CC BY
31
Бюллетень Оренбургского научного центра УрО РАН (электронный журнал), 2018, № 3 © Коллектив авторов, 2018 574.586:577.29
Е.С. Клименко1,2, С.И. Беликов2, Л.И. Черногор2, Р.В. Аделъшин3, Н.Л. Белъкова2
ПОИСК ГЕНЕТИЧЕСКИХ МАРКЕРОВ ДЛЯ ХАРАКТЕРИСТИКИ ФОТОТРОФНЫХ СИМБИОНТОВ БАЙКАЛЬСКИХ ЭНДЕМИЧНЫХ ГУБОК
1 Иркутский государственный университет, Иркутск, Россия
2 Лимнологический институт СО РАН, Иркутск, Россия
3 Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Сибири и Дальнего Востока Роспотребнадзора, Иркутск, Россия
Цель. Оценка специфичности праймеров для селективной детекции некоторых фотосинтезирующих симбионтов пресноводных губок.
Материалы и методы. Детекцию фрагметов рибосомного оперона производили в природных образцах и клеточной культуре Lubomirskia baicalensis методом ПЦР, с последующим клонированием и секвенированием ампликонов.
Результаты. Положительные ампликоны получены только на праймерах, фланкирующих ITS1. Последовательности из клеточной культуры идентифицированы как Pseudomuriella sp. и Choricystis sp. Фрагмент ITS1 детектируется во всех образцах и имеет разную длину. Последовательности, полученные на праймерах для цианобактерий, идентифицируются как хлоропласт Choricystis sp.
Заключение. Для группы Chlorophyta протестированы праймеры и получены последовательности фрагмента ITS 1. Цианобактериальные праймеры CYA106L/CYA781R позволяют ампплифицировать ген 16S рРНК хлоропласта эукариотических микросимбионтов.
Ключевые слова: губка, симбиоз, зеленые водоросли, цианобактерии, ITS.
E.S. Klimenko1,2, S.I. Belikov2, L.I. Chernogor2, R.V. Adelshin3, N.L. Belkova2
SEARCH FOR GENETIC MARKERS CHARACTERIZING PHOTOTROPHIC SYM-BIONTS OF BAIKALIAN ENDEMIC SPONGES
1 Irkutsk State University, Irkutsk, Russia
2 Limnological Institute SB RAS, Irkutsk, Russia
3 Irkutsk Antiplague Research Institute of Siberia and Far East, Irkutsk, Russia
Objective. Evaluation of the specificity of PCR primers for selective detection of certain photosynthetic symbionts of freshwater sponges.
Materials and methods. Detection of fragments of the ribosomal operon was performed in environmental samples and cell culture of the Lubomirskia baicalensis by PCR, followed by cloning and amplicon sequencing.
Results. Positive amplicons were obtained only on primers specific for ITS1. Sequences derived from the cell culture have been identified as Pseudomuriella sp. and Choricystis sp. The ITS1 fragment is detected in all samples and has a different length. Sequences obtained on cyanobacterial primers are identified as chloroplast Choricystis sp.
Conclusions. Primers were tested for the Chlorophyta group and sequences of the ITS1 fragment were obtained. Cyanobacterial primers CYA106L/CYA781R allow the amplification of the 16S rRNA gene of the chloroplast of eukaryotic microsymbionts.
Keywords: sponge, symbiosis, green algae, cyanobacterium, ITS.
Введение
Губки (тип Рог^ега) являются многоклеточными примитивными жи-вотными-фильтраторами, которые формируют симбиотические отношения с представителями разных групп организмов. Энергетическая потребность губок реализуется за счет симбиотических отношений с фотосинтезирующими организмами, разнообразие которых велико: динофлагелляты, зоохлореллы, красные водоросли, нитчатые зелёные водоросли, а также цианобактерии [1].
Симбиотические зеленые водоросли и цианобактерии помогают губке в процессе питания либо путем внутриклеточного переваривания, либо путем транслокации метаболитов, включая фиксацию азота, нитрификацию и фотосинтез, а также участвуют в химической защитной системе хозяина [2-5].
Для идентификации зеленых водорослей и определения их филогенетических взаимоотношений используют целый ряд молекулярных маркеров, включая ядерные гены рибосомальных РНК, гены большой субъединицы рибу-лозо-бифосфат карбоксилазы (гЬеЬ) и элонгационного фактора Ш (Ш/Л) хлоро-пластов. Каждый из маркеров имеет свои недостатки: гены 18S и 23 S рРНК не обладают достаточной вариабельностью для разделения близкородственных видов, для гЬеЬ отсутсвуют универсальные праймеры для всех CЫoшphyta, а ген Ш/Л только недавно был предложен для исследования пресноводных СЫо-rophyta и поэтому база последовательностей ограничена [6-11].
Так же для идентификации зеленых водорослей используются фрагменты межгенных спейсеров ITS1 и ITS2. В основном, практикуется идентификация с помощью Г^2-маркера. Однако, показано, что является лучшим маркером, чем ITS2, из-за меньшей доли содержания ОС-пар, меньшего количества инделей и меньшей вариабельности длины фрагмента [12, 13].
Целью работы стала проверка специфичности праймеров, позволяющих амплифицировать фрагменты рибосомного оперона различных групп фотосинтезирующих симбионтов байкальских эндемичных губок.
Материалы и методы
В работе тестированы праймеры, позволяющие амплифицировать фрагменты рибосомного оперона фотосинтезирующих симбиотических микроводорослей CЫoшphyta и цианобактерий (табл. 1). Схема расположения праймеров представлена на рисунке 1. Генетическое разнообразие фотосин-тезирующих микроорганизмов определяли в образцах одного из наиболее широко распространенных представителей спонгиофауны озера Байкал -
Бюллетень Оренбургского научного центра УрО РАН (электронный журнал), 2018, № 3 ветвистой губки L. baiсalensis. В работе использованы природные пробы, отобранные в разные сезоны, а также клеточная культура.
Таблица 1. Структуры праймеров, использованных в работе.
Название Структура 5'-3' Ссылка
Chlorophyta
GR_18S_F1 CGTCGCTCCTACCGATTG Наши данные
GR_5,8_F2 GATGAAGAACGCAGCGAAATG Наши данные
GR_5,8_R1 CAATATGCGTTCAAAGATTCGATG Наши данные
GR_28S_R2 TCTCTAGACAACAATTC Наши данные
Cyanobacteria
CYA106L CGGACGGGTGAGTAACGCGTGA Денисова и др., 1999
CYA781R GACTACWGGGGTATCTAATCCCWTT
Рис. 1. Фрагменты рибосомного оперона и расположение использованных праймеров. А - малая субъединица рибосомной ДНК (16S рДНК) прокариот с указанными вариабельными участками; Б - общая структура рибосомного оперона эукариот.
ДНК природных образцов выделяли с помощью лизирующего буфера из набора ДНК-сорб-В («АмплиСенс», Россия), дальнейшую очистку проводили фенол-хлороформным методом; выделение ДНК из клеточной культуры примморф - набором Quick-DNA Fecal/Soil Kits (Zymo Research, США), по протоколу фирмы-производителя.
Амплификацию фрагментов ДНК проводили с набором Encyclo Plus PCR kit («Евроген», Россия). В реакцию брали 2-3 мкл суммарной ДНК концентрацией от 5 до 15 нг/мкл. Реакцию вели в 1х буфере Encyclo, добавляли 2 мМ дНТФ, по 10 пмоль/мкл каждого праймера (табл. 1) и 0.04 ед.акт. поли-
Бюллетень Оренбургского научного центра УрО РАН (электронный журнал), 2018, № 3 меразы Encyclo («Евроген», Россия). Структуры праймеров, использованных в работе, представлены в таблице 1. Реакцию проводили в автоматическом амплификаторе «Бис» типа А111 («Бис», Россия) в следующем режиме: в первом цикле денатурация при 95°С - 5 мин, 30 циклов: денатурация при 95°С - 30 сек, отжиг праймеров при 58°С - 30 сек, элонгация при 72°С - 60 сек, в последнем цикле время элонгации увеличивали до 10 мин. Ампликоны анализировали в 1,5% агарозном геле (ТА буфер: Трис-ацетат - 40 мМ, H 8,0) при 80V в течение 35 мин. Ампликоны нужной длины вырезали из геля и хранили при -20°С. Целевые ампликоны использовали для лигирования с вектором pJETl/blunt и трансформации по стандартному методу с CaCl2 [14]. Проводили прямой скрининг колоний. Анализ рекомбинантных клонов на наличие вставки нужной длины проводили амплификацией клеточного лиза-та с плазмидными праймерами pJet1.2 F и pJet1.2 R, рекомендованными производителем, в следующем режиме: в первом цикле денатурация при 95°С -5 мин, 30 циклов: денатурация при 95°С - 30 сек, отжиг праймеров при 58°С - 30 сек, элонгация при 72°С - 30 сек, в последнем цикле время элонгации увеличивали до 10 мин. Все положительные ампликоны были отсеквениро-ваны.
Сиквенсную реакцию вели с набором BigDye® Terminator (Applied Biosystems, США) согласно протоколу фирмы-производителя. В реакцию брали 10-20 нг ампликона и 3-5 пмоль праймера. Нуклеотидные последовательности определяли на автоматическом капиллярном секвенаторе ABI3500 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, США). Оценку ожидаемой длины целевых ампликонов производили на основании ПЦР in silico с помощью программы Primer-BLAST. Редактирование нуклеотидных последовательностей производили вручную в соответствии с секвенограммой при помощи программы BioEdit v 7.2.5 [15]. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей фрагментов рибосомного оперона c международной базой данных NCBI проводили с помощью программы BLASTn.
Результаты и обсуждение
В работе протестировано три пары праймеров на группу фотосинтези-рующих микросимбионтов Chlorophyta: праймеры, фланкирующие ITS1 (GR_18S_F1/GR_5,8_R1) и ITS2 (GR_5,8_F2/GR_28S_R2) вариабельные районы, а также фрагмент, включающий обе вариабельные области вместе с 5.8S рДНК (GR_18S_F1/GR_28S_R2). Помимо этого, в образцах клеточной куль-
Бюллетень Оренбургского научного центра УрО РАН (электронный журнал), 2018, № 3 туры был произведен скрининг на цианобактериальных праймерах.
Оценка специфичности праймеров и ожидаемой длины ампликона. Учитывая, что межгенные спейсеры - очень вариабельные районы, была проведена оценка ожидаемой длины целевых ампликонов (табл. 2).
Таблица 2. Оценка ожидаемой длины целевых фрагментов при амплификации на праймерах, специфичных для фотосинтезирующих симбионтов группы CЫoшphyta.
Таксон Ожидаемая длина фрагмента, пн.
F1/R1 F2/R2 F1/R2
Chlorophyceae 440-600 300-650 870-950
Ulvophyceae 450-500 460-500 850-1080
Trebouxiophyceae 450-550 470-550 970-1030
Mamiellophyceae 400-500 520-560 850-950
Chlorodendrophyceae 450-600 480-510 850-1300
Сравнение показало, что длина ампликонов в среднем составляет 400600 пн для F1/R1, 300-650 пн - для F2/R2 и 850-1300 пн - для F1/R2. Так же было показано, что длина ампликона варьирует в пределах 100 пн в зависимости от класса организмов.
Результаты амплификации. Положительные ампликоны были получены только на праймерах F1/R1. Амплифицирующийся фрагмент имел длину около 550 пн (рис. 2).
М н/ю П/Я2 Р1/Я1 Р1/Я2 М
А1-2 АП2-2 ^ 4ВП» «
а ттшт —
Рис. 2. Результаты гель-электрофореза ампликонов, полученных на парах праймеров, специфичных для группы CЫoшphyta: F1/R1 -GR_18S_F1/GR_5,8_R1; F2/R2 - GR_5,8_F2/GR_28S_R2; F1/R2 -GR_18S_F1/GR_28S_R2; М - маркер молекулярного веса.
Бюллетень Оренбургского научного центра УрО РАН (электронный журнал), 2018, № 3 В дальнейшем эти ампликоны были использованы для подтверждения специфичности праймеров: проводили клонирование и идентификацию целевых фрагментов.
Идентификация - подтверждение специфичности праймеров. В результате клонирования получили пять последовательностей. Все последовательности были идентифицированы как Chlorophyta
Сравнительный анализ последовательностей клонов АП2-2 показал максимальную гомологию с родом Pseudomuriella; ближайшим гомологом является Pseudomuriella engadinensis SAG 221-4. Сравнительный анализ последовательностей клонов А1 -2 показал максимальную гомологию с родом Choricystis; ближайшим гомологом является Choricystis minor SAG 251-1.
Скрининг природных образцов. Скрининг на праймерах, фланкирующих ITS1, показал, что искомый фрагмент детектируется во всех пробах и отличается по длине в разных образцах: например, у образца f из серии №3 длина фрагмента составляет приблизительно 700 пн, а у образца клеточной культуры А1 -2 600 пн (рис. 3).
Рис. 3. Результаты электрофоретического анализа в агарозном геле ампликонов, полученных на праймерах GR_18S_F1/ GR_5,8_R1. Стрелками указаны ампликоны, отличающиеся по длине. 1, 2, 3 - серии природных образцов, отобранных в разные сезоны; К - культура примморф.
Цианобактериальные праймеры. Сравнительный анализ последовательностей, полученных на цианобактериальных праймерах, позволил выделить две группы среди ближайших гомологов. В первую группу вошли последовательности хлоропластной 16S рДНК зеленых симбионтов-фотосинтетиков, полученных из изолятов губок и относящихся к родам Lubomirskia и Baikalospongia (Clorophyta symbiont cluster 1,2). Вторая группа включала последовательности клонированной 16S рДНК морских неиденти-фицированных цианобактерий (Балтийское море). Для филогенетического анализа кроме вышеперечисленных последовательностей использовали ре-
ференсные последовательности гена 16S рРНК, полученные для хлоропласта Choricystis parasitica, а также изолированных и охарактеризованных культур цианобактерий, относящихся к таким родам, как Anabaena, Aphanizomenon, Calotrix, Halospirulina, Leptolyngbia, Lyngbia, Nostoc, Oscillatoria, Phormidium, Pseudoanabaena, Rivularia, Schizothrix и Synechococcus (Cyanobacterium cluster).
Последовательности, полученные в настоящей работе, объединяются в единый кластер с неидентифицированными последовательностями морских цианобактерий (рис. 4).
Chlorophyta symbiont cluster 1 -AC8
EF627915 Uncultured cyanobacterium clone balB12 " EF627903 Uncultured cyanobacterium clone balB11 " EF627918 Uncultured cyanobacterium clone balE5 summer03 EF627909 Uncultured cyanobacterium clone balG9 spring03 EF627914 Uncultured cyanobacterium clone balA4 summer03 EF627897 Uncultured cyanobacterium clone balA10 fall03 " EF627921 Uncultured cyanobacterium clone balF8 summer03 EF627898 Uncultured cyanobacterium clone balB12 fall03 _r EF627905 Uncultured cyanobacterium clone balD10 spring03 EF627911 Uncultured cyanobacterium clone balH1 spring03 EF627916 Uncultured cyanobacterium clone balD4 summer03 EF627913 Uncultured cyanobacterium clone balG8 spring04 EF627917 Uncultured cyanobacterium clone balE10 summer03 EF627920 Uncultured cyanobacterium clone balF5 summer03 EF627901 Uncultured cyanobacterium clone balG10 fall03 AC4
AC5
NC 025539 Choricystis parasitica culture-collection SAG:17.98, chloroplast, 16S rRNA gene
GU936925 Chlorophyta symbiont of Lubomirskia sp. isolate R51, chloroplast, 16S rRNA_gene GU936921 Chlorophyta symbiont of Lubomirskia sp. Isolate R37, chloroplast, 16S rRNA_gene EF627908 Uncultured cyanobacterium clone balG8 spring03
4
99 L
Cyanobacterium cluster
100 ^ Chlorophyta symbiont cluster 2
54
100
82
76
97
□ .050
Рис 4. Филогенетическое дерево, построенное методом объединения ближайших соседей для фрагментов гена малой субъединицы рРНК. Последовательности, полученные в данной работе, выделены жирным шрифтом. Красным цветом выделена референсная последовательность гена 16S рРНК хлоропласта C. parasitica SAG 17.98. Масштаб соответствует 2 заменам на каждые 100 п. н.
Первый кластер симбионтов-фотосинтетиков содержит 32 последовательности и примыкает к кластеру с последовательностями, полученными в
Бюллетень Оренбургского научного центра УрО РАН (электронный журнал), 2018, № 3 данной работе, и клонами морских цианобактерий, причем значение будстреп-анализа указывает на то, что различий между этими группами не слишком много.
Второй кластер включает в себя 15 последовательностей и формирует глубокую отдельную ветвь, показывая их существенное отличие от остальных последовательностей. Идентифицированные цианобактерии образуют собственную кладу, причем значение будстреп-анализа в узле ветвления позволяет считать, что данное расхождение достоверно. Последовательность 16S рДНК хлоропласта C. parasitica кластеризуется с двумя последовательностями 16S рДНК хлоропласта хлорофита симбионтов Lubomirskia sp., а также с представителем морских цианобактерий.
Заключение
Фрагмент, амплифицирующийся на праймерах GR_18S_F1/GR_5,8_R1, не слишком длинный и достигает 500-700 пн, что удобно для клонирования и метагеномного секвенирования.
У некоторых родов Chlorophyta разница в длине ампликонов составляет 50-100 пн и визуально детектируется на гель-электрофорезе, что позволяет при ПЦР-скрининге различать их уже на этой стадии.
В пределах амплифицирующегося фрагмента к консервативным областям 18S рРНК и 5,8S рРНК можно подобрать внутренние праймеры, специфичные для конкретного класса, семейства или рода, и использовать этот набор праймеров для multiplexPCR.
Полученные результаты по цианобактериальным праймерам можно объяснить тем, что ген 16S рРНК хлоропластов очень похож на 16S рРНК цианобактерий, так как последние не являются истинными симбионтами губок, а потому в клеточных культурах не присутствуют, либо присутствуют в следовых количествах; при большем количестве хлоропластной ДНК в пробах амплифицироваться будет именно 16S рРНК хлоропластов.
Для группы Chlorophyta протестированы праймеры и получены последовательности фрагмента ITS1. Цианобактериальные праймеры CYA106L/CYA781R позволяют амплифицировать ген 16S рРНК хлоропласта эукариотических микросимбионтов.
(Работа выполнена в рамках государственного задания № 0345-2018-0002 , а также
при финансовой поддержке грантов РФФИ № 16-04-00065; № 18-04-00224)
ЛИТЕРАТУРА
1. Webster N.S., Negri A.P., Munro M.M. Diverse microbial communities inhabit Antarctic sponges. Environ. Microbiol. 2004. 6 (3): 288-300.
2. Rumpho M.E., Pelletreau K.N., Moustafa A. et al. The making of a photosynthetic animal. J. Exp. Biol. 2011. 214: 303-311.
3. Freeman C.J., Thacker R.W., Baker D.M. et al. Quality or quantity: is nutrient transfer driven more by symbiont identity and productivity than by symbiont abundance? ISME J. 2013. 7 (6):1116-25.
4. Freeman C.J., Thacker R.W. Complex interactions between marine sponges and their symbiotic microbial communities. Limnol. Oceanogr. 2011. 56: 1577-1586.
5. Pita L., Rix L., Slaby B.M. et al. The sponge holobiont in a changing ocean: from microbes to ecosystems. Microbiome. 2018. 6 (1): 46.
6. Темралеева А.Д., Минчева Е.В., Щербаков Д.Ю. и др. ДНК-штрихкодирование зеленых водорослей: Обзор. Альгология. 2013. 23 (4): 396-418.
7. Hall J.D., Fucikova K., Lo C. et al. An assessment of proposed DNA barcodes in freshwater green algae. Cryptogamie Algol. 2010. 31 (4): 529-555.
8. Sherwood A.R., Vis M.L., Entwisle T.J. et al. Contrasting intra versus interspecies DNA sequence variation for representatives of the Batrachospermales (Rhodophyta): Insights from a DNA barcoding approach. Phycol. Res. 2008. 56 (4): 269-279.
9. Clarkston B.E., Saunders G.W. A comparison of two DNA barcode markers for species discrimination in the red algal family Kallymeniaceae (Gigartinales, Florideophyceae), with a description of Euthora timburtonii sp. nov. Botany. 2010. 88 (2): 119-131.
10. Buchheim M., Buchheim J., Carlson T. et al. Phylogeny of the Hydrodictyaceae (Chloro-phyceae): inferences from rDNA data. J. Phycology. 2005. 41 (5): 1039-1054.
11. Vieira H.H., Bagatini I.L., Guinart C.M. et al. tufA gene as molecular marker for freshwater Chlorophyceae. Algae. 2016. 31: 155-165.
12. Темралеева А.Д., Минчева Е.В., Букин Ю.С. и др. Современные методы выделения, культивирования и идентификации зеленых водорослей (Chlorophyta). Кострома: Костромской печатный дом, 2014. 215 с.
