CC BY
14
Серия «Биология. Экология»
2014. Т. 8. С. 10-14 Онлайн-доступ к журналу: http://isu.ru/izvestia
И З В Е С Т И Я Иркутского государственного университета
УДК 595.421
Анализ нуклеотидных последовательностей и определение филогенетического положения клещей Dermacentor silvarum
12 3
Т. А. Болотова , Н. В. Кулакова , М. А. Хаснатинов , Ю. А. Вержуцкая4, Е. И. Андаев4, С. И. Беликов2
'Иркутский государственный университет, Иркутск 2Лимнологический институт СО РАН, Иркутск
3Научный центр проблем здоровья семьи и репродукции человека СО РАМН, Иркутск
4Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора, Иркутск E-mail: bolotova_t.a@hotmail.com
Аннотация. Представлены результаты анализа митохондриального гена 16S rRNA и внутреннего нетранслируемого спейсера - ITS2 клещей Dermacentor silvarum, обитающих на территории Иркутской области. Нами установлено высокое генетическое сходство всех исследованных последовательностей D. silvarum. В результате филогенетического анализа было показано, что D. silvarum и D. nuttalli являются близкородственными видами, которые не различаются на основе исследуемых молекулярных маркеров. Установлено, что D. silvarum относится к филогенетической ветви, объединяющей евроазиатские виды Dermacentor с наиболее близкими видами D. nuttalli и D. marginatus.
Ключевые слова: филогения рода Dermacentor, Dermacentor silvarum, mt 16S rRNA, ITS2.
Введение
В Восточной Сибири клещи рода БегтасеМог являются переносчиками ряда опасных для человека заболеваний, таких как клещевой риккетсиоз, Лайм-боррелиоз и клещевой энцефалит [2]. Установлено, что заражённость дермацентровых клещей риккетсиями достигает 70-80 %. На территориях степной и лесостепной зон Иркутской области отмечены два вида клещей: БегтасепО пиШШ (01епеу, 1929) и БегтасепО silvarum (01епеу, 1931) [11]. В ряде случаев представители этих видов обладают вариабельными фенотипическими признаками, что может затруднять их морфологическое определение [1]. С целью оценки возможности применения молекулярных маркеров для видовой идентификации и определения филогенетического положения Б. silvaгum нами проанализированы два молекулярных маркера: фрагмент митохондриального (мт) гена 168 рРНК и нетранслируемый межгенный спейсер 1Т82.
Материалы и методы
Сбор материала проведён в пос. Монды (Республика Бурятия) в 2012 г. Видовую идентификацию проводили по морфологическим признакам с помощью определителей [4; 5]. Пять самок и пять самцов были идентифицированы как D. silvarum, остальные восемь клещей взяты в анализ без морфологического определения. Выделение ДНК выполняли с помощью набора Рибо-Сорб (Амплисенс, Москва). Полученные образцы амплифицировали в ПЦР с двумя парами праймеров: 16Sf (5-TTGCTGTGGTATTTTGACTA-3), 16Sr (5-CCGGTCTGAACTCAGATC-3) и 5.8Sf (5-GGGTCGATGAAGAACGCAGCCAGC-3), 28Sr (5-TTCAGGGGGTTGTCTCGCCTGATG-3) [7; 8]. ПЦР-продукты длиной 440 н. о. (фрагмент гена 16S рРНК) и 1200 н. о. (ITS2) выявляли с помощью электрофореза и очищали из геля 0,8%-ной агарозы. Определение первичных последовательностей ДНК проводили с помощью генетического анализатора ABI 3500xL (Applied Biosystems). Поиск гомологичных последовательностей проводили с помощью программы BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). Редактировали и выравнивали нуклео-тидные последовательности в программе BioEdit (v. 7.0.9.0) [9]. Филогенетический анализ проводили методом максимального правдоподобия (maximum likelihood (ML)) на основе двухпараметрической модели Tamura (T92) в 1 000 повторов с помощью программы Mega 5.0 [10].
