных вариантов ITS 1, уникальных для отдельных популяций W. ternata. Эти уникальные варианты, по-видимому, являются производными от основного и имеют несколько дополнительных замен.
Таким образом, наличие в последовательности ITS1 сайтов с систематическими заменами позволяет идентифицировать виды рода Waldsteinia со 100%-ной достоверностью. Кроме того, поскольку в большинстве случаев межвидовая генетическая дистанция превышала 2 %, это дополнительно подтверждает возможность использования ITS1 региона для молекулярной идентификации [6; 7]. Только в паре W. ternata - W. maximowicziana обнаруженные различия составили около 1 %. Довольно низкий уровень различий в ITS 1 регионе может объясняться тем, что на сегодняшний день видовая самостоятельность W. maximowicziana неоднозначна, поскольку он был выделен из W. ternata [5] главным образом на основании географической изолированности популяций. Тем не менее наличие даже единственной систематической замены в ITS1 регионе позволяет однозначно определять источник происхождения биологического образца.
Название вида 1 2 3 4 5
И/, ternata 1 -
W. maximowicziana 2 0,01 SE = 0,00 -
W. geoides 3 0,04 SE = 0,01 0,03 SE = 0,01 -
Taihangia rupestris 4 0,03 SE = 0,01 0,02 SE = 0,01 0,03 SE - 0,01 -
Geum vernum 5 0,05 SE - 0,01 0,04 SE = 0,01 0,04 SE - 0,01 0,03 SE = 0,01 -
Рис. 2. Межвидовые генетические дистанции (K2P), рассчитанные исходя из количества нуклеотидных различий в ITS1 регионе. Показаны значения генетических дистанций и их стандартные ошибки (SE)
Для ITS2 региона нами была отмечена высокая внутривидовая и даже внутрипопуляционная вариабельность (в отдельных случаях более 1 %) одновременно с низким числом систематических замен, что не позволяет однозначно различать близкородственные виды. Стоит отметить, что в настоящее время для молекулярной идентификации растений в системе BOLD рекомендован именно ITS2 регион, однако наши результаты показали, что его использование для видов рода Waldsteinia представляется затруднительным. Большая эффективность ITS1 по сравнению с рекомендованным ITS2 регионом показана также на примере ряда других видов [10]. В дальнейшем
Известия Иркутского государственного университета 2016. Т. 17. Серия «Биология. Экология». С. 5-11
нами планируется разработка подхода на основе одновременного использования нескольких молекулярных маркеров, включая rbcL и matK, использующихся в настоящее время в системе BOLD.
Заключение
Нуклеотидные последовательности ITS1 региона могут быть успешно использованы для идентификации видов рода Waldsteinia. Выявляемые с помощью молекулярного клонирования низкокопийные варианты ITS1 региона могут быть использованы при идентификации отдельных популяций W. ternata. Нуклеотидная последовательность ITS2 региона не может быть в полной мере рекомендована для установления видовой принадлежности представителей рода Waldsteinia.
Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (проекты 16-34-60135 моладк, 14-04-31350-мола и 16-05-00783). Авторы благодарят Байкальский аналитический центр (ЦКП) СО РАН при Президиуме ИНЦ СО РАН за предоставленный доступ к оборудованию, гербарные фонды СИФИБР СО РАН и ИГУ за предоставление образцов для анализа, Ботанический сад ИГУ за предоставленные образцы W. geoides, г.н.с. БПИ ДВО РАН Н. С. Пробатову и зам. директора БСИ ДВО РАН Е. А. Пименову за помощь в сборе образцов W. maximowicziana.
Список литературы
1. Использование генетических маркеров для оценки состояния реликтовых видов растений Байкальской Сибири / М. В. Протопопова [и др.] // Вестн. РУДН. Сер. Экология и безопасность жизнедеятельности. - 2015. - Т. 4. - С. 28-36.
2. Красная книга Иркутской области. - Иркутск : Время странствий, 2010. -480 с.
3. Красная книга Республики Бурятия: редкие и находящиеся под угрозой исчезновения виды животных, растений и грибов. - Улан-Удэ : Изд-во БНЦ СО РАН, 2013. - 688 с.
4. Положий А. В. Реликты третичных широколиственных лесов во флоре Сибири / А. В. Положий, Э.Д. Крапивкина. - Томск : Изд-во Том. гос. ун-та, 1985. -158 с.
5. Пробатова Н.С. Семейство Розовые - Rosaceae / Н. С. Пробатова, В. Ю. Барка-лов // Флора российского Дальнего Востока. - Владивосток : Дальнаука, 2006. -С. 160-168.
6. Шнеер В. С. ДНК-штрихкодирование видов животных и растений - способ их молекулярной идентификации и изучения биоразнообразия / В. С. Шнеер // Журн. общ. биологии. - 2009. - Т. 70, № 4. - С. 296-315.
7. Biological identifications through DNA barcodes / P. D. N. Hebert [et al.] // Proc. Biol. Sci. - 2003. - Vol. 270. - P. 313-321.
8. CBOL Plant Working Group. A DNA barcode for land plants / CBOL Plant Working Group // PNAS. - 2009. - Vol. 106, N 31. - P. 12794-12797.
9. Doyle J. J. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue / J. J. Doyle, J. L. Doyle // Phytochem. Bull. - 1987. - Vol. 19. - P. 11-15.
10. ITS1: a DNA barcode better than ITS2 in eukaryotes? / X-C. Wang [et al.] // Mol. Ecol. Resour. - 2015. - Vol. 15. - P. 573-586.
