CC BY
17
УЧЕНЫЕ ЗАПИСКИ КАЗАНСКОГО УНИВЕРСИТЕТА.
_СЕРИЯ ЕСТЕСТВЕННЫЕ НАУКИ_
2022, Т. 164, кн. 3 ISSN 2542-064X (Print)
С. 408-437 ISSN 2500-218X (Online)
ОРИГИНАЛЬНАЯ СТАТЬЯ
УДК 577.2 doi: 10.26907/2542-064X.2022.3.408-437
ОЦЕНКА ЭФФЕКТИВНОСТИ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ БАРКОДИРОВАНИЯ ДЛЯ СОХРАНЕНИЯ РЕДКИХ ВИДОВ ФЛОРЫ РЕСПУБЛИКИ УЗБЕКИСТАН
Ф.У. Мустафина1, Д.Н. Жамалова1, Д.Э. Турдиев1, Г.Т. Курбаниязова1, А.Дж. Газиев1, Н.Ю. Бешко1, К.Ш. Тожибаев1, 3.3. Ибрагимов2, К.Т. Бобоев
1 Институт ботаники Академии наук Республики Узбекистан, г. Ташкент, 100125, Республика Узбекистан 2Институт биоорганической химии имени А.С. Садыкова Академии наук Республики
Узбекистан, г. Ташкент, 100143, Республика Узбекистан 3НИИ гематологии и переливания крови Министерства здравоохранения Республики Узбекистан, г. Ташкент, 100097, Республика Узбекистан
Аннотация
В статье впервые представлена референсная база данных нуклеотидных последовательностей по трем ДНК-баркодам: ITS2, matK и rbcL - для 65 редких, исчезающих видов флоры Республики Узбекистан (133 образца, по два образца для каждого вида), в том числе 23 однодольных и 42 двудольных видов. Наиболее вариабельным, легко ам-плифицируемым и секвенируемым участком оказался ITS2 как для однодольных, так и для двудольных видов. Данный участок рекомендован в качестве основного ДНК-баркода. Референсная база данных, загруженная на платформу BOLD v4, может быть использована фармацевтическими компаниями, природоохранными и таможенными службами, а также в филогенетических исследованиях.
Ключевые слова: баркодирование, редкие виды, эндемики, сохранение биоразнообразия, BOLD
Введение
Точная и быстрая идентификация видов является первостепенной задачей для исследований в области систематики, флористики, морфологии и эволюции сосудистых растений. Развивающееся интенсивными темпами направление - баркодирование растений, или паспортизация, на основе коротких, от 400 до 800 п.о., нуклеотидных последовательностей (ДНК-баркодинг) - позволяет детектировать генетический материал без наличия таксономически важных признаков, а также позволяет быстро и точно определить известные виды растений при наличии ре-ференсной библиотеки нуклеотидных последовательностей.
Первоначально ДНК-баркодинг использовался для выявления видовой принадлежности растений в рамках проекта «Дерево жизни» [1]. Данный метод стал универсальным после того, как его начали применять для идентификации видов на всех этапах их жизненного развития, включая фрукты, семена, проростки, зрелые
индивиды, для анализа поврежденных растений и образцов фекалий животных, данный метод стал универсальным.
ДНК-баркод может быть эффективным инструментов оценки биоразнообразия при идентификации новых для науки видов, в том числе криптических [2]. Кроме того, ДНК-баркод позволяет выявить функциональное сходство исследуемых видов, в дополнение к филогенетическому. К. Баралото с соавторами [3] обнаружили 17 общих функциональных признаков у 668 видов, произрастающих в лесах северной Амазонки, с использованием ДНК-баркодов.
Баркодирование дает возможность установить точные границы распространения видов и помогает выявлять новые таксоны. Генетические маркеры ДНК-баркода используются для идентификации и определения качества коммерческих продуктов, в защите видов, которым угрожает исчезновение, от незаконной торговли, а также при документировании использования лесных генетических ресурсов местным населением. Более широкое использование ДНК-баркода позволяет сохранять генетические ресурсы растений, а также виды животных, которые являются объектами купли-продажи на мировых рынках.
