CC BY
79
6. Bertazza L., Mocellin S. Curr. Med. Chem. 2010; 17: 3337-52.
7. BiswasD.K., Iglehart J.D. J. Cell. Phyiol. 2006; 209: 645-52.
8. ErdeiE., KangH., Meisner A. et al. Cytokine. 2010; 51: 18-24.
9. Gaudet M., Milne R., Cox A. et al. Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 2009; 18 (5): 1610-6.
10. Guo J., MengH, Pei J., ZhuM. Breast Care. 2011; 6: 126-9.
11. HajeerA.H., HutchinsonI.V. Hum. Immunol. 2001; 62: 1191-9.
12. Hicks Ch., KumarR., PannutiA., Miele L. Breast Cancer: Basic Clin. Res. 2012; 6: 47-66.
13. Jatoi A., Dakhil S.R., Nguyen P.L. et al. Cancer. 2007; 110: 1396403.
14. KohaarI., TiwariP., KumarR. et al. Breast Cancer Res. Treat. 2009; 114: 347-55.
15. Pooja S., Francis A., BidH. et al. Breast Cancer Res. Treat. 2011; 126: 739-47.
16. RubioM.F., Werbajh S., CafferataE.G.A. et al. Oncogene. 2006; 25: 1367-77.
17. Sirotkovic-Skerlev M., Cacev T., Krizanac S. et al. Exp. Mol. Pathol. 2007; 83: 54-8.
18. Sorlie T., Perou C.M., TibshiraniR. et al. Proc Natl. Acad. Sci. USA. 2001; 98: 10869-74.
19. Yin Y., ChenX., Shu Y. Biomed. Pharmacother. 2009; 63: 421-8.
Поступила 15.07.12
ANALYSIS OF THE -238(G/A)TNF POLYMORPHISM IN BREAST CANCER PATIENTS
T.F. Malivanova, E.V. Skoromyslova, VA. Yurchenko, I.B. Kononenko, L.V. Manzyuk, NN. Mazurenko
N.N. Blokhin Russian cancer research Center RAMS, Moscow, RF
TNF is an inflammatory cytokine that involved in pathogenesis of different malignancies. Promoter single nucleotide polymorphism -238(G/A)TNF (rs361525) is investigated for the detection of susceptibility to the infectious, autoimmune and oncological diseases. The goal of the study was to investigate the association of -238(G/A)TNF polymorphism (rs361525) with breast cancer (BC) prognosis. -238(G/A) TNF allelic variants were detected by PCR-RFLP. We failed to reveal the genotype distributions disparity among groups with different stages of the disease, ER, PR or Her2/neu positive versus negative status. The AG genotype frequency was about 10% and there were no BC patients with AA genotype in all separated groups. However the overall survival was significantly lower for AG then for GG carriers with II stage or ER-positive BC. Our data suggest that -238(G/A)TNF polymorphism perhaps is not involved in the initiation of malignancies but it is a substantial factor of BC prognosis.
Key words: tumor necrosis factor TNF, polymorphism, breast cancer
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2013 УДК 579.881.3:579.25].083.1
В.А. Рар1, Т.И. Епихина1, Н.М. Пуховская 2, Н.П. Высочина2, Л.И. Иванов2
ГЕНЕТИЧЕСКОЕ РАЗНООБРАЗИЕ БАКТЕРИЙ Из СЕМЕЙСТВА ANAPLASMATACEAE, ОБНАРУжЕННЫХ У КЛЕЩЕЙ РОДА HAEMAPHYSALIS И DERMACENTOR НА ТЕРРИТОРИИ ДАЛьНЕГО ВОСТОКА
Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, Новосибирск; 2Хабаровская противочумная
станция Роспотребнадзора
Методом двухраундовой полимеразной цепной реакции были исследованы образцы от 484 Haemaphysalis japonica, 359 Hae-maphysalis concinna и 221 Dermacentor silvarum, собранных на территории Амурской обл. и Хабаровского края, на наличие ДНК бактерий семейства Anaplasmataceae. Все положительные образцы были охарактеризованы посредством анализа нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК и/или groESL оперона. В 49 образцах от H. japonica и в 3 - от H. concinna была обнаружена ДНК двух новых генетических вариантов Ehrlichia spp., которые на основании анализа последовательностей как гена 16S рРНК, так и groESL оперона были наиболее схожи с генетическими вариантами эрлихий, обнаруженными в клещах рода Haemaphysalis на территории Японии. В 4 образцах от H. concinna была выявлена ДНК нового генетического вариантаAnaplasma bovis, который соответствовал генетическому варианту, обнаруженному у красно-серой полевки и у бурундука на территории Дальнего Востока. В трех образцах от H. concinna и 9 - от D. silvarum была обнаружена ДНК нетипичных бактерий, которых на основании анализа ну-клеотидных последовательностей гена 16S рРНК нельзя отнести ни к одному из родов семейства Anaplasmataceae. Выявленные нетипичные бактерии существенно отличались друг от друга по последовательностям гена 16S рРНК и не образовывали отдельной генетической группы.
Ключевые слова: семейство Anaplasmataceae, эрлихии, Anaplasma bovis, иксодовые клещи, генетические варианты
В семейство Anaplasmataceae входят внутриклеточные грамотрицательные облигатные внутриклеточные бактерии, размножающиеся внутри вакуолей в цитоплазме эукариотических клеток. В состав семейства входят переносимые гельминтами бактерии рода Neorickettsia, эндосимбионты беспозвоночных рода Wolbachia, а также переносимые иксодовыми клещами бактерии родов Anaplasma, Ehrlichia и от-
дельного филогенетического кластера "Candidatus Neoehrlichia mikurensis" [11, 19].
В соответствии с современной классификацией род Anaplasma объединяет бактерии шести видов, а род Ehrlichia - пяти видов [5]. Кроме того, в последние годы в различных видах клещей и млекопитающих была обнаружена ДНК новых генетических вариантов эрлихий, не относящихся ни к одному из общепризнанных видов [8, 9, 15, 16, 21, 23].
В России на территории различных областей у таежных клещей Ixodes persulcatus и мелких млекопитающих была обнаружена ДНК возбудителя гранулоци-тарного анаплазмоза человека Anaplasma phagocyto-philum, предполагаемого возбудителя моноцитарного эрлихиоза человека Ehrlichia muris и патогенных для людей бактерий "Candidatus Neoehrlichia mikurensis" [1, 3, 4, 6, 17, 18].
На Дальнем Востоке популяция иксодовых клещей представлена клещами, относящимся к нескольким родам - Ixodes, Haemaphysalis и Dermacentor. На территории Хабаровского и Приморского краев у таежных клещей и мелких млекопитающих были обнаружены бактерии тех же видов, что и на территории других областей [4, 17]. Кроме того, в крови мелких млекопитающих на территории Хабаровского края была обнаружена ДНК нового генетического варианта Ehrlichia spp. Khabarovsk [17], а в клещах Haema-physalis concinna на территории Приморского края -ДНК A. bovis [4].
Целью данной работы являлось изучение распро-
странения и генетического разнообразия бактерий из семейства Anaplasmataceae в клещах родов Haemaph-ysalis и Dermacentor на территории Амурской области и Хабаровского края.
Материалы и методы
Имаго клещей родов Haemaphysalis и Dermacentor были собраны с растительности на флаг в 2005-2009 гг. на двух отдаленных друг от друга участках в Хабаровском крае и одном участке в Амурской области. Первый участок находился в 25 км к югу от Хабаровска в хвойно-широколиственном лесу на территории Большехехцирского лесного заповедника, а второй участок - в 100 км к северо-востоку от Хабаровска в смешанно-широколиственном лесу в окрестностях села Сарапульское. На территории Амурской области сборы проводили в смешанном лесу на расстоянии 90 км к северу от Благовещенска. Всего было собрано 484 клещей Haemaphysalis japonica, 359 клещей H. con-cinna и 221 клещей Dermacentor silvarum.
Суммарные нуклеиновые кислоты были экстрагированы из клещей с помощью набора "Проба НК" ("ДНК-технология", Москва) в соответствии с инструкцией производителя.
ДНК эрлихий и анаплазм выявляли с использованием двух-раундовой полимеразной цепной реакции (ПЦР) с родоспеци-фичными праймерами из области гена 16S рРНК, как описано ранее [2]. Первый раунд ПЦР проводили с праймерами Ehr1 и Ehr2, а второй - с праймерами Ehr3 и Ehr4 (табл. 1). Длина конечного ПЦР-продукта составляла 524 п.о. Видовую принадлежность бактерий устанавливали посредством проведения второго раунда ПЦР с видоспецифичными праймерами HGE1 и HGE2 для детекции A. phagocytophilum и Em1 и Em2 для детекции E. muris. Для определения нуклеотидных последовательностей ам-плифицировали фрагменты гена 16S рРНК длиной около 1350 п.о. с использованием в первом раунде ПЦР праймеров Ehr1 и Ehr6, а во втором - Ehr7 и Ehr8. Фрагменты оперона groESL длиной 1325-1375 п. о. амплифицировали с использованием в первом раунде ПЦР праймеров HS1-f и HS6-r, а во втором - HS3-f и HSVR (см. табл. 1).
Сравнение и анализ полученных нуклеотидных последовательностей выполняли с использованием программ BlastN (http: //www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST) и CLUSTALW (http: //www.ebi. ac.uk/clustalw/index.html). Филогенетический анализ проводили с помощью пакета филогенетических программ MEGA 5.0 (http://www.megasoftware. net/manual.html) с использованием метода объединения ближайших соседей (NG, neighbor-joining).
Нуклеотидные последовательности гена 16S рРНК и groESL оперона Ehrlichia spp. зарегистрированы в базе данных GenBank под номерами FJ966349, FJ966350, JX092090, JX092091. Нуклеотидные последовательности гена 16S рРНК и groESL оперона A. bovis зарегистрированы в базе данных GenBank под номерами JX092092-JX092095. Нуклеотидные последовательности гена 16S рРНК бактерий семейства Anaplasmataceae зарегистрированы в базе данных GenBank под номерами доступа FJ966355-FJ966358, JN581367-JN581373, JX092089.
Результаты и обсуждение
Выявление бактерий семейства
Anaplasmataceae. В результате проведения двухраундовой ПЦР в присутствии родоспецифичных праймеров в крови у 49 клещей H. japonica, 10 клещей H. concinna и у 9 D. silvarum была обнаружена ДНК бактерий семейства Anaplasmataceae. Проведение второго
раунда ПЦР в присутствии видоспецифичных праймеров показало, что ни один из проанализированных положительных образцов не содержал ни ДНК A. phagocytophilum, ни ДНК E. muris. У всех положительных образцов были определены нуклеотидные последовательности фрагмента гена 16S рРНК и/или groESL оперона. Все определенные нуклеотидные последовательности отличались от зарегистрированных ранее в базе данных GenBank. Проведенный филогенетический анализ показал, что исследованные образцы содержат ДНК бактерий, относящихся к различным филогенетическим кластерам. В крови у 49 клещей H. japonica и в 3 H. concinna была обнаружена ДНК Ehrlichia spp., у 4 клещей H. concinna - ДНК Anaplasma spp., а у 3 клещей H. concinna и у 9 клещей D. silvarum - ДНК нетипичных бактерий, которых нельзя отнести ни к одному из родов семейства Anaplasmataceae (табл. 2).
Молекулярно-генетический анализ бактерий Ehrlichia spp. Анализ нуклеотидных последовательностей фрагмента гена 16S рРНК и groESL оперона у образцов, содержащих ДНК Ehrlichia spp., показал наличие двух новых генетических вариантов эрли-хий, различающихся по обоим генетическим локусам. Эрлихии первого генетического варианта (типичный образец Ehrlichia spp. Kh-Hj27) были обнаружены во всех положительных образцах от H. japonica, а эрли-хии второго генетического варианта (типичный образец Ehrlichia spp. Ат-Нс79) - в 3 образцах от H. con-cinna. Представляется вероятным, что эрлихии, выявленные у клещей H. japonica, широко распространены на территории Хабаровского края. Интересно, что у клещей H. japonica, собранных на первом участке, частота выявления генетического варианта Ehrlichia spp. Kh-Hj27 в разные годы была схожей и составляла 7,8% в 2006 г. (4 из 51 клещей), 11,6% в 2007 г. (11 из 95 клещей), 9,7% в 2008 г. (20 из 207 клещей) и 7,4%
Таблица 1
Синтетические олигонуклеотиды, использованные при проведении двухраундовой
ПЦР
Ген Нуклеотидные последовательности праймеров (5'-3') Температура отжига, oC Источник литературы
Ген 16S рРНК Anaplasmataceae Ehr1 (aacgaacgctggcggcaagc) Ehr2 (agtaycgraccagatagccgc) 57 [2]
Ehr3 (tgcataggaatctacctagtag) 60 [2]
Ehr4 (ctaggaattccgctatcctct)
Ehr1 (gaacgaacgctggcggcaagc) Ehr6 63 [2]
(gacccaaccttaaatggctgc)
Ehr7 (taacacatgcaagtcgaacg) 60 [2]
Ehr8 (cttcgagttaagccaattcc)
Ген 16S рРНК A. phagocytophilum HGE1 (cggattattctttatagcttgc) HGE2 (cttaccgaaccgcctacatg) 55 [2]
Ген 16S рРНК Em1 (cgaacggatagctacccatagc) 55 [2]
E. muris Em2 (cgctccaaagttaagctttggt)
GroESL оперон Anaplasmataceae HS1-f (cgycagtgggctggtaatgaa) HS6-r (ccwccwggtacwacaccttc) 55 [22] (с незначительными изм.)
HS3-f (atagtyatgaaggagagtgat) 50 [14]
HSVR (tcaacagcagctctagtwg)
Таблица 2
Выявление ДНК бактерий семейства Anaplasmataceae в крови у клещей родов Haemaphysalis и Dermacentor
Места сбора клещей Вид клещей Число исследованных клещей Количество клещей, содержащих ДНК
Ehrlichia spp. Anaplasma spp. Anaplasmataceae бактерии
Хабаровский H. japonica 380 37 (9,7) 0 0
край, участок 1 H. concinna 91 0 0 2 (2,2)
D. silvarum 221 0 0 9 (4,1)
Хабаровский H. japonica 104 12 (11,5) 0 0
край, участок 2 H. concinna 195 1 (0,5) 2 (1,0) 1 (0,5)
Амурская обл. H. concinna 73 2 (2,7) 2 (2,7) 0
П р и м е ч а н и е . В скобках - количество в %
в 2009 г. (2 из 27 клещей). У эрлихий, выявленных в образцах от H. japonica, нуклеотидные последовательности гена 16S рРНК были идентичны друг другу и наиболее схожи с нуклеотидными последовательностями гена 16S рРНК эрлихий (Ehrlichia spp. EHf669 и Ehrlichia spp. EH727), обнаруженных у клещей Haemaphysalis spp. в Японии [8] (номера доступа в базе данных GenBank AY309969 и AY309970), отличаясь от них соответственно двумя и семью нуклеотидными заменами (уровень гомологии 99,8 и 99,5%; рис. 1). У эрлихий, выявленных в образцах от H. concinna, нуклео-тидные последовательности гена 16S рРНК также были идентичны друг другу и отличались девятью нуклеотидными заменами от соответствующих последовательностей как Ehrlichia spp. Kh-Hj27, так и Ehrlichia spp. EHf669 (уровень гомологии 99,3%). Проведенный филогенетический анализ показывает, что обнаруженные у клещей в образцах от Haemaphysalis spp. новые генетические варианты эрлихий вместе с эрлихиями, обнаруженными в образцах от Haemaphysalis spp. в Японии, образуют с индексом поддержки 92 отдельную ветвь на дендрограмме (см. рис. 1).
Нуклеотидные последовательности groESL оперона длиной 1293-1298 п. о. были определены для 16 образцов от H. japonica и для 2 образцов от H. concinna. Показано, что нуклеотидные последовательности groESL оперона новых генетических вариантов эрли-хий также высококонсервативны для каждого из генетических вариантов. Уровень гомологии между последовательностями groESL оперона генетических вариантов Ehrlichia sp. Kh-Hj27 и Ehrlichia spp. Am-^79 составил 97,3%. Вы-
100
веденные аминокислотные последовательности фрагмента GroEL белка длиной 396 а. о. Ehrlichia spp. Kh-Hj27 и Ehrlichia spp. Am-Hj27 были одинаковыми. Сравнение с другими известными нуклеотидными последовательностями показало, что последовательности groESL оперона Ehrlichia spp. Kh-Hj27 и Ehrlichia spp. Am-^79 наиболее схожи с соответствующими последовательностями Ehrlichia spp. Yonaguni138 и Ehrlichia sp. Yonaguni206 [15] (GenBank HQ697591), выявленными у клещей Haemaphysalis longicornis в Японии (уровень гомологии 94,1-94,4%), а из общепризнанных видов - с последовательностью groESL оперона E. ewingii (GenBank AF195273; уровень гомологии 93,8 и 93,1%; рис. 2). Следует отметить, что для генетических вариантов Ehrlichia spp. EHf669 и Ehrlichia sp. EH727, наибо-
97 78 40
26
55
79
65
100
Ehrlichia sp. Tibet (AF4I4399) Ehrlichia sp. Fujian (DQ324547)
ft
92 59
62
— Ehrlichia sp. ERm58 (AF311967) -Ehrlichia sp. Yonaguni (HQ697588)
— E. ewingii (U96436) -£ canis (M73221)
— Ehrlichia sp. Am-Hc79 Ehrlichia sp. EH727 (AY309970) j Ehrlichia sp. EHf669 (AY309969)
93~t Ehrlichia sp. Kh-Hj27 —Candidatus E. shimanensis (AB074459) £ chaffensis (U60476) -Ehrlichia sp. NSI01 (AB454074)
-£ muris (AB196302)
gjg , Ehrlichia sp. FN147 (AB196303) Ehrlichia sp. HF565 (AB024928) Ehrlichia sp. HF (DQ647318) - Ehrlichia sp. 360 (AB428564)
98
43 41
к
-E. ruminantium (X62432)
100
90 r
—Ehrlichia sp. Khabarovsk (FJ966352) -Candidatus N. lotoris (EF633744) — Candidatus N. mikurensis (AB196304)
-A. marginale (AF414872)
-A. platys (AF303467)
- A. phagocytophilum (M73224)
|—A. bovis, Япония (AB196475)
-A. bovis, Африка (U03775) ГА. bovis, Япония (НМ131218)
I А. bovis (Am-Hc60)
100 56 40
Ч'
ioo1 A. bovis (Am-vole57)
Рис.1. Дендрограмма сходства нуклеотидных последовательностей (длина 1302 п. о.) фрагмента гена 16S рРНК Anaplasmataceae, построенная с использованием метода NJ. Шкала представляет 1% дивергенции. Жирным шрифтом выделены последовательности образцов A. bovis от H. concinna (Am-Hc60) и от полевок (Am-vole57), а также новых генетических вариантов эрлихий (Ehrlichia spp. Kh-Hj27 и Ehrlichia spp. Am-Hc79).
761 Ehrlichia sp. HF565 (АВ037212)
100
57 100
99
81
99
100
100
Candidatus E. ovata (DQ672553) Ehrlichia sp. Anan (AB037211)
— E muris (AF210459)
— Ehrlichia sp. NS101 (AB454077) -E chaffeensis (L10917)
— E cais (U96731)
E ewingii (AF195273) I—Ehrlichia sp. Am-Hc79 L Ehrlichia sp. Kh-Hj27 r Ehrlichia sp. Yonaguni138 (HQ697590)
48
100
юс 'Ehrlichia sp. Yonaguni206 (HQ697591)
-Candidatus N. shimanensis (AB074462)
-Ehrlichia sp. Khabarovsk (FJ966352)
-E ruminantium (U13638)
-Candidatus N. mikurensis (AB074461)
-Candidatus N. lotoris (EF633745)
100
100
A. bovis (Am-vole57)
98
A. bovis (Am-Hc60) A. bovis (Kh-Hc215)
-Anaplasma sp. clone 499 (JN588562)
~A. phagocytophilum (AF172163)
100
36
-Ehrlichia sp. NS104 (AB454078)
70
-A. marginale (AF165812)
-Ehrlichia sp. NS108 (AB454079)
A. platys (AY044161)
0,05
Рис. 2. Дендрограмма сходства нуклеотидных последовательностей (длина 1188 п. о.)
фрагмента groEL гена Anaplasmataceae, построенная с использованием метода NJ. Шкала представляет 5% дивергенции. Жирным шрифтом выделены последовательности образцов A. bovis от H. concinna (Am-Hc60, Am-Hc215) и от полевок (Am-vole57), а также новых генетических вариантов эрлихий (Ehrlichia sp. Kh-Hj27 и Ehrlichia spp. Am-Hc79).
лее схожих с Ehrlichia sp. Kh-Hj27 и Ehrlichia spp. Ат-Нс79 по гену 16S рРНК, последовательности groESL оперона не были определены. Проведенный филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей groESL оперона эрлихий показывает, что выявленные в настоящей работе генетические варианты эрлихий вместе с E. ewingii и с генетическими вариантами, обнаруженными у клещей в образцах от H. longicornis в Японии, образуют с высоким уровнем поддержки (100%) отдельный кластер на ден-дрограмме (см. рис. 2).
Таким образом, выявленные у клещей H. japonica и H. concinna новые генетические варианты эрли-хий кластеризуются как по гену 16S рРНК, так и по groESL оперону вместе с эрлихиями, обнаруженными у клещей того же рода - Haemaphysalis spp.