Результаты
В ходе работы были получены восемнадцать нуклеотидных последовательностей для каждого из анализируемых участков: мт 16S рРНК и ITS2. Вариабельность исследуемых последовательностей была незначительной и не превышала 1,1 % и 0,5 % для 16S и ITS2, соответственно. Гетерогенность фрагмента гена мт 16S рРНК была связана с наличием инсерций и делеций в районах, содержащих T-A- и T-повторы. Гетерогенность ITS2 была связана с наличием транзиций в гетерозиготных сайтах. После выравнивания исследуемых нуклеотидных последовательностей идентичные последовательности были удалены из дальнейшего анализа. В результате по три последовательности для каждого из регионов были использованы для построения филогенетических реконструкций. Филогенетические деревья, полученные на основе мт 16S рРНК и ITS2, имели схожую топологию (рис.).
На представленных филогенетических деревьях последовательности D. silvarum кластеризовались в одну кладу близкородственных последовательностей вместе с D. nuttalli и располагались на филогенетической ветви «евразийских видов», куда также вошли D. marginatus и D. reticulatus. Близкое филогенетическое родство D. silvarum и D. marginatus согласуется c выводами, полученными на основе анализа морфологических признаков [6]. Несмотря на то, что все взятые для анализа виды рода Dermacentor хорошо различаются на основе исследованных молекулярных маркеров и образуют отдельные клады на филогенетических деревьях, виды D. silvarum и D. nut-talli представлены единой группой высокогомологичных последовательно-
стей и не могут быть дифференцированы с помощью гена мт 16S рРНК и ITS2.
—4 о. илйймй (7 avquvmO
Н Q. rtXvltM
- О- mifprttftu
P. tbtrvm К N4 D. Hufla*i (CKrta, JF979375) _ D. Irhamtr Mandi 21 0. I ILJH/ (SrtHia. - F 9Я7411 P. льягй. (b.beno. IF934743J P. s#r«w №idi & C. irfvjmm MAnji S
О i .Vj " / 0. nurrJHV elide
г flwptenfirwcurots (15<3M>
——^ P. iTjrg - i-, - (fi ЧЧ*"" <"■'
| 0. iL-a1' (Dm, КСИ№»] A D nutl* .1**1.1 Lp. '.tjr 1&ЖГ9, KFH1S70J L ищи* (С1НИ, КСЖШ1!
II P. f rfcJ™tt Wlrtrfi 19
III nuta i .1:Ion, If 11 111'., lp. HHfrvm Met*'W I P. ннтнпмела¡5
It (AF 771360;.
Рис. Реконструкция филогенетических отношений клещей рода Dermacentor. Филогенетические деревья построены на основе фрагмента гена 16S рРНК митохондрий длиной 390 н. о. (А) и ITS2 длиной 1066 н. о. (Б). В узлах указаны значения бутстреп-поддержки. Шкала соответствует количеству нуклеотидных замен. В скобках приведены количество последовательностей, место изоляции, номер доступа в базе данных GenBank. Исследованные в работе последовательности выделены жирным шрифтом
Заключение
На основе проведённого филогенетического анализа было установлено, что род Dermacentor представлен двумя филогенетическими линиями, которые совпадают с географическим распространением входящих в них видов. Одна из них объединяет американские виды D. andersoni, D. variabilis, D. albipictus, а другая включает евроазиатские виды D. marginatus, D. reticulatus, D. silvarum и D. nuttalli. Филогенетические реконструкции указывают на близкое родство видов D. silvarum и D. nuttalli. Анализ внутривидовой вариабельности видов рода Dermacentor из обеих филогенетических линий указывает на незначительную внутривидовою гетерогенность, в среднем составляющую 2 %, как следует из анализа мт 16S рРНК и ITS2. В то же время нуклеотидные различия, установленные как внутри видов, так и между видами D. silvarum и D. nuttalli, оказались значительно меньшими (0,5-1 %), что требует дальнейшего изучения. Применение исследуемых молекулярных маркеров не позволило дифференцировать близкие виды D. silvarum и D. nuttalli. Таким образом, на основе анализа молекулярных маркеров мт 16S рРНК и ITS2 выявлена низкая генетическая гетерогенность исследуемых последовательностей D. silvarum и установлено близкое филогенетическое родство с D. nuttalli.