11. History and evolution of alpine plants endemic to the Qinghai-Tibetan Plateau:
Aconitum gymnandrum (Ranunculaceae) / L. Wang [et al.] // Mol. Ecol. - 2009. - Vol. 9, N 4. - P. 709-721.
12. Land plants and DNA barcodes: short-term and long-term goals / M. W. Chase [et al.] // Philos. Trans. R. Soc. Lond. Biol. Sci. - 2005. - Vol. 360. - P. 1889-1895.
13. Universal Plant DNA Barcode Loci May Not Work in Complex Groups: A Case Study with Indian Berberis Species / S. Roy [et al.] // PLoS ONE. - 2010. - Vol. 5, N 10. - e13674.
14. Utelli A. Molecular and morphological analyses of European Aconitum species (Ranunculaceae) / A. Utelli, B. Roy, M. Baltisberger // Plant Systematics and Evolution. -2000. - Vol. 224. - P. 195-212.
The Perspectives for the Internal Transcribed Spacer (ITS1 and ITS2) Application for the Endangered Plant Species Identification with Waldsteinia (Rosaceae) as an Example
M. V. Protopopova1, V. V. Pavlichenko1, A. D. Konovalov2, E. D. Zolotovskaya2, E. M. Bairamova2, V. V. Chepinoga2,3
1 Siberian Institute of Plant Physiology and Biochemistry SB RAS, Irkutsk
2 Irkutsk State University, Irkutsk
3 V. B. Sochava Institute of Geography SB RAS, Irkutsk
Abstract. The study was aimed to estimate the possibility to use the ITS nucleotide sequences for molecular identification of species from Waldsteinia genus (Rosaceae). The detected levels of intra- and interspecific ITS1 variability allow using this molecular marker for identification of Waldsteinia species. The low copy number variants of ITS1, revealed by molecular cloning approach, can be used for identification of distinct populations of W. ternata. A high intraspecific and intrapopulation variation of ITS2 region, together with a low number of systematic substitutions do not allow to distinguish these closely related species. Thus, using of ITS2 region as a molecular marker for Waldsteinia genus is very ambiguous.
Keywords: DNA barcoding, molecular markers, Waldsteinia, Baikal Siberia, nemoral relict species, endangered species, ITS1, ITS2.
Протопопова Марина Владимировна кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Сибирский институт физиологии и биохимии растений СО РАН 664033, г. Иркутск, ул. Лермонтова, 132 тел.: (3952) 42-46-59 факс: (3952) 51-07-54 e-mail: marina. v.protopopova@gmail. com
Павличенко Василий Валерьевич кандидат биологических наук, старший научный сотрудник
Известия Иркутского государственного университета 2016. Т. 17. Серия «Биология. Экология». С. 5-11
Protopopova Marina Vladimirovna
Candidate of Science (Biology),
Senior Research Scientist
Siberian Institute of Plant Physiology
and Biochemistry SB RAS
132, Lermontov st., Irkutsk, 664033
tel.: (3952) 42-46-59
fax: (3952) 51-07-54
e-mail: marina.v.protopopova@gmail.com
Pavlichenko Vasiliy Valeryevich Candidate of Science (Biology), Senior Research Scientist
Сибирский институт физиологии
и биохимии растений СО РАН
664033, г. Иркутск, ул. Лермонтова, 132
тел.: (3952) 42-46-59
факс: (3952) 51-07-54
e-mail: vpavlichenko@gmail. com
Коновалов Алексей Дмитриевич студент
Иркутский государственный университет 664003, г. Иркутск, ул. К. Маркса, 1 тел.: (3952) 24-18-70 e-mail: konovalov. alexey. d@gmail. com
Золотовская Елена Дмитриевна студент
Иркутский государственный университет 664003, г. Иркутск, ул. К. Маркса, 1 тел.: (3952) 24-18-70 e-mail: zolotovskayaelenad@gmail. com
Байрамова Эльвира Махаловна студент
Иркутский государственный университет 664003, г. Иркутск, ул. К. Маркса, 1 тел.: (3952) 24-18-70 e-mail: bairamovaelvira@gmail. com
Чепинога Виктор Владимирович доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник Институт географии им В. Б. Сочавы СО РАН
664033, г. Иркутск, ул. Улан-Баторская, 1
тел.: (3952) 42-70-95
профессор
Иркутский государственный университет 664003, г. Иркутск, ул. К. Маркса, 1 тел.: (3952) 24-18-55 e-mail: victor. chepinoga@gmail. com
Siberian Institute of Plant Physiology
and Biochemistry SB RAS
132, Lermontov st., Irkutsk, 664033
tel.: (3952) 42-46-59
fax: (3952) 51-07-54
e-mail: vpavlichenko@gmail. com
Konovalov Aleksey Dmitryevich Student
Irkutsk State University
1, K. Marx st., Irkutsk, 664003
tel.: (3952) 24-18-70
e-mail: konovalov. alexey. d@gmail. com
Zolotovskaya Elena Dmitryevna Student
Irkutsk State University
1, K. Marx st., Irkutsk, 664003
tel.: (3952) 24-18-70
e-mail: zolotovskayaelenad@gmail. com
Bayramova Elvira Makhalovna Student
Irkutsk State University
1, K. Marx st., Irkutsk, 664003
tel.: (3952) 24-18-70
e-mail: bairamovaelvira@gmail. com
Chepinoga Victor Vladimirovich Doctor of Sciences (Biology), Leading Research Scientist V. B. Sochava Institute of Geography SB RAS
1, Ulan-Batorskaya st., Irkutsk, 664033
tel.: (3952) 42-70-95
Professor
Irkutsk State University
1, K. Marx st., Irkutsk, 664003
tel.: (3952) 24-18-55
e-mail: victor. chepinoga@gmail. com