Молекулярно-генетический анализ бактерий Anaplasma spp. В крови 4 клещей четырех H. con-cinna, собранных на территории Амурской области и Хабаровского края, была обнаружена ДНК бактерий, относящихся к роду Anaplasma. Определенные нуклеотидные последовательности гена 16S рРНК во всех четырех образцах (типичный образец Ат-Нс60) были идентичны друг другу и нуклеотидным после-
довательностям, определенным нами ранее в образцах селезенки и печени от красно-серой полевки и бурундука, отловленных на территории Амурской обл. и в окрестностях r. Хэйхэ на севере Китая (GenBank JX092096 и JX092098). Эти последовательности были наиболее схожи (уровень гомологии 99,5%) с последовательностями гена 16S рРНК A. bovis, выявленными у собак и енотов на территории Японии (GenBank HM131218, GU937020 и др.) [20]. Уровень сходства с другими известными последовательностями A. bovis варьировал от 98,1 до 99,5%. Следует отметить, что анализ нуклео-тидных последовательностей гена 16S рРНК показывает высокую вариабельность изолятов A. bovis из различных источников по указанному локусу; уровень сходства между доступными в базе данных GenBank последовательностями A. bovis составлял 98,4-100%. Проведенный филогенетический анализ показывает, что выявленные в H. concinna и в грызунах анаплазмы вместе с известными последовательностями A. bovis с высоким уровнем поддержки (100%) образуют отдельный кластер на ден-дрограмме (см. рис. 1). Таким образом, обнаруженные на территории Дальнего Востока анаплазмы могут рассматриваться как новый генетический вариант A. bovis.
В двух образцах A. bovis от H. concinna (Ат-Нс60 и К^Нс215) были определены нуклеотидные последовательности groESL оперона длиной 1249 п. о. Эти последовательности различались одной синонимичной ну-клеотидной заменой. Последовательность groESL оперона образца Ат-Нс60 была идентична последовательностям groESL оперона A. bovis у полевки и бурундука (GenBank JX092097 и JX092099). Следует отметить, что до настоящего времени в базе данных GenBank не зарегистрировано последовательностей groESL оперона A. bovis из других источников. Анализ полученных нуклеотидных последовательностей показал, что последовательности groESL оперона образцов Ат-Нс60, К^Нс215 и образцов A. bovis от полевки и бурундука демонстрируют высокий уровень гомологии (96,5%) с последовательностью groESL оперона Anaplasma spp. clone 499 (GenBank JN588562), выявленной в крови енота в Японии, образуя с высоким уровнем поддержки отдельный кластер на дендрограмме (см. рис. 2); степень сходства с другими последовательностями groESL оперона составляла менее 79%.
A. bovis известны как патогены крупного рогатого скота и буйволов в Азии и Африке. Их специфичными переносчиками являются клещи Amblyomma
541-
□9 I-
Е. muris (AB196302)
100
96
49 1
Е chaffeensis (U60476) - Е ewingii (U96436) —Е canis (М73221)
100
100
-Е ruminantium (Х62432) — Candidatus N. lotoris (EF633744)
Candidates N. mikurensis (EU810405) Candidatus N. mikurensis (AB084582) A. platys (AF303467)
A. phagocytophilum (M73224)
A. bovis (FJ169957) I— A. marginale (AF414872) A. centrale (EF520689)
90
92
98
96
-A. ovis (AY262I24)
-Kh-Ds195 (D. silvarum, Хабаровск)
Nov-lp19 (Ixodes sp., Новосибирск) — Kh-Ds37 (D. silvarum, Хабаровск)
-Kh-Hc122 (H. concinna, Хабаровск)
-Anaplasmataceae bacterium IS 136 (AB190771)
-Wolbachia pipiensis (AF179630)
-Rickettsia rickettsii (U11021)
0,02
Рис. 3. Дендрограмма сходства нуклеотидных последовательностей (длиной 1188 п. о.) фрагмента гена 16S рРНК бактерий Anaplasmataceae, построенная с использованием
метода NJ.
Шкала представляет 2% дивергенции. Жирным шрифтом выделены последовательности образцов, выявленные у Ixodes sp. (Nov-Ip19), D. silvarum (Kh-Ds37, Kh-Ds195) и H. concinna (Kh-Hc122). В качестве внешней последовательности использована последовательность Rickettsia rickettsii.
variegatum и Rhipicephalus appendiculatus на территории Африки и Hyalomma spp. в Иране [5]. С развитием молекулярных методов ДНК, однако, A. bovis была обнаружена у различных видов млекопитающих в странах Азии и США - у оленей, водяных оленей, енотов и кроликов [7, 10, 12, 20], а также у клещей H. longicornis в Корее и Японии [12, 13] и H. lagrangei в Таиланде [16]. В России ДНК A. bovis была обнаружена у 2 из 15 клещей H. concinna на территории Приморского края [4]. Таким образом, полученные результаты подтверждают данные других исследователей о роли клещей Haemaphysalis spp. в качестве переносчиков A. bovis.
Генетическая вариабельность A. bovis в отличие от других видов анаплазм, изучена мало; остается открытым вопрос о связи генетических вариантов A. bo-vis с различными переносчиками и хозяевами.
Молекулярно-генетический анализ нетипичных бактерий семейства Anaplasmataceae. В 3 положительных образцах от H. concinna и в 9 образцах от D. silvarum была обнаружена ДНК бактерий из семейства Anaplasmataceae, которые на основании анализа нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК не могут быть отнесены ни к одному из родов указанного семейства.
Нетипичные бактерии семейства Anaplasmataceae были нами также ранее обнаружены у 3 клещей рода Ixodes - у 2 из 1688 клещеей Ixodes spp. на территории Новосибирской обл. и у 1 из 730 клещей Ixodes persul-catus на территории Хабаровского края.
Ни для одного из этих 15 образцов не удалось амплифици-ровать фрагмент groESL оперо-на. Только для 2 образцов из D. silvarum (Kh-Ds37, Kh-Ds195), для 1 образца от H. concinna (Kh-Hc122) и для 1 образца от клеща I. persulcatus / I. pavlovskyi из Новосибирской области (Nov-Ip19) удалось определить последовательность гена 16S рРНК длиной 1270-1301 п.о.; для остальных образцов были определены ну-клеотидные последовательности длиной только 456-553 п.о.
Анализ нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК образцов Kh-Ds37, Kh-Ds195, Kh-Hc122 и Nov-Ip19 показал, что эти последовательности наиболее схожи (уровень гомологии 92,4-96,4%) с соответствующей последовательностью бактерий из семейства Anaplasmataceae IS136 (GenBank AB190771) из Японии, а уровень гомологии с другими известными последовательностями гена 16S рРНК бактерий из семейства Anaplasmataceae не превышал 92%. Сравнение нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК длиной 1188 п.о. показало, что образцы Kh-Ds37, Kh-Ds195, Kh-Hc122, Nov-Ip19 вместе с Anaplasmataceae bacterium IS136 образуют отдельный кластер на дендрограмме с индексом поддержки 92 (рис. 3). Следует, однако, отметить, что последовательности гена 16S рРНК внутри этого кластера существенно различаются, а уровень сходства между ними варьирует от 92,4 до 100%. Внутри кластеров, образованных бактериями Ehrlichia spp., Anaplasma spp. и "Candidatus Neoehrlichia" spp., уровень сходства между ну-клеотидными последовательностями гена 16S рРНК существенно выше и составляет 96,1-100%.
Проведенный анализ нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК длиной 469 п. о. от всех выявленных нетипичных бактерий показал, что эти образцы принадлежат к семейству Anaplasmata-ceae, но не могут быть отнесены к родам Ehrlichia spp., Anaplasma spp. или к кластеру "Candidatus Neoehrlichia" spp. Всего в 15 образцах было выявлено 12 различных вариантов нуклеотидных последовательностей, которые образуют гетерогенную группу и не формируют отдельный кластер (рис. 4). Уровень гомологии между различными последовательностями из этой группы варьировал от 92,9 до 100%; при этом 4 последовательности в образцах от 6 клещей (Kh-Ds1, Kh-Ds37, Kh-Ds38, Kh-Ds118, Kh-Ds182, Kh-Hc85) различались между собой 2-5 нуклеотидными заменами (98,9-99,6% гомологии) и образовывали с высоким уровнем поддержки отдельную ветвь на дендрограмме (см. рис. 4).
Следует отметить, что нуклеотидные последовательности гена 16S рРНК у ряда образцов из этой груп-
пы содержат инсерции и делеции в консервативной области гена. Так, последовательности гена 16S рРНК у клещей Nov-Ip19 и Nov-Ip194, собранных в Новосибирской обл. в 2007 и 2010 гг., были схожи между собой (уровень гомологии 99,6%) и отличались от всех остальных известных последовательностей гена 16S рРНК семейства Anaplasmataceae уникальной инсерцией длиной 13 п. о. в консервативной области гена, а нуклеотидная последовательность образца Kh-Ds37 имела 2 делеции длиной 14 и 4 п. о. в консервативной области гена.
Таким образом, на территории Амурской обл. и Хабаровского края в крови у клещей Haemaphysalis и Dermacentor обнаружена ДНК бактерий семейства Ana-plasmataceae, относящихся к трем различным филогенетическим группам: у клещей H. japonica и H. concinna обнаружена ДНК двух новых генетических вариантов эр-лихий, филогенетически схожих с эрлихиями, выявленнными в клещах Haemaphysalis spp. в Японии; у клещей H. concinna обнаружена ДНК нового генетического варианта A. bovis; 3) у клещей D. silvarum и H. concinna обнаружена ДНК нетипичных бактерий, не относящихся ни к одному из известных родов семейства Anaplasmataceae.
Работа частично финансировалась из средств междисциплинарного интеграционного проекта № 135 фундаментальных исследований СО РАН.
Автор для переписки:
Рар Вера Александровна, 630090, г. Новосибирск, пр. Лаврентьева 8, Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, e-mail: [email protected]
48 [
60
78
18
69
- A. platys (AF303467)
-A. bovis (FJ169957)
99 '-A. phagocytophilum (М73224)
г A. ovis (AY262124) iocTj—A. marginale (AF414872) 9Л д. centrale (EF520689) — Candidatus N. lotoris (EF633744)
Candidatus N. mikurensis (EU810405) Candidatus N. mikurensis (AB084582)
-E ruminantium (X62432)
|— £ ewingii (U96436)
E muris (AB196302)
¡П_р
75 I-
81 40 46
E chaffeensis (U60476) -E canis (M7322I)
99
£
70
79
93
— Kh-Ds195 (О. silvarum, Хабаровск) Nov-lp19 {Ixodes sp., Новосибирск) Nov-lp194 (Ixodes sp., Новосибирск)
-Kh-Ds57 (D. silvarum, Хабаровск)
-Kh-Ip89 (/. persulcatus, Хабаровск)
_I Kh-Ds98 (D. silvarum, Хабаровск)
100 Kh-Ds97 (□. silvarum, Хабаровск) Kh-Hc122 (H. concinna, Хабаровск) -Anaplasmataceae bacterium IS136 (AB190771)
С
99
-Kh-Hc68 (H. concinna, Хабаровск)
601 Kh-Hc85 (H. concinna, Хабаровск) Kh-Ds1 (D. silvarum, Хабаровск) 90i Kh-Ds37 (D. silvarum, Хабаровск) Kh-Ds38 (D. silvarum, Хабаровск) Kh-Ds182 (D. silvarum, Хабаровск) 67 ' Kh-Ds118 (D. silvarum, Хабаровск)
-Wolbachia pipientis (AF179630)
-Rickettsia rickettsii (U11021)
45
0,02
Рис. 4. Дендрограмма сходства нуклеотидных последовательностей (длина 469 п. о.) фрагмента гена 16S рРНК бактерий Anaplasmataceae, построенная с использованием
метода NJ.