Необходимость в точной и надежной оценке древесной продукции с применением недорогих и быстрых методов стимулировало развитие ДНК-баркодинга многих древесных лесных пород и его использование во многих регионах, отличающихся высоким разнообразием лесной продукции. А.Н. Мюллнер с соавторами [4] протестировали ряд маркеров с целью определения ДНК-баркода для некоторых видов махогонного дерева семейства Meliaceae Juss. Несмотря на то что большинство маркеров были недостаточно точными для идентификации видов, ITS оказался наиболее приемлемым маркером, предложенным для идентификации деревьев, перечисленных Конвенцией о международной торговле видами и находящихся под угрозой исчезновения (CITES). ДНК-баркодинг применяется для идентификации растительного сырья при производстве фармацевтической продукции. Данный метод позволяет избежать возможных расходов от неправильного идентифицирования растительного сырья, особенно при проведении дорогостоящих биотехнологических процессов.
Целый ряд исследований основан на применении различных молекулярных маркеров, однако многие из них не позволяли точно идентифицировать исследуемые виды. Наиболее часто используемыми и предлагаемыми рабочей группой по растениям CBOL ДНК-участками являются rbcL, matK, trnH-A и ITS [5]. Среди проблем, связанных с ДНК-баркодированием, можно отметить следующие: 1) отсутствие библиотеки ДНК-баркодов; 2) отсутствие списка тривиальных и научных названий растений.
В настоящей статье представлены результаты исследований, целью которых являлось создание библиотеки ДНК-баркодов редких и исчезающих видов флоры Республики Узбекистан, пополнение системы данных BOLD v4 нуклеотидными последовательностями, которые могут быть использованы фармацевтическими компаниями для производства сырья растительного происхождения, природоохранными и таможенными службами в борьбе с незаконным сбором редких видов растений в природе.
Материал и методы
Объектом исследований стали 65 редких, исчезающих и/или эндемичных видов флоры Республики Узбекистан, относящихся к 7 родам и 5 семействам: 15 видов рода Astragalus L. (Fabaceae Lindl.), 2 вида рода Dracocephalum L. (Lamiaceae Martinov), 3 вида рода Ferula L. (Apiaceae Lindl.), 16 видов рода Hedysarum L. (Fabaceae Lindl.), 4 вида рода Iris L. (Iridaceae Juss.), 6 видов рода Salvia L. (Lamiaceae Martinov) и 19 видов рода Tulipa L. (Liliaceae Juss.) (рис. 1). Для каждого вида исследованы по 2 образца, собранных с разных индивидов; всего 133 образца. Список видов представлен в табл. 1, 2.
Сбор материала проводился в ходе экспедиционных обследований различных районов Республики Узбекистан. Полученная по результатам исследования база данных вместе с гербарным материалом передана в Национальный гербар-ный фонд TASH. Гербарные образцы оцифрованы путем сканирования, каждому гербарному образцу присвоен уникальный регистрационный номер.
Сушку растительного материала осуществляли в пакетиках с использованием индикаторного силикогеля в течение 7-10 дней. Сухие образцы сохраняли в морозильнике при температуре -20°С.
Выделение ДНК. Общая геномная ДНК была выделена с помощью СТАБ (гексадецилтриметиламмониум бромид) [6] из высушенных в селикогеле листьев. Тотальная геномная ДНК была растворена в ТЕ-буфере (10 мМ Tris-HCl, pH 8.0, 1 мМ EDTA) до концентрации 50 нг/мкл. Экстракцию ДНК каждого образца проводили в трех повторностях.
ПЦР-амплификация ДНК и подготовка образцов к секвенированию.
