Верификация метода рестрикционного анализа рДНК для изучения геномного полиморфизма представителей порядка Boletales Текст научной статьи по специальности «Биологические науки»

ВЕСТНИК САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКОГО УНИВЕРСИТЕТА

Сер . 3 . 2008 . Вып. 4

ГЕНЕТИКА

УДК 582 . 287 .2:575

Д. М. Иванов1

ВЕРИФИКАЦИЯ МЕТОДА РЕСТРИКЦИОННОГО АНАЛИЗА РДНК ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ ГЕНОМНОГО ПОЛИМОРФИЗМА ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ ПОРЯДКА BOLETALES

1 Санкт-Петербургский государственный университет, кафедра генетики и селекции

Рестрикционный анализ амплифицированной области внутренних транскрибируемых спейсеров, включающей ген 5,8S малой субъединицы рРНК (ITS1-5,8S-ITS2) рибосомальной ДНК (рДНК) — (PCR/ITS/RFLP), — широко применяется при идентификации видов грибов и изучении их структуры [7, 9]. Однако при амплификации ДНК базидиальных грибов с праймерами ITS1F и ITS4B, специфичными для ITS1-5,8S-ITS2 рДНК базидиальных грибов [9], получаются фрагменты, размер которых на треть больше последовательностей ITS1-5,8S-ITS2, депонированных в международной базе данных секвенированных образцов NCBI (National Center for Biotechnology Information) . Кроме того, больше чем в половине случаев между последовательностями 28S, ITS1-5,8S-ITS2 и 18S отсутствуют гомологичные участки, что не позволяет состыковать их между собой. В этих последовательностях также не удалось обнаружить сайты отжига праймеров ITS1F и ITS4B .

Цель работы — провести верификацию метода PCR/ITS/RFLP для базидиальных грибов порядка Boletales, чтобы в дальнейшем применять его для изучения структуры и экологии родов Boletus, Leccinum, Suillus, Tylopilus, Xerocomus.

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

• провести рестрикционный анализ области ITS1-5,8S-ITS2 рДНК, амплифицированной с праймерами ITS1F и ITS4B;

• сравнить полученные амплифицированные участки и длины рестриктных фрагментов с соответствующими размерами секвенированных последовательностей, депонированных в NCBI

В качестве объекта исследования выбраны грибы рода Paxillus Fr. - Свинушка: Fungi, Basidiomycota, Hymenomycetes, Homobasidiomycetes, Boletales, Paxilineae, Paxillaceae, имеющие практическое значение в медицине и экологии

Изучение свинуховых имеет большое практическое значение в связи с зафиксированными случаями острых отравлений двумя видами P atrotomentosus (Свинушка толстая)

© Д. М . Иванов, 2008

и P involutus (Свинушка тонкая) [4] . Указанные виды относятся к группе ядовитых грибов, обладающих гемолитической активностью . Санитарные правила запрещают сбор и продажу свинушки тонкой [5]. Сложности в исследовании ядовитых свойств обусловлены тем, что токсичность P. involutus изменяется в зависимости от места произрастания Кроме того, варьирует и чувствительность людей к яду

Изучение P involutus представляет интерес для охраны лесных сообществ, расположенных рядом с крупными промышленными городами. Такие леса подвергаются постоянному загрязнению и регулярному рекреационному воздействию . При этих условиях, наряду с уменьшением численности видов эктомикоризных грибов, отдельные виды из группы нитрофилов резко повышают плодоношение . Наибольшей активностью обладает P. involutus, мицелий которой может занять все экологические ниши по профилю почвы, вытеснив мицелий других симбиотрофных грибов [6] .

Материал и методы исследования. Материалом для исследования послужили плодовые тела трех видов грибов, приведенных ниже . Перед описанием местонахождения каждого образца дано его условное обозначение . В скобках указаны географические координаты, определенные GPS навигатором eTrex производства Garmin, точность 15 м .

Paxillus atrotomentosus (Batsch) Fr.

Pa — Ленинградская обл . , Лужский р-н, правый берег р . Оредеж между притоком р . Кременка и плотиной (N 59°02 . 516’ E030°31.728’), сосняк бруснично-вересковый, дата сбора 07.07.2005;

Pa1 — Ленинградская обл . , Лужский р-н, правый берег р . Оредеж между притоком р . Кременка и плотиной (N 59°02.424’ E030°31.667’), сосняк бруснично-вересковый, 16 . 08 .2005 .