Список литературы
1. Абрамсон Н. И. Молекулярные маркеры, филогеография и поиск критерия разграничения видов / Н. И. Абрамсон // Тр. Зоол. Ин-та РАН, 2009. - Прил. 1. -С. 185-198.
2. Аммосов А. Д. Клещевой энцефалит / А. Д. Аммосов. - Кольцово : Вектор-Бест, 2006. - 115 с.
3. Колонин Г. В. Распространение иксодовых клещей: роды: Dermacentor, Ahocentor, Cosmiomma, Dermacentonomma, Nosomma, Rhipicentor, Rhipicephalus, Boophilus, Margaropus, Anomalohimalaya / Г. В. Колонин ; отв. ред. Г. П. Сомов. -М. : Наука, 1984. - 96 с.
4. Сердюкова Г. В. Иксодовые клещи фауны СССР / Г. В. Сердюкова. - Л. : Наука, 1956. - 122 с.
5. Филиппова Н. А. Иксодовые клещи подсемейства Amblyomminae / Н. А. Филиппова // Фауна России. - СПб. : Наука, 1997. - 436 с.
6. Филиппова Н. А. Некоторые аспекты внутривидовой изменчивости близкородственных видов группы Dermacentor marginatus (Acari: Ixodidae) как показатель микроэволюционного процесса / Н. А. Филиппова, М. А. Плаксина // Паразитология. - 2005. - Т. 39, вып. 5. - С. 337-364.
7. Black W.C. 4th Phylogeny of hard- and soft-tick taxa (Acari: Ixodida) based on mitochondrial 16S rDNA sequences / W. C. Black, J. Piesman // Proc Natl Acad Sci USA. - 1994. - Vol. 91, N 21. - P. 10034-10038.
8. Molecular phylogenetic analysis of ixodid ticks based on the ribosomal DNA spacer, internal transcribed spacer 2, sequences / M. Fukunaqa [et al.] // J. Parasitol. -2000. - Vol. 86, N 1. - P. 38-43.
9. Hall T. A. BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT / T. A. Hall // Nucl. Acids. Symp. Ser. - 1999. -N 41. - P. 95-98.
10. MEGA5: molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood, evolutionary distance, and maximum parsimony methods / K. Tamura [et al.] // Molecular Biology and Evolution. - 2011. - N 28. - P. 2731-2739.
11. Kolonin G. V. Fauna of Ixodid ticks of the world (Acari, Ixodidae) [Electronic resource] / G. V. Kolonin. - М., 2009. - URL.: http: //www.kolonin.org.
Analysis of Nucleotide Sequences and Determination of Phylogenetic Relationships of Ticks Dermacentor silvarum
T. A. Bolotova1, N. V. Kulakova2, M. A. Khasnatinov3, Yu. A. Verzhutskaya4, E. I. Andaev4, S. I. Belikov2
'Irkutsk State University, Irkutsk 2Limnological Institute SB RAS, Irkutsk
3Scientific Center of Family Health and Human Reproduction Problems SB RAMS, Irkutsk
4Irkutsk Antiplague Research Institute of Rospotrebnadzor, Irkutsk
Abstract. In this work we have presented the results of analysis of mitochondrial 16S rRNA gene and internal transcribed spacer ITS2 of ticks Dermacentor silvarum from Irkutsk region. The high genetic homogeneity was found among analyzed sequences of D. silvarum. It was shown from phylogenetic analysis that D. silvarum and D. nuttalli are close related species which could not be differentiated on the basis these molecular markers. We found that D. silvarum belonged to phylogenetic lineage that combined Euroasian species of Dermacentor where D. nuttalli and D. marginatus are most close related species.
Keywords: phylogeny of Dermacentor, Dermacentor silvarum, mitochondrial 16S rRNA gene, ITS2 region.
Болотова Татьяна Андреевна Bolotova Tatyana Andreevna
студент Student Иркутский государственный университет Irkutsk State University
664003, г. Иркутск, ул. К. Маркса, ' ', K. Marx st., Irkutsk, 664003
тел.: (3952) 24-18-70 tel.: (3952) 24-18-70
e-mail: bolotova_t.a@mail.com e-mail: bolotova_t.a@mail.com
Кулакова Нина Викторовна Kulakova Nina Viktorovna
кандидат биологических наук Candidate of Sciences (Biology)
старший научный сотрудник Senior Research Scientist
Лимнологический институт СО РАН Limnological Institute SB RAS 664033, г. Иркутск, ул. Улан-Баторская, 3 3, Ulan-Batorskaya st., Irkutsk, 664033
тел.: (3952) 5'-'8-74 tel.: (3952) 5'-'8-74
e-mail: kulakova@lin.irk.ru e-mail: kulakova@lin.irk.ru
Хаснатинов Максим Анатольевич кандидат биологических наук старший научный сотрудник Научный центр проблем здоровья семьи и репродукции человека СО РАМН 664025, г. Иркутск, ул. К. Маркса, 3 тел./факс (3952) 33-39-7' e-mail: khasnatinov@yandex.ru
Вержуцкая Юлия Алексеевна кандидат биологических наук младший научный сотрудник Иркутский противочумный институт Роспотребнадзора 664047, г. Иркутск, ул. Трилиссера,78 тел.: (3952) 22-01-40 e-mail: adm@chumin.irkutsk.ru
Андаев Евгений Иванович
доктор медицинских наук
заведующий лабораторией
Иркутский противочумный институт
Роспотребнадзора
664047, г. Иркутск, ул. Трилиссера,78
тел.: (3952) 22-01-40
e-mail: adm@chumin.irkutsk.ru
Беликов Сергей Иванович доктор биологических наук, профессор заведующий лабораторией Лимнологический институт СО РАН 664033, г. Иркутск, ул. Улан-Баторская, 3 тел. (3952) 42-84-22, факс (3952)42-54-05 e-mail: sergeibelikov4 7@gmail.com
Khasnatinov Maksim Anatolyevitch Candidate of Sciences (Biology) Senior Research Scientist Scientific Centre of the Problems of Family Health and Human Reproduction SB RAMS 3, K. Marx st., Irkutsk, 664025 tel./fax: (3952) 33-39-71 e-mail: khasnatinov@yandex.ru
Verzhutskaya Yuliya Alekseevna Candidate of Sciences (Biology) Junior Research Scientist Irkutsk Antiplague Research Institute of Siberia and Far East of Rospotrebnadzor 78, Trilisser st., Irkutsk, 664047 tel.: (3952) 22-01-40 e-mail: adm@chumin.irkutsk.ru
Andaev Evgeniy Ivanovich Doctor of Sciences (Medicine) Head of Laboratory
Irkutsk Antiplague Research Institute of Siberia and Far East of Rospotrebnadzor 78, Trilisser st., Irkutsk, 664047 tel.: (3952) 22-01-40 e-mail: adm@chumin.irkutsk.ru
Belikov Sergey Ivanovich Doctor of Sciences (Biology) Professor, Head of Laboratory Limnological Institute SB RAS 3, Ulan-Batorskaya st., Irkutsk, 664033 tel.: (3952)42-84-22 fax: (3952) 42-54-05 e-mail: sergeibelikov4 7@gmail.com