13. Wang X.C., Liu C., Huang L. et a;l. ITS1: a DNA barcode better than ITS2 in eukaryotes? Molecular Ecology Resources. 2015. 15: 573-586.
14. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular Cloning. A laboratory Manual. Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. V. 1, 2, 3.
15. Hall T.A. BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT. Nucl. Acids. Symp. Ser. 1999. 41: 95-98.
Получена 06.09.2018
(Контактная информация: Клименко Елизавета Станиславовна - магистрант 2
курса БПФ ИГУ, вед. инженер лаборатории аналитической биоорганической химии Лимнологического института СО РАН; адрес: 664033 г. Иркутск, ул. Улан-Баторская, 3. тел.
(3952) 51-18-74; e-mail: klimenko.elizabet@gmail.com)
LITERATURA
1. Webster N.S., Negri A.P., Munro M.M. Diverse microbial communities inhabit Antarctic sponges. Environ. Microbiol. 2004. 6 (3): 288-300.
2. Rumpho M.E., Pelletreau K.N., Moustafa A. et al. The making of a photosynthetic animal. J. Exp. Biol. 2011. 214: 303-311.
3. Freeman C.J., Thacker R.W., Baker D.M. et al. Quality or quantity: is nutrient transfer driven more by symbiont identity and productivity than by symbiont abundance? ISME J. 2013. 7 (6):1116-25.
4. Freeman C.J., Thacker R.W. Complex interactions between marine sponges and their symbiotic microbial communities. Limnol. Oceanogr. 2011. 56: 1577-1586.
5. Pita L., Rix L., Slaby B.M. et al. The sponge holobiont in a changing ocean: from microbes to ecosystems. Microbiome. 2018. 6 (1): 46.
6. Temraleeva A.D., Mincheva E.V., Shcherbakov D.Yu. i dr. DNK-shtrihkodirovanie zelenyh vodoroslej: Obzor. Al'gologiya. 2013. 23 (4): 396-418.
7. Hall J.D., Fucikova K., Lo C. et al. An assessment of proposed DNA barcodes in freshwater green algae. Cryptogamie Algol. 2010. 31 (4): 529-555.
8. Sherwood A.R., Vis M.L., Entwisle T.J. et al. Contrasting intra versus interspecies DNA sequence variation for representatives of the Batrachospermales (Rhodophyta): Insights from a DNA barcoding approach. Phycol. Res. 2008. 56 (4): 269-279.
9. Clarkston B.E., Saunders G.W. A comparison of two DNA barcode markers for species discrimination in the red algal family Kallymeniaceae (Gigartinales, Florideophyceae), with a description of Euthora timburtonii sp. nov. Botany. 2010. 88 (2): 119-131.
10. Buchheim M., Buchheim J., Carlson T. et al. Phylogeny of the Hydrodictyaceae (Chloro-phyceae): inferences from rDNA data. J. Phycology. 2005. 41 (5): 1039-1054.
11. Vieira H.H., Bagatini I.L., Guinart C.M. et al. tufA gene as molecular marker for freshwater Chlorophyceae. Algae. 2016. 31: 155-165.
12. Temraleeva A.D., Mincheva E.V., Bukin Yu.S. i dr. Sovremennye metody vydeleniya, kul'tivirovaniya i identifikacii zelenyh vodoroslej (Chlorophyta). Kostroma: Kostromskoj pechatnyj dom, 2014. 215 s.
13. Wang X.C., Liu C., Huang L. et a;l. ITS1: a DNA barcode better than ITS2 in eukaryotes? Molecular Ecology Resources. 2015. 15: 573-586.
14. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular Cloning. A laboratory Manual. Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. V. 1, 2, 3.
15. Hall T.A. BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT. Nucl. Acids. Symp. Ser. 1999. 41: 95-98.
Образец ссылки на статью:
Клименко Е.С., Беликов С.И., Черногор Л.И., Адельшин Р.В., Белькова Н.Л. Поиск генетических маркеров для характеристики фототрофных симбионтов байкальских эндемичных губок. Бюллетень Оренбургского научного центра УрО РАН. 2018. 3: 10 c. [Электр.
ресурс] (URL: http://elmag.uran.ru:9673/magazine/Numbers/2018-3/Articles/KES-2018-3.pdf).
DOI: 10.24411/2304-9081 -2018-13002.