Paxillus involutus (Batsch) Fr.

Pi — Ленинградская обл . , Гатчинский р-н, между р . Кременка и р . Оредеж (N 59°04 .621’ E030°28 .746’), сосняк черничный, 21.08 .2005;

Pi1 — Ленинградская обл. , Гатчинский р-н, правый берег р . Кременка (N 59°04 . 535’ E030°27.462’), смешанный лес из березы и ели, 12 .08 .2005;

PiX—Мурманская обл . , Апатитский р-н, г. Кировск, подножье горы Айкуайвенчорр (N 67°36.434’ E033°41.688’), в смешанном лесу из ели сибирской и березы извилистой, 08 .08.2006;

Pi2 — Санкт-Петербург, Петродворцовый р-н, парк Сергиевка (N 59°53 .223’ E029°50 .134’), смешанный лес из березы и ели, 06 09 2006;

Pi3 — Санкт-Петербург, Петродворцовый р-н, парк Сергиевка (N 59°53 . 341’ E029°50 . 346’), смешанный лес из березы и ели, 13 09 2006

Tylopilus felleus (Bull . : Fr) P. Karst.

Tf — Ленинградская обл . , Гатчинский р-н, между р . Кременка и р . Оредеж (N 59°04 . 703’ E030°28 .431’), смешанный лес из осины, ели и сосны, на почве, 06 . 08 .2006.

Для выделения ДНК использовали следующую методику, апробированную на гербарных образцах базидиомицетов [6]. Из сухого плодового тела отбирали навеску 20 мг помещали в 1,5 мл пластиковую пробирку (Медполимер) и измельчали с помощью металлического пестика Лизис пробы проводили в 300 мкл буферного раствора с протеиназой К (Helicon) . Конечные концентрации веществ в растворе: 0,29 мг (30 ед . активности/мг) протеиназа К, 50 мМ Тris-HCl, 50 мМ №2ЭДТА, 150 мМ NaCl, 500 мМ 2-меркаптоэтанол, 2,5 % саркозил . Пробирки с лизирующим буферным раствором выдерживали

1 ч при 65 °С . Белки и полисахариды осаждали после добавления 100 мкл 5 M раствора NaCl и 400 мкл смеси хлороформ: изоамиловый спирт (24:1) центрифугировали при 12 000 об . /мин в течение 3 мин . Отбирали верхнюю фазу и ДНК осаждали изопропанолом в количестве, равном 0,6 объема водной фазы . Осадок промывали 1 мл 70%-ного этанола, высушивали и растворяли в 30-50 мкл ТЕ . Раствор ДНК хранили при 4 °С

Амплификацию ДНК осуществляли в пробирке для микропроб на 0,2 мл (Porex Bio Produkts) . Для амплификации области ITS1-5,8S-ITS2 рДНК использовали пару праймеров ITS1F-5'-cttggtcatttagaggaagtaa-3’ и ITS4B-5'-caggagacttgtacacggtccag-3’ специфичных для базидиальных грибов [1] . Состав амплификационного раствора: 5 ед . активности полимеразы Taq (Helicon), 5 мкл реакционного буфера (Tris-HCl 67мМ, (NH4)2SO4 17мМ, MgCl2 2,5 мМ, Tween-20 0,1 %, BSA 0,12 мг/мл, глицерин 8,0 %), 0,6 мкл смеси dNTPs 25 мМ (Helicon), по 1 мкл каждого праймера (15,0-16,0 ОЕ/мл),

вода до 22 мкл . ПЦР проводили на термоциклере TermoHybaid со следующим температурным режимом: предварительная денатурация 92 °С 180 с, далее 30 циклов — денатурация 92 °С 60 с, отжиг праймеров 55 °С 90 с, синтез ДНК 72 °С 50 с, затем охлаждение до 25 °С . Параллельно ставилась контрольная ПЦР- без ДНК .

Для расщепления амплифицированного фрагмента использовали рестриктазу Hinfl (Fermen-tas) — сайт узнавания — g^antc, где n — любой нуклеотид . Для проведения рестрикции к 5 мкл ам-плификата прибавляли 1 мкл 10х буфера для рестриктазы и около 0,1 мкл (10 ед. ) рестриктазы . Смесь инкубировали на водяной бане в течение 1 ч при температуре 37 °С . Разделение фрагментов проводили методом электрофореза в 1,5%-ном агарозном геле (Amresco) . Условия проведения электрофореза: охлаждаемый 1х ТВЕ буфер, напряженность 100 В . Гели окрашивали бромистым этидием . Маркер молекулярной массы — ДНК бактериофага X, расщепленная энзимом Pst I (Fermentas) . Для регистрации изображения в ультрафиолетовом свете 310 нм использовали систему документирования гелей .

Информация о секвенированных нуклеотидных последовательностях участков рДНК всех видов, представляющих род Paxillus, взята из базы NCBI (http://www. ncbi . nlm . nih. gov/) (табл . 1) . Выравнивание нуклеотидных последовательностей проводилось с использованием программы Clustalw (http://www. ebi . ac . uk/clustalw/) . Сравнение секвенированных последовательностей осуществлялось методом непараметрического бутстрэп (bootstrap) анализа [8] . Для этого использовался пакет программ Phylip .

Результаты исследований и их обсуждение. Выбор области внутренних транскрибируемых спейсеров для анализа объясняется наличием в NCBI секвенированных последовательностей для всех видов, указанных в табл . 1. В последнее время начаты работы по изучению у базадиальных грибов ряда генов, отличных от рДНК, например кодирующих белки актин и бета-тубулин. Но пока информация об этих последовательностях доступна для очень ограниченного числа видов, что не позволяет проводить по ним сравнение . Из видов, представленных в табл . 1, указанные гены секвенированы только для P. filamentosus и P involutus.

Таблица 1

Последовательности рДНК видов рода Paxillus, использованные в работе

Название вида Номер последовательности в NCBI

18S ITS1-5,8S-ITS2 28S

P. atrotomentosus (Batsch) Fr. DQ534695 DQ533978 AY177261

P. filamentosus Fr. DQ534686 AF167687 AF167688 AF104991 AF167680 AF167681 AF098384

P. involutus (Batsch) Fr * AY585915 AM084700 AF167694 AF167692 AY230243 AY585916 AY585919 DQ068961 DQ179126 DQ367909 AF167701 AF167684 AY612815

P. panuoides Fr. AF026628 DQ534574 AF287879

P. vernalis Watling AY662662 DQ647827 AY645059

* Для P. involutus фрагмент 18S не секвенирован, не считая 30-40 п . н . , примыкающих к ITS1 области .

На рис . 1 показано строение рДНК базидиальных грибов и указаны сайты отжига праймеров, используемых в работе . Данные, полученные в результате проведения

Транскринционная единица

Повторяющаяся единица

Рис. 1. Схема организации рДНК базидиальных грибов и сайты отжига праймеров, по данным [11]

ETS — внешний транскрибируемый спейсер; ITS1, ITS2 — внутренние транскрибируемые спейсеры; IGS1, IGS2 — межгенные спейсеры; ITS 1F и ITS 4B — праймеры, используемые для амплификации .

PiX Pi3 Pi2

Pa1 Pa

440 230 300 390 240 120 350

М PiX Pi3 Pi2 Pi Pa1 Pa Tf М

Рис. 2. Электрофоретическое разделение амплифицированной области внутренних транскирибируемых спейсеров ГШ-5^-ГГС2 рДНК

Обозначения дорожек геля соответствуют условному обозначению плодовых тел в табл . 2; М - маркер молекулярной массы (п . н . ) .

Рис. 3. Электрофоретическое разделение фрагментов участка ITS1-5,8S-ITS2 рДНК после обработки рестриктазой НМ I

Обозначения дорожек геля соответствуют условному обозначению плодовых тел в табл . 2; М - маркер молекулярной массы (п . н . ); верхняя строка рисунка показывает размер фрагмента (п . н . ) .

РСКЛТ8/К^ЪР анализа, представлены на рис . 2 и 3 и обобщены в табл . 2 . Установлено, что в результате амплификации ДНК, выделенной из плодовых тел Р. ітоШт, образуется фрагмент размером 910 п . н . (см . рис . 2), который в дальнейшем расщепляется или на части 440, 300, пх или на 440, 230, пх, где пх — ряд фрагментов небольшой величины приблизительно 40-75 п . н . (см . рис . 3) . Образцы Р аґгоґотєпґозш дают фрагмент размером

Таблица 2

Данные РСК/1Т8/КР1Р проанализированных образцов

Название вида (образцы*) ITS1-5,8S-ITS2 (п . н . ) Размер амлифицированного фрагмента ITS1-5,8S-ITS2/Hmfl (н . н . ) Фрагменты носле обработки рестриктазой HinfI

Paxillus atrotomentosus (Pa, Pa1) 870 390, 240, 120**

Paxillus involutus (Pi, Pi1, PiX) 910 440, 300, x < 75***

Paxillus involutus (Pi2, Pi3) 910 440, 230, x < 75***

Tylopilus felleus (Tf) 830 350, 240, 120**

* Условные обозначения плодовых тел соответствуют списку изученных грибов в разделе материалы и методы исследования .

* * При расщеплении образуется два одинаковых фрагмента.

* * * Анализ участка последовательности 28S (рис . 3, Е) показывает, что образуется несколько легких фрагментов массой от 75 до 48 п . н . , не разделяемых в геле .

870 п. н. (см . рис . 2), который разделяется ферментом HinfI на следующие фрагменты: 390, 240 и 120 п. н. (см. рис . 3) .

Сопоставим полученные данные с результатами анализа секвенированных последовательностей из табл . 1. Следует отметить, что все последовательности P atrotomentosus и P panuoides депонированы в NCBI под синонимичными названиями Tapinella atrotomen-tosa (Batsch) Sutara и T. panuoides (Batsch) E . -J. Gilbert.

Анализ последовательности P. atrotomentosus DQ533978 (рис . 4, А) показывает, что в результате амплификации с выбранной парой праймеров должен образовываться

А

cttggtcatttagaggaagtaaaagtcgtaacaaggtttccgtaggtgaacctgcggaaggatcattattgatttttaaagaaaagtaagctcaagttgtgct

ggcttgttcaaatgagaggcatgtgcatgctttgggtttcactttttcttacattcacaccatgtgcaccttttgtaggtctttcgagatctatgtatttttattatactc

caatgtatgttcatagaatgtcttttatcttattgcgcagttgctttttctttttgaaaagtgattgatgcaagtaagttgtaaaaacaactttcagcaatggatctct

tggctctcgcatcgatgaagaacgcagcgaattgcgatatgtaatgtgaattgcagattttccgtgaatcatcgaatttttgaacgcaccttgcactccttg

gtattccgaggagtatgcctgtttgagtgtcattaaattctcaacgccttacatttttgttgtttcaaaagtgtacatggatggttggattgtggagggaatgctg

gcaatttctgtcggctcctctgaaatgcattagcaaggataagttttgcaattgttggtgtgataatgatcatcgcatttgactgaagcttttgagtctttgctta

caatagtcctttaggacagtcttattgaaattttgacctcaaatcaggtaggactacccgctgaacttaagcatatcaataagcggaggaaaagaaactaa

caaggattcccctagtaactgcgagtgaagagggaagagctcaaattttaaatctggcagttcttgcggctgcccgagttgtaatctagagaagtgctttc

cgcgctggaccgtgtacaagtctcctg

Б

cttggtcatttagaggaagtaaaagtcgtaacaaggtttccgtaggtgaacctgcggaaggatcattattgatttttaaagaaaggtgggctttgagttgttgc

tggcctctaatgtaggggcatgtgcatgcttgagctttcactttttcttcaaattcacaccatgtgcacctcttgtaggtctttcgagatctatgtattttcattataccc

caatgtatgtttaaagaatgtttatcttattattgcacggttacttttgtataaaagtgattgggcaagtaagttgttttacaactttcagcaatggatctcttggctctc

gcatcgatgaagaacgcagcgaattgcgatatgtaatgtgaattgcagattttccgtgaatcatcgaatttttgaacgcaccttgcgctccttggtattccgagga

gtatgcctgtttgagtgtcattaaattctcaactctatatatttttgtgtatagatgttggattgtgggggattatgctggcttgtcagctcctcttaaatgcattagcaa

agatagtcttgcaattgttagtgtgataatgatcgctgcatttgactgagacttataatcttagcttatagtcgtcttttatcagacaacatattgaaattttgacctcaa

atcaggtaggattacccgctgaacttaagcatatcaataagcggaggaaaagaaactaacaaggattcccctagtaactgcgagtgaagagggaagagctc

aaattttaaatctggcagttcttgtgactgtccgagttgtaatctagagaagtgttttccgcgctggaccgtgtacaagtctcctg

В

gtaacaaggtttccgtaggtgaacctgcggaaggatcattatcgaaaagcaatccggggagaggcgaccgagagaagtttggtagatcgtagggat

tgtcgctggcctttggacacgaaggcatgtgcacgttccgagttctccttagtcctcctttgcctttccttcggacaacctttcttcacacccgtgcacccattg

taggtctccgcgaggggatctatgtcttcataaaactctacgtatgtctaggaatgtatctaaagcgtcgaccggcttggctcgacgcctggtcggcgacg

gtaaagaacgaaatacaactttcagcaacggatctcttggctctcgcatcgatgaagaacgcagcgaattgcgataagtaatgtgaattgcagattttcagt

gaatcatcgaatctttgaacgcaccttgcgctccttggtattccgaggagcatgcctgtttgagtgtcatttaattctcaaccatccctcgatttgtttcgaggttt

ggcttggattttgggagctgccgggcgaccctacggtcttcggctctccttaaaagcattagcgatggtggaacggacctaactccatgcatgaacggc

cttcgacgtgataatgatcgtcgtggctggagtgctagcgggcgtcgtgaagccagcgcttctaaatctctcgtcgaaagacgaaactcgaaacttgacct

caaatca

Г

aaggatcattatcgaaaagcaatccgggggggaggcgaccgagcgaagtttggtagatcgtagggattgtcgctggcctttggaaacgaaggcatgtg

cacgttccgagttctccttagtcctcctttgcctttcctttggaaaaccctttcttcacacccgtgcacccattgtaggtctccgcgaggggatctatgtcttca

cataaacactacgtatgtctaggaatgtatctaaaagcgtcggacggcttggcttcgtgcccggtcggcgacggtaaagaaccataatacaactttcag

caacggatctcttggctctcgcatcgatgaagaacgcagcgaattgcgataagtaatgtgaattgcagattttcagtgaatcatcgaatctttgaacgcac

cttgcgctccttggtattccgaggagcatgcctgtttgagtgtcatttaattctcaaccatccctcgattcgtttcgagggtttggcttggattttgggggctgc

cgggcgaccctagggtcttcggctctccttaaaagcattagcgatggcggcgcgatctaaccccccccatgcatgaacggccttcgacgtgataat

gatcgtcgtggctggagtgttgttagtgggtgtcgtgaagtcggcgcttctaaagacctcgtcgaaagacgaaaactcgaaacttgacctcaaatcaggtag

gactacccgctgaacttaa

Д

atatcaataagcggaggaaaagaaactaacaaggattcccctagtaactgcgagtgaagcgggatgagctcaaattttgaatctggcggtcttcaggc

cgtccgagttgtaatctagagaagcgtcttccgcgctggaccgtgtacaagtctcctg

Рис. 4. Нуклеотидные последовательности области 1ТБ1-5,88-1Т82 по данным NCBI

для видов рода РахШж

А — Р. atrotomentosus (DQ533978); Б — Р. panuoides (DQ534574); В — пример последовательности Р. 1то1Шы^ (АМ084700) с двумя сайтами рестрикции; Г — пример последовательности Р. involutus (AY230243) с тремя сайтами рестрикции; Д — участок 288 Р. involutus (AY612815) . Сайты отжига праймеров ГГ8^ и 1Т$4В выделены жирным шрифтом и подчеркнуты, сайты узнавания рестриктазы НшА подчеркнуты .

фрагмент массой 866 п. н. , который после воздействия рестриктазой образует следующие фрагменты: 389, 236, 118, 123 п. н.

В результате анализа последовательностей NCBI установлено, что кроме Р а№в-tomentosus только последовательности вида Р panuoides 18S (АБ026628), ITS1-5,8S-ITS2 (DQ534574), 28S (АБ287879) обладают гомологичными участками, позволяющими составить единый фрагмент и указать на нем сайты отжига праймеров !Т81Р-!Т84В (рис . 4, Б) .

На примере последовательностей Р а^о^теп^ш и Р panuoides установлено, что праймер ГТ81Р считывает 63-65 п. н. гена 18S, а праймер !Т84В 160-165 п. н. гена 28S, что обеспечивает существование протяженных гомологичных участков для реконструкции всей последовательности

При анализе последовательностей изолятов видов Р filamentosus, Р involutus и Р уег-nalis, депонированных в базе (см . табл . 1), секвенированные последовательности 18S, ITS1-5,8S-ITS2 и 28S не удается состыковать между собой, поскольку они не содержат гомологичных перекрывающихся участков . Для депонированных изолятов этих видов также не удалось обнаружить сайты отжига праймеров ITS1F и ITS4В .

Была высказана рабочая гипотеза о том, что ошибки выявления участков последовательностей между кодирующими генами и областью внутренних транскрибируемых спейсеров заключаются в праймерах, используемых для амплификации и секвенирования . В работе М . Г арде [9], вышедшей в 1996 г. , обоснована необходимость использования пары праймеров ITS1F-ITS4В для изучения базидиальных грибов . Несмотря на это, в большей части исследований, связанных с амплификацией последовательности ITS1-5,8S-ITS2, используются праймеры ITS5 и ITS4, а для секвенирования применяются праймеры ITS2. ITS3, ITS4 и ITS5 [7] . Существенным недостатком этих олигонуклеотидов является то, что они не полностью раскрывают изучаемую последовательность

Как показано нами ранее, на примере представителей рода Leccinum, обладающих уникальным строением области ITS1-5,8S-ITS2 рДНК [3], все депонированные в NCBI последовательности представляют только 2/3 этого участка. Установлено, что праймеры ITS1F-ITS4В позволяют амплифицировать участок размером 1900-2000 п. н. , тогда как последовательности, депонированные в NCBI, содержат 1100-1200 п. н.

Анализ последовательностей ITS1-5,8S-ITS2 Р involutus (см . табл. 1) на наличие сайтов рестрикции НшП показывает, что они объединяются в две группы — с двумя сайтами (АМ084700, АУ585915 и др . ) (рис . 4, В) или с тремя (AF167692, DQ068961 и др . ) (рис . 4, Г) . Это согласуется с полученными экспериментальными данными о двух КРЪР группах, на которые разделяются проанализированные образцы Р. involutus (см . рис . 3, табл . 2) . Для объяснения наличия в спектре ИРЪР Р involutus коротких последовательностей, не разделяемых в геле, на рис . 4, Дприведен участок 28S, считываемый с праймером ITS4B, с указанием сайтов рестрикции.

Если участок секвенирован в многократной повторности, то сравнение доступных последовательностей проводили с помощью программы Qustalw для проверки их однородности. Например, для участка 28S Р involutus и Р filamentosus доступно по три последовательности (см . табл . 1) . В результате сравнения установлено, что гомология этих последовательностей внутри вида составляет 98-99 %. Максимальная вероятность поддержки кластеров на дендрограммах (рис . 5) свидетельствует о высокой однородности по участкам 18S и 28S внутри данного рода.

Наряду с консервативностью кодирующих генов 18S, 5,85 и 28S, области ITS1 и ITS2 обладают высокой вариабельностью . Для изучения внутривидового полиморфизма по данному локусу были выбраны все последовательности Р involutus, отличающиеся

-----P. vernalis AY662662

-P. atrotomentosus DQ534695

100 %

100 %

-P. panuoides AF026628

18S

-----P. vernalis AY645059

- P. filamentosus AF098384 -P. atrotomentosus AY177261

■ P. panuoides AF287879 28S

Рис. 5. Деревья, основанные на результатах непараметрического бутстрэп анализа выборки секвенированных последовательностей генов 18Б и 28Б рДНК видов рода Рахіїїш Над ветвями указаны индексы бутстрепа >50 %, длина ветвей, пропорциональна вероятности поддержки кластеров .

99 %

93 %

100 %

100 %

100 %

59 %

83 %

P. involutus AY585915 ■ P. involutus AM084700

----- P. vernalis DQ647827

-----P. involutus AF167694

100 %

76 %

P. involutus AF167692

--------P. involutus DQ068961

--------P. involutus AY585919

— P. involutus AY230243 -P. involutus DQ179126

-P. involutus AY585916

--------P. involutus DQ367909

■ P. filamentosus AF104991

100 %

■ P. filamentosus AF167688 - P. filamentosus AF167687

-P. atrotomentosus DQ533978

------P. panuoides DQ534574

Рис. 6. Дерево, основанное на результатах непараметрического бутстрэп анализа выборки секвенированных последовательностей области ITS1-5.&S-ITS2 рДНК видов рода Paxillus Над ветвями указаны индексы бутстрепа >50 %, длина ветвей пропорциональна вероятности поддержки кластеров .

между собой и представляющие выявленные RFLP группы (см . табл . 1) . В результате проведения непараметрического бутстреп анализа (рис . 6) было установлено, что группа образцов P involutus наиболее полиморфна, поскольку образует два кластера, включающих представителей родственных видов P filamentosus и P vernalis.

Полиморфизм изучаемой области внутренних транскрибируемых спейсеров варьирует в разных таксонах базидиальных грибов . Например, род Amanita отличается высокой консервативностью . Однако полиморфизм у представителей родов Russula и Lactarius настолько высок, что невозможно провести сравнение с применением статистических

программ . Построение филогенетической дендрограммы в этом случае приводит к тому, что вероятность родства между представителями одного вида оказывается меньше, чем между разными видами

Известно, что при филогенетической консервативности кодирующих последовательностей размер и структура внутренних транскрибируемых спейсеров характеризуется четко выраженной видовой специфичностью Эти факты позволили создать систему для идентификации видов базидиальных грибов по результатам PCR/ITS/RFLP [11,12]. В ее основе лежала база данных электрофоретических спектров, полученных из плодовых тел известных референтных видов, с которыми сравнивали образцы, выделенные из эк-томикоризных окончаний

Полученные данные позволяют сделать заключение о том, что внутри вида Р т-\olutus среди образцов, не обладающих морфологическими и микроскопическими различиями, выявлено две группы генетически гетерогенных географических изолятов Это согласуется с полученными ранее результатами идентификации видов базидиальных грибов из эктомикоризных окончаний. Так, на пробной площади в ельнике черничном, было выявлено две группы изолятов Р involutus, занимающих разные почвенные горизонты и образующих эктомикоризные окончания, отличающиеся по морфологическим признакам [2]. На основе метода рестрикционного анализа межгенной области (PCR/IGS/ КЕЪР) в работе [10] было выделено несколько групп географических изолятов и показано, что они обладают разной активностью при инокулировании сеянцев дуба и березы для искусственного лесоразведения . Таким образом, вид Р. involutus следует рассматривать как находящийся в процессе внутривидовой дивергенции.

Рассмотренный метод позволил выявить внутривидовой полиморфизм Р involutus, который может коррелировать с каким-либо признаком, имеющим практическое значение, например, гемолитическая активность географических изолятов Р. involutus. Рекомендуется при изучении токсических свойств штаммов Р. involutus проводить указанную процедуру PCR/ITS/RFLP и в дальнейшем изучать выделенные группы отдельно . Связанно это с тем, что в настоящее время нет возможности по микроскопическим и морфологическим признакам плодовых тел разделить указанные внутривидовые географические изоляты

На основе сопоставления массы фрагментов электрофоретического спектра в геле с размерами фрагментов, которые теоретически должны получиться в результате разбиения по сайтам рестрикции последовательностей, депонированных в NCBI, на примере представителей рода РахШш проведена верификация метода PCR/ITS/RFLP. Показано, что для амплификации области ITS1-5,8S-ITS2 рДНК базидиальных грибов необходимо использовать пару специфичных праймеров ITS1F-ITS4B . Это является обязательным условием полноты секвенирования участка 185-285 за счет получения гомологичных перекрывающихся участков в больших субъединицах

Таким образом, PCR/ITS/RFLP является методом экспресс-анализа, результаты которого можно проверить, используя международную базу данных Указанный метод позволяет быстро сравнить между собой организмы с перекрывающимися морфологическими и анатомическими признаками для выявления их сходства или различия и рекомендуется также для анализа ДНК, выделенной из сложных межвидовых симбиотических образований, например, таких как эктомикоризы

Исследование выполнено при поддержке Рособразования и CRDF, оказанной по программе «Фундаментальные исследования и высшее образование» (РНП 2.2. 2.3.16048, У5^-12-02) .