ПЦР-амплификация ДНК осуществлялась с использованием трех пар праймеров ITS2, rbcL и matK мастер миксами Invitrogen Platinum Hot Start PCR (2X) и Thermo Scientific Dream Taq Hot Start (2X). Три пары праймеров следующей последовательности были синтезированы в Институте химии растительных веществ Академии наук Республики Узбекистан:
ITS2: 5'-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3',
5-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3';
matK-xf/matK-MALP-R1: 5 '-TAATTTACGATCAATTCATTC-3',
5'-ACAAGAAAGTCGAAGTAT-3';
rbcL: 5'-ATGTCACCACAAACAGAGACTAAAGC-3',
5'-GTAAAATCAAGTCCACCGCG-3'.
ПЦР-продукты визуализировались в 1.2%-агарозном геле. Использованы следующие режимы проведения ПЦР с праймерами ITS2: 94 °C, 5 мин (один цикл); 94 °C, 30 с, 60 °C, 1 мин и 72 °C, 1 мин (35 циклов); 72 °C, 45 мин, с дальнейшим хранением при 4 °C. Основываясь на экспериментальных данных, температура отжига праймеров при использовании matK-xf/matK была установлена 50 °C, rbcL - 56 °C. При неудовлетворительном результате образцы амплифицировались повторно 2-3 раза до получения четких фрагментов ДНК при разделении в 1.2%-агарозном геле. При неудовлетворительном результате материал не использовался в дальнейших исследованиях.
Рис. 1. Объекты исследований: а) Iris orchioides Carrière; б) Iris magnifica Vved.; в) Tulipa butkovii Botschantz.; г) Tulipa dubia Vved.; д) Tulipa greigii Regel.; е) Tulipa ingens Hoog; ж) Tulipa kaufmanniana Regel; з) Tulipa lehmanniana Merckl.; и) Tulipa vvedenskyi Botschantz.; к) Tulipa carinata Vved.; л) Tulipa kaufmanniana Regel; м) Astragalus pterocephalus Bunge; н) Astragalus xanthomeloides Korovin & Popov; о) Astragalus pterocephalus Bunge; п) Ferula tadshikorum Pimenov; р) Ferula foetida (Bunge) Regel; с) Hedysarum taschkendicum Popov; т) Ferula tadshikorum Pimenov
ПЦР-продукты очищались с использованием набора ExoSap PCR Clean-Up Mini kit (Applied Biosystems, Inc., США) и визуализировались в 1.2%-агарозном геле (рис. 2, 3).
Циклическое секвенирование производилось со специфичными для ДНК-матрицы праймерами ITS2, rbcL и matK с использованием BigDye R Terminator v3.1 (Applied Biosystems, Inc., США) в соответствии с протоколом GeneAmp PCR System 9700.
Табл. 1
Объекты исследований
Класс Название рода и семейства Экстрагировано ДНК Секвенировано
Однодольные Iris L. Iridaceae Juss. Tulipa L. Liliaceae Juss. 12 образцов 4 вида 62 образцов 19 видов 8 образцов 4 вида 38 образцов 19 видов
Astragalus L. Fabaceae Lindl. 48 образцов 15 видов 31 образец 15 видов
Dracocephalum L. Lamiaceae Martinov 11 образцов 4 вида 8 образцов 2 вида
Двудольные Ferula L. Apiaceae Lindl. Hedysarum L. Fabaceae Lindl. 10 образцов 3 вида 47 образцов 16 видов 6 образцов 3 вида 32 образца 16 видов
Salvia L. Lamiaceae Martinov 28 образцов 6 видов 10 образцов 6 видов
Всего 218 образцов 67 видов 133 образца 65 видов
Табл. 2
Информация по объектам исследований
№ Название вида Полевой регистрационный № образца Код образца (ДНК) Код образца (BOLD) Код процесса (BOLD) Статус вида
1. Iris orchioides Carrière 20_FB043 I3 Iris05 IRIS003-21 Статус 3. Редкое, эндемичное растение Запад-ногоТянь-Шаня
2. Iris orchioides Carrière 20_FB045 (unknown1) I6 Iris06 IRIS004-21 Статус 3. Редкