CC BY
54
УДК 579.881.31
В.А. Pap1. Н.М. Пуховская2. Н.П. Высочина2, З.У. Зайнулина2. Л.Ф. Гуляко2. Л.И. Иванов2
РАСПРОСТРАНЕНИЕ И ГЕНЕТИЧЕСКОЕ РАЗНООБРАЗИЕ ЭРЛИХИЙ И АНАПЛАЗМ В ТАЕЖНЫХ КЛЕЩАХ И МЕЛКИХ МЛЕКОПИТАЮЩИХ НА ТЕРРИТОРИИ ХАБАРОВСКОГО КРАЯ
1Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН (Новосибирск) 2Хабаровская противочумная станция Роспотребнадзора (Хабаровск)
134 имаго таежных клещей Ixodes persulcatus, собранных в мае 2007 г. и 461 мелких млекопитающих, отловленных с феврвля по ноябрь 2007 г. в Хабаровском, крае, были исследованы на наличие эрлихий и анаплазм с помощью двухраундовой ПЦР с использованием, праймеров из области гена 16S рРНК и последующего секвенирования. Было показано, что 3,7 % клещей инфицировано Anaplasma phagocytophilum и. 5,9 % — Ehrlichia muris (включая, случаи, смешанной инфекции). ДНК A. phagocytophilum. была обнаружена в 1 (0,9 %) из 114 образцов селезенки/печени мелких млекопитающих, отловленных на свободном от. таежных клещей луговом участке. Напротив, 78 (22,5 %) из 347 мелких млекопитающих, отловленных на таежном, участке, были инфицированы, эрлихиями и/или анаплазмами: 22 (6,3 %) — A. phagocytophilum, 29 (8,4 %) — E. muris, 1 (0,3 %) — Candidatus «Neoehrlichia mukurensis», и. 38 (11,0 %)
— новым, генетическим, вариантом, эрлихий, филогенетически, схожих с Ehrlichia sp. EHf669. Инфицированные эрлихиями и анаплазмами мелкие млекопитающие преимущественно были отловлены, в период активности, клещей — с мая. по сентябрь. В образцах от. млекопитающих, отловленных в ноябре и. феврале, была обнаружена ДНК только нового генетического варианта эрлихий.
Ключевые слова: анаплазмы, эрлихии, таежные клещи
EXTENSION AND GENETIC DIVERSITY OF EHRLICHIA AND ANAPLASMA SPECIES IN IXODES PERSULCATUS TICKS AND SMALL MAMMALS AT KHABAROVSK REGION TERRITORY
V.A. Rar1. N.M. Pukhovskaya2. N.P. Vysochina2. Z.U. Zaynulina2, L.F. Gulyako2. L.I. Ivanov2
1Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine, Novosibirsk
2KhabarovskAntiplague Station, Khabarovsk
A total 134 adult Ixodes persulcatus ticks collected, in May 2007 and 461 small mammals captured, from February till November at Khabarovsk Region territory were examined, to a presence of Ehrlichia sp. and Anaplasma sp. by nested PCR based, on 16S rRNA gene with subsequent sequencing. It was shown that 3,7 % of I. persulcatus were infected, by Anaplasma phagocytophilum. and. 5,9 % — by Ehrlichia muris (including dual infections). One (0,9 %) of 114 spleen/liver samples from small mammals captured, in free from
I. persulcatus meadow area contained A. phagocytophilum. DNA. In contrast, 78 (22,5 %) from 347 small mammals captured, in wooded area with. high. I. persulcatus prevalence were infected, by Ehrlichia/Anaplasma: 22 (6,3 %) — by A. phagocytophilum, 29 (8,4 %) — by E. muris, 1 (0,3 %) — by Candidatus «Neoehrlichia mukurensis», and. 38 (11,0 %) — by a novel Ehrlichia species close related, to Ehrlichia sp. EHf669. Infected, small mammals have been revealed, presumably in the period, of tick activity — from May to September. Small mammals captured, in February and. November were infected, by a novel Ehrlichia sp. only.
Key words: anaplasma, ehrlichia, ixodes persulcatus ticks
ВВЕДЕНИЕ
Эрлихиозы и анаплазмозы — трасмиссивные природно-очаговые инфекции, вызываемые внутриклеточными грамотрицательными бактериями семейства Апар^ш&асеае. Жизненный цикл эрлихий и анаплазм включает стадии размножения как в служащих специфичными переносчиками иксодовых клещах, так и в являющихся резервуар-ными хозяевами позвоночных животных. В настоящее время известно 5 видов эрлихий и 5 видов анаплазм [12], 3 из них (Апар^ша ркадосу1орЫ1иш, БктПсЫа chаffeensis и БктНсЫа ештдп) являются патогенными для людей [7, 11]. В последние годы с помощью молекулярно-генетических методов новые генетические варианты эрлихий, филогенетически схожих с БкгИсЫа chaffeensis, были выявлены в иксодовых клещах на территории Африки, Тибета, Та-
иланда и Японии [5, 13]. В Японии в грызунах и в клещах Ixodes ovatus были также обнаружены бактерии «Candidatus Neoehrlichia mikurensis», образующие отдельный филогенетический кластер в семействе Anaplasmataceae [9].
Специфичными переносчиками A. phagocytophilum, возбудителя гранулоцитарного анаплазмоза человека (ГАЧ), являются клещи рода Ixodes. Подавляющее число заболеваний ГАЧ регистрируется в США, где до 2004 г. было отмечено 2 871 случаев заболевания [4], в Европе зарегистрировано около 70 случаев инфекции. В России первый случай ГАЧ был выявлен в 2000 г. на Дальнем Востоке [3], серологически подтвержденные случаи заболевания отмечались также на Алтае, в Новосибирской и Пермской областях [2, 6].
Таежный клещ Ixodes persulcatus широко распространен в лесной и лесостепной зоне России — от Балтики до Дальнего Востока. Два вида эрлихий и анаплазм — возбудитель ГАЧ A. phagocytophilum и Ehrlichia muris, моноцитарные эрлихии с неизвестной патогенностью, выявлены с помощью молекулярно-генетических методов в таежных клещах в различных местах их ареала. При этом уровень инфицирования клещей A. phagocytophilum не превышает 4 %, а степень инфицирования клещей E. muris — варьирует от 3 до 13% [1, 2, 8, 10]. Резер-вуарными хозяевами являются различные виды крупных и мелких млекопитающих. Трансовариальная передача A. phagocytophilum в клещах не установлена, поэтому наличие резервуара инфекции играет важную роль в поддержании паразитарной системы [11].
Целью настоящей работы являлось изучение распространения и видового разнообразия эрлихий и анаплазм в таежных клещах и мелких млекопитающих в Хабаровском крае.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Сбор таежных клещей и образцов тканей мелких млекопитающих проводили в 2006 г. в ходе ежемесячных наблюдений на территории 2-х участков. Первый (таежный) участок расположен в 25 км к югу от Хабаровска в хвойно-широколиственном лесу на территории Большехехцирского лесного заповедника, являющегося геоботаническим эталоном южной части Приамурья. В структуре мелких млекопитающих доминировали красно-серая полевка (Clethrionomys rufocanus) — 70 % и восточно-азиатская лесная мышь (Apodemus peninnsulae) — 15 %. Иксодовые клещи были представлены четырьмя видами: Dermacentor silvarum, Haemaphysalis concinna, Haemaphysalis japonica и I. persulcatus с существенным доминированием последнего — 83 %. Для анализа использовали 134 клеща I. persulcatus, собранных на флаг с растительности в период их пиковой численности (май), а также органы (селезенка, печень) 347 мелких млекопитающих, отловленных с февраля по ноябрь. Второй (луговой) участок находится в 15 км к северо-востоку от Хабаровска в типичном для агроценозов Хабаровского Приамурья сельскохозяйственном ландшафте, характеризующемся чередованием мелиорированных полей, лесокустарниковых колок, суходольных лугов и старых залежей. Из грызунов доминировали полевая мышь (Apodemus agrarius) — 50 % и большая полевка (Microtus fortis) — 33 %. Иксодовые клещи, преимущественно H. concinna, на луговом участке встречались очень редко. Для исследования были использованы органы (селезенка, печень) 114 мелких млекопитающих, отловленных на территории участка с мая по сентябрь.
Суммарные нуклеиновые кислоты были экстрагированы из клещей с помощью набора «Проба НК» (ДНК-технология, Москва), а из образцов печени и селезенки — с помощью набора для выделения РНК/ДНК НПО «Литех» (г. Москва).
ДНК эрлихий и анаплазм выявляли с использованием двухраундовой полимеразной цепной реак-
ции (ПЦР) в присутствии родоспецифичных праймеров из области гена 16S рРНК, как описано ранее [14]. Первый раунд ПЦР проводили в присутствии праймеров Ehr1 (5'-gaacgaacgctggcggcaagc-3') и Ehr2 (5'-agta(t/c)cg(a/g)accagatagccgc-3') (температура отжига 57 °С), а 2 раунд — в присутствии праймеров Ehr3 (5'-tgcataggaatctacctagtag-3') и Ehr4 (5'-ctaggaattccgctatcctct-3') (температура отжига 59 °С). Длина ПЦР-продукта составляла 524 н.п. Видовую принадлежность определяли посредством проведения 2-го раунда ПЦР в присутствии видоспецифичных праймеров: HGE1 (5'-cggattattctttatagcttgc-3') и HGE2 (5'-cttaccgaaccgcctacatg-3') для детекции A. phagocytophilum, Em1 (5'-cgaacggatagctacccatagc-3') и Em2 (5'-cgctccaaagttaagctttggt-3') для детекции E. muris, а также Ekh1 (5'-cagatgcttctagctatttatagc-3') и Ekh2 (5'-agctccaaagttaagctctggt-3') для выявления эрлихий нового генетического варианта Ehrlichia sp. Khabarovsk 437 (температура отжига 55 °С). Нуклеотидные последовательности продуктов ПЦР, очищенных с использованием GFX колонок (Amersham Biosciences, США), были определены в Центре сек-венирования ДНК СО РАН, г. Новосибирск. Сравнение нуклеотидных последовательностей с ранее опубликованными проведено с использованием программы BLASTN (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ BLAST), анализ полученных последовательностей проведен методом CLUSTALW (http:// www.ebi.ac.uk/clustalw/index.html).
Нуклеотидная последовательность фрагмента гена 16S рРНК Ehrlichia sp. Khabarovsk 437, выявленная в образцах печени и селезенки красно-серой полевки, зарегистрирована в базе данных GenBank под номером EF445398.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Образцы ДНК от таежных клещей и от образцов печени и селезенки мелких млекопитающих были исследованы на наличие эрлихий и анаплазм методом двухраундовой ПЦР в присутствии родоспецифичных праймеров из области гена 16S рРНК. Положительные образцы были проанализированы на наличие ДНК A. phagocytophilum и E. muris при проведении 2-го раунда ПЦР с праймерами, специфичными к данным возбудителям. Было показано, что 12 из 134 клещей инфицированы эрлихиями/анаплазмами: 4 клеща — A. phagocytophilum, 7 — E. muris, а 1 — двумя патогенами одновременно (табл. 1).
Среди отловленных на свободном от таежных клещей луговом участке 114 мелких млекопитающих только одна красно-серая полевка была инфицирована A. phagocytophilum, в то время как 78 из 347 мелких млекопитающих, отловленных на таежном участке, были инфицированы эрлихиями и/или анаплазмами. В 16 образцах была обнаружена ДНК A. phagocytophilum, в 33 — ДНК E. muris, в 6 — ДНК обоих возбудителей, а в 33 образцах не удалось выявить ДНК ни A. phagocytophilum, ни E. muris. Для 14 из 33 образцов были определены нуклеотидные последовательности длиной 473 н.п.; все они оказались идентичны друг другу, но отличались от имеющихся в базе данных GenBank последовательностей. Оп-
Таблица 1
Выявление эрлихий и анаплазм в природных образцах методом двухраундовой ПЦР
Время отлова Всего образцов Положительные образцы* Число (%) особей, инфицированных
A.phagocytophilum E. muris A novel Ehrlichia sp. Khabarosk Candidatus «Neoehrlichia mikurensis»
I. persulcatus, таежный участок
май 134 12 (9,0 %) 5 (3,7 %) B (5,9 %)
Мелкие млекопитающие, таежный участок
14 февраля 1B 1 (5,6 %) 1
21 марта 3 0
27 апреля 29 2 (6,9 %) 1 1
25 мая 34 12 (35,3 %) 4 9 1
29 июня 3B 12 (31,6 %) 10 3 2
13 июля 47 B (17,0 %) 3 5
18 августа 40 11 (27,5 %) 1 7 4
7 сентября 63 26 (41,2 %) 6 6 20
18 октября 50 4 (B,0 %) 1 2 1
21 ноября 25 2 (B,0 %) 2
всего 347 7B (22,5 %) 22 (6,3 %) 29 (B,4 %) 3B (11,0 %) 1 (0,3 %)
Мелкие млекопитающие, луговой участок
Май-сентябрь 114 1 (0,9 %) 1 (0,9 %)
Примечание: * - включая случаи смешанной инфекции.
ределенные для 2 образцов более длинные последовательности длиной 653 н.п. также были идентичны друг другу и наиболее схожи с фрагментом рибосо-мального гена EhrIichia sp. EHf669 (96,9 % гомологии), обнаруженного в Японии в клещах HaemaphysaIis sp. Следует отметить, что определенные нуклеотидные последовательности отличаются от известных последовательностей эрлихий и анаплазм инсерцией одного нуклеотида (T) в консервативной области гена. С помощью филогенетического анализа было показано, что новый генетический вариант эрлихий относится к кластеру, объединяющему большинство видов и генетических вариантов эрлихий. Нуклеотидная последовательность фрагмента гена 16S рРНК нового генетического варианта эрлихий, названного EhrIichia sp. Khabarovsk 437, доступна в базе данных GenBank под номером EF445398. Проведение ПЦР в присутствии праймеров, специфичных к EhrIichia sp. Khabarovsk 437, показало, что 38 из 347 мелких млекопитающих инфицированы новым генетическим вариантом эрлихий, включая 6 случаев смешанной инфекции (табл. 1). При этом наблюдались все возможные варианты смешанной инфекции, включая один случай одновременного инфицирования красно-серой полевки двумя видами эрлихий и одним видом анаплазм.
Кроме того, в 1 образце от красно-серой полевки была определена нуклеотидная последовательность длиной 473 н.п., идентичная фрагменту гена 16S рРНК Candidatus «Neoehrlichia mikurensis» (GenBank AB196305). Ранее ДНК Candidatus
«Neoehrlichia mikurensis» была нами обнаружена в таежном клеще в Иркутской области и в образце крови и селезенки восточноевропейской полевки (Microtusrossiaemeridionalis) в Новосибирской области. Относящиеся к тому же филогенетическому кластеру бактерии, называемые ранее Ehrilichia-like «Scotti variant», были также обнаружены в I. persulcatus в Омской области [2].
Преобладающим видом грызунов в исследуемом лесном биотопе являются красно-серые полевки, они наиболее часто инфицированы эрлихиями и анаплазмами (24,5 % инфицированных особей) и, вероятно, играют основную роль в качестве природного резервуара инфекции. Численности других видов мелких млекопитающих существенно ниже. Три из 36 исследованных особей восточно-азиатской лесной мыши были инфицированы E. muris, 1 из 11 обыкновенных бурозубок (Sorex araneus) была инфицирована Ehrlichia sp. Khabarovsk 437, и 1 из 2 бурундуков (Tamias sibiricus) был инфицирован ДНК A. phagocytophilum.
Прокармливающиеся на мелких млекопитающих личинки и нимфы иксодовых клещей активны в период с апреля по сентябрь. Резкое увеличение числа инфицированных особей наблюдалось в период наибольшей активности клещей в мае; доля инфицированных мелких млекопитающих оставалась высока (17 — 41 %) в течение всего периода клещевой активности (табл. 1). Следует отметить, что в образцах от млекопитающих, отловленных вне периода активности иксодовых
клещей (ноябрь, февраль) была обнаружена ДНК только нового генетического варианта эрлихий.
Таким образом, на территории Хабаровского края и в таежных клещах, и в мелких млекопитающих были обнаружены ДНК A. phagocytophiIum и E. muris. Кроме того, значительная часть грызунов инфицирована новым генетическим вариантом эрлихий EhrIichia sp. Khabarovsk 437, а 1 полевка — Candidatus «Neoehrlichia mikurensis». Специфичный переносчик для EhrIichia sp. Khabarovsk 437 не установлен.
ЛИТЕРАТУРА
1. Изучение генетического разнообразия анаплазм и эрлихий в паразитарных системах юга Западной Сибири и Урала / В.А. Рар, Н.Н. Ливанова, В.В. Панов, В.Б. Астанин и др. // Бюл. сиб. мед. — 2006. — Приложение № 1. — С. 116 — 120.
2. Новые данные о выявлении эрлихий и ана-плазм в иксодовых клещах в России и Казахстане / С.Н. Шпынов, Н.В. Рудаков, В.К. Ястребов, Г.Н. Леонова и др. // Мед. паразитол. — 2004. — № 2. — С. 10-14.
3. Первый случай гранулоцитарного эрлихи-оза на Дальнем Востоке Российской Федерации / Ю.Н. Сидельников, О.Ю. Медянников, Л.И. Иванов, Н.И. Здановская // Клин. мед. — 2003. — № 81.
- С. 67 — 68.
4. Bakken J.S. Clinical diagnosis and treatment of human granulocytotropic anaplasmosis / J.S. Bakken, J.S. Dumler // Ann. N.Y. Acad. Sci. — 2006. — N 1078.
— P. 236 — 247.
5. Detection of ehrlichial DNA in HaemaphysaIis ticks recovered from dogs in Japan that is closely related to a novel EhrIichia sp. found in cattle ticks from Tibet, Thailand and Africa / H. Inokuma, T. Beppu, M. Okuda, Y. Shimada et al. // J. CIin. MicrobioI. — 2004. — N42. — P. 1353 — 1355.
6. Human granulocytic anaplasmosis: risk in the Cisural region, Russia / M.V. Afanasieva, N.N. Vorobyeva, E.I. Korenberg, V.I. Frizen // Int. J. Med. Microbiol. — 2006. — N 296, Suppl. 1. — P. 167— 168.
7. Identification of a granulocytotropic Ehrlichia species as the etiologic agent of human disease /
S.M. Chen, J.S. Dumler, J.S. Bakken, D.H. Walker // J. Clin. Microbiol. - 1994. - № 32. - P. 589-595.
8. Identification of Ehrlichia spp. and Borrelia burgdorferi in Ixodes ticks in the Baltic regions of Russia / A.N. Alekseev, H.V. Dubinina, I. Van De Pol, L.M. Schouls // J. Clin. Microbiol. - 2001. - N39.
- P. 2237-2342.
9. Kawahara M. Ultrastructure and phylogenetic analysis of ‘Candidatus Neoehrlichia mikurensis' in the family Anaplasmataceae, isolated from wild rats and found in Ixodes ovatus ticks / M. Kawahara, Y. Rikihisa, E. Isogai, M. Takahashi et al. // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. - 2004. - №54. - P. 18371843.
10. Monocytic Ehrlichia in Ixodes persulcatus ticks from Perm, Russia / M.D. Ravyn, E.I. Korenberg, J.A. Oeding, Y.V. Kovalevskii et al. // Lancet. - 1999.
- N27. - P. 722-723.
11. Parola P. Tick- and flea-borne rickettsial emerging zoonoses / P. Parola, B. Davoust, D. Raoult // Vet. Res. - 2005. - N36. - P. 469-492.
12. Reorganization of genera in the families Rickettsiaceae and Anaplasmataceae in the order Rickettsiales: unification of some species of Ehrlichia with Anaplasma, Cowdria with Ehrlichia and Ehrlichia with Neorickettsia, descriptions of six new species combinations and designation of Ehrlichia equi and ‘HGE agent' as subjective synonyms of Ehrlichia phagocytophilum / J.S. Dumler, A.F. Barbet,
C.P. Bekker, G.A. Dasch et al. // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. - 2001. - N51. - P. 2145-2165.
13. Simultaneous detection of Anaplasma marginale and a new Ehrlichia species closely related to Ehrlichia chaffeensis by sequence analyses of 16S ribosomal DNA in Boophilusmicroplus ticks from Tibet / B. Wen, R. Jian, Y. Zhang, R. Chen // J. Clin. Microbiol. - 2002. - N 40.
- P. 3286-3290.
14. Tickborne pathogen detection, Western Siberia, Russia / V.A. Rar, N.V. Fomenko, A.K. Dobrotvorsky, N.N. Livanova et al. // Emerg. Infect. Dis. - 2005. -N11. - P. 1708-1715.