Шкала представляет 2% дивергенции. Жирным шрифтом выделены последовательности образцов, выявленные у Ixodes sp. (Nov-Ip19, Nov-Ip194, Kh-Ip89), H. concinna (Kh-Hc68, Kh-Hc85,
Kh-Hc122) и D. silvarum (Kh-Ds1, Kh-Ds37, Kh-Ds38, Kh-Ds57, Kh-Ds97, Kh-Ds98, Kh-Ds118, Kh-Ds182, Kh-Ds195). В качестве внешней последовательности использована последовательность
Rickettsia rickettsii.
Л И Т Е Р А Т У Р А
1. Нефедова В.В., Коренберг Э.И., Ковалевский Ю.В. и др. Вестник РАМН. 2008. 7: 47-50.
2. Рар В.А., Епихина Т.И., Ливанова Н.Н. и др.Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2011; 2: 17-23.
3. Семенов А.В., Алексеев А.Н., Дубинина Е.В. и др. Медицинская паразитология и паразитарные болезни. 2001; 3: 11-5.
4. Шпынов С.Н., Рудаков Н.В., Ястребов В.К. и др. Медицинская паразитология и паразитарные болезни. 2004; 2: 10-4.
5. Dumler J.S., BarbetA.F., Bekker C.P. et al. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2001; 51: 2145-65.
6. Eremeeva M.E., Oliveira A., Robinson J.B. et al. Ann. N. Y. Acad. Sci. 2006; 1078: 291-8.
7. Goethert H.K., Telford 3rd S.R. J. Clin. Microbiol. 2003; 41: 3744-7.
8. InokumaH, Beppu T, OkudaM. et al. J. Clin. Microbiol. 2004; 42: 1353-5.
9. Jiang B.G., Cao W.C., Niu J.J. et al. Vector Borne Zoonotic Dis. 2011; 11: 325.
10. Kang, J.G., Ko, S., Kim, Y.J. et al. Vector Borne Zoonotic Dis. 2011; 11: 929-38.
11. KawaharaM., Rikihisa Y., IsogaiE. et al. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2004; 54: 837-43.
12. KawaharaM., Rikihisa Y., Isogai E. et al. Appl. Environ. Microbiol. 2006; 72: 1102-9.
13. Kim C.M., Kim M.S., Park M.S. et al. Vector Borne Dis. 2003; 3: 17-26.
14. Liz J.S., AnderesL, Sumner J.W. et al. J. Clin. Microbiol. 2000; 38: 1002-7.
15. MatsumotoK., Takeuchi T., YokoyamaN. et al. J. Vet. Med. Sci. 2011; 73: 1485-8.
16. ParolaP., Cornet J.P., Sanogo Y.O. et al. J. 2003; 41: 1600-8.
17. Rar V.A., Livanova N.N., Panov V.V. et al. Ticks and Tick-borne Diseases. 2010; 1: 57-65.
18. RavynM.D., KorenbergE.I., Oeding J.A. Lancet. 1999; 353: 722-3.
19. Rikihisa Y. Clin. Microbiol. Rev. 1991; 4: 286-308.
20. Sashika M., Abe G., Matsumoto K., Inokuma H. // Vector Borne Zoonotic Dis. 2011; 11: 349-54.
21. ShibataS., KawaharaM., Rikihisa Y. et al. J. Clin. Microbiol. 2000; 38: 1331-8.
22. Sumner J.W., Nicholson W.L., Massung R.F. J. Clin. Microbiol. 1997; 35: 2087-92.
23. Wen B, Jian R., Zhang Y, Chen R. J. 2002; 40: 3286-90.
Поступила 17.09.12
GENETIC VARIABILITY OF ANAPLASMATACEAE BACTERIA DETERMINED IN HAEMAPHYSALIS SPP. AND DERMACENTOR SP. TICKS IN THE TERRITORY OF THE RUSSIAN FAR EAST
VA. Rar1*, T.I. Epikhina1, N.M. Pukhovskaya2, N.P. Vysochina2, L.I. Jvanov2
institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine, SB RAS, Novosibirsk, 2Khabarovsk Antiplague Station, Khabarovsk
Totally 484 Haemaphysalis japonica, 359 Haemaphysalis concin-na and 221 Dermacentor silvarum collected in Amur region and Khabarovsk Territory of the Russian Far East were examined on the presence of Anaplasmataceae bacteria using nested PCR. All positive samples were characterized by analysis of the 16S rRNA gene and/or groESL operone nucleotide sequences. Forty nine H. japonica and three H. concinna were shown to contain DNA of two new Ehrlichia genetic variants. These genetic variants on the basis of the 16S rRNA gene and groESL operone nucleotide sequences analysis were most closely related to Ehrlichia spp. revealed in Haemaphysalis spp. ticks in Japan. Four H. concinna from Amur region were shown to contain DNA of a new Anaplasma bovis genetic variant, which corresponded to A. bovis genetic variant revealed in a red gray-backed vole and a Siberian chipmunk from the Far East. Three H. concinna and nine D. silvarum contained DNA of non-typical bacteria which can't be attributed to any Anaplasma-taceae genera based on the determined sequences of the 16S rRNA gene fragments. The revealed non-typical bacteria on the basis of 16S rRNA gene sequences significantly differed from each other and didn't form a separate genetic group.