Summary

Ivanov D. M. Verification of restriction rDNA analysis method for genomic polymorphism studying Boletales order representatives .

Verification of a restriction analysis method of the internal transcribed rDNA (PCR/ITS/RFLP) spacers area on the basis of the comparison of electrophoresis spectrum fragments weight in gel with fragments which theoretically should turn out as a result of splitting the sequences deposited in NCBI into restriction sites is performed

It is shown that for ITS1-5,8S-ITS2 rDNA area studying of basidiomycetes fungi it is necessary to use ITS1F and ITS4B primers . The use of the others primers lead to loss of long sequence sites which are excluded from the further analysis and make impossible joining of the specified area with 18S and 28S sites .

On the basis of PCR/ITS/RFLP and comparisons of the Paxillaceae international database sequences from NCBI it is established, that Paxillus involutus is in the intraspecific divergence process

Key words: Boletales, PCR/ITS1-5,8S-ITS2/RFLP, ITS1F-ITS4B .

Литература

I. Иванов Д. М. Анализ генетической однородности представителей порядка Hygrophorales // Вестн. С-Петерб . ун-та. Сер. 3 . 1998 . Вып. 1 (№ 3). С . 125-131.

2 . Иванов Д. М. Микобионты эктомикоризных окончаний Picea abies (L . ) Karst . в ельнике черничном (Ленинградская область) // Микология и фитопатология . 2005 . Т 39 . Вып . 3 . С . 41-47 .

3 . Иванов Д. М. Особенности строения области ITS1 рДНК Leccinum versipelle, идентифицированного из эктомикоризных окончаний Picea abies // Грибы в природных и антропогенных экосистемах. СПб . , 2005 . Т 1. С . 222-226.

4 . Мусселиус С. Г., Рык А. А., Лебедев А. Г., Пахомова Г. В., Голиков П. П., Давыдов Б. В., Доно-ва Л. В., Зимина Л. Н., Платонова Г. А., Селина И. Е., Скворцова А. В. К вопросу о токсичности грибов вида свинушка тонкая и толстая // Анестезиология и реаниматология . 2002. № 2 . С . 30-35 .

5 . Санитарные правила по заготовке, переработке и продаже грибов (СП 2 . 3 .4. 009-93) // Утверждены постановлением Госкомсанэпиднадзора Российской Федерации от 20 августа 1993 г. № 10 .

6 . Шубин В. И. Рекреация и промышленное загрязнение лесов азотом — угроза разнообразию микоризных грибов, продуктивности и устойчивости лесных экосистем // Биологические основы изучения, освоения и охраны животного и растительного мира, почвенного покрова восточной фенноскандии, Петрозаводск, 1999. С . 206-207.

7 . Den Bakker H. C., Gravendeel B., Kuyper T. W. An ITS phylogeny of Leccinum and an analysis of the evolution of minisatellite-like sequences within ITS1 // Mycologia . 2004. Vol . 96 . P. 102-118 .

8 . Felsenstein J. Confidence limits on phylogenies: an approach using the bootstrap // Evolution. 1985 . Vol 39 P 783-791

9 . Gardes M., Bruns Т. D. ITS-RFLP matching for the identification of fungi // Methods in molecular biology: Species diagnostic protocols: PCR and other nucleic acid methods. N. 50 . Totowa, 1996 . P. 177-186.

10 . Honig K., Riefler M., Kottke I. Survey of Paxillus involutus (Batsch) Fr. inoculum and fruitbodies in a nursery by IGS-RFLPs and IGS sequences // Mycorrhiza. 2000 . Vol. 9 . P. 315-322 .

II. Jonsson T., Kokalj S., Finlay R., Erland S. Ectomycorrhizal community structure in a limed spruce forest // Mycol. Res . 1999 . Vol. 103 . Pt. 4 . P. 501-508.

12 . Karen O., HogbergN., DahlbergA., JonssonL., Nylund J.-E. Inter- and intraspecific variation in the ITS region of rDNA of ectomycorrhizal fungi in Fennoscandia as detected by endonuclease analysis // New Phytologist. 1997. Vol. 136 . P. 313-326 .