K e y w o r d s : Anaplasmataceae family, Ehrlichia, Anaplasma bovis, Ixodid ticks, genetic variants
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2013
УДК 616.24=004-055.6/.7=06:616.9=022]=078
О.Л. Воронина1, М.Ю. Чернуха1, И.А. Шагинян1, М.С. Кунда1, Л.Р. Аветисян1, А.А. Орлова1, В.Г. Лунин1, Л.В. Авакян2, Н.И. Капранов3, Е.Л. Амелина 4, А.Г. Чучалин 4, А.Л. Гинцбург 1
ХАРАКТЕРИСТИКА ГЕНОТИпОВ ШТАММОВ BURKHOLDERIA CEPACIA complex, ВЫДЕЛЕННЫХ ОТ БОЛьНЫХ В СТАЦИОНАРАХ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
1ФГБУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи Минздравсоцразвития России, Москва; 2ФГБУ РДКБ Минздравсоцразвития России, Москва; 3Медико-генетический научный центр РАМН, Москва; 4НИИ пульмонологии ФМБА России, Москва
88 культур микроорганизмов, отнесенных при первоначальной идентификации к Burkholderia cepacia complex (Bcc), проанализировано с помощью мультилокусного секвенирования (Multilocus Sequence Typing, MLST). Выявлено 13 генотипов (sequence type, ST), из них 9 (708, 709, 710, 711, 712, 714, 727, 728, 729) идентифицировано впервые. Обнаружено и зарегистрировано 2 новых аллеля для гена trpB (357, 358), по одному для генов atpD (306) и gltB (352). Установлено, что штаммы 2 генотипов (711, 712) относятся к виду B. multivorans, 1 (ST102) - B. contaminans, 1 (ST51) - B. stabilis, 1 (ST729) - B. vietnamiensis. Большинство штаммов выборки, представляющих 8 генотипов (208, 241, 728, 727, 708, 709, 710, 714), относятся к виду B. cenocepacia. Выявленные генотипы отличаются по глобальности распространения в мире: 4 генотипа (51, 102, 208, 241) имеют межконтинентальное распространение, 1 (712) - внутриконтинентальное. Показано, что штаммы, вызывающие внутрибольничные инфекции, в большинстве случаев относятся к генотипам 728 и 708. Эпидемически значимым в отношении больных муковисцидозом следует признать генотип 709, выявленный у штаммов, изолированных от больных в 7 федеральных округах (ФО) РФ. У больных Дальневосточного ФО выделены штаммы Bcc генотипов 241 (B. cenocepacia) и 729 (B. vietnamiensis), не характерных для других ФО РФ. Показана возможность инфицирования больного муковисцидозом штаммами двух генотипов 709 и 708, т.е. эпидемически значимым и вну-трибольничным. Продемонстрирована длительная персистенция штамма одного генотипа в организме больных муковисцидозом, как для Bcc вида B. cenocepacia (ST 709), так и вида B. multivorans (ST712). Прослежена возможность передачи штамма Bcc, характерного для внутрибольничной среды, больному муковисцидозом при оперативном вмешательстве.
Ключевые слова: муковисцидоз, Burkholderia cepacia complex, MLST
Муковисцидоз - кистозный фиброз (CF, cystic fibrosis), генетическое заболевание, описанное в 1938 г. [8], но упоминавшееся еще в древнем германском
эпосе. Многие события в истории и медицине, связанные с этим заболеванием, носят определение «первый». Первая древнейшая мутация в геноме человека, возникшая 11 000 - 52 000 лет назад, - мутация, которая обусловливает муковисцидоз (DF508 в гене cftr) [33]. Одно из первых применений антибиотика для лечения сопутствующей инфекции Staphylococcus aureus в 1943 г. - использование пенициллина, выделенного из партии, направлявшейся в американскую армию, для терапии детей с кистоз-ным фиброзом [13]. Первый опыт генозамещающей терапии посредством доставки кДНК гена cftr с помощью аденовирусных векторов или липосом был также связан с лечением муковисцидоза [12, 15]. Первый фонд, созданный на общественных началах для поддержки больных, - CF Foundation, образованный в США в 1955 г. В 1964 г. формируется аналогичный фонд в Великобритании - UK Cystic Fibrosis Research Trust. В 1960 г. начала работу Европейская рабочая группа по муковисцидозу - European Working Group on Cystic Fibrosis, в настоящее время именуемая European Cystic Fibrosis Society [47], а в 1965 г. создана международная ассоциация International Cystic Fibrosis (Mucoviscidosis) Association, переименованная в дальнейшем в CF Worldwide [46]. В России Всероссийская ассоциация для больных му-ковисцидозом (Общероссийская общественная организация) создана в 2010 г. [5]. Деятельность фондов позволила проводить исследовательскую работу, организовывать специализированные стационары, фо-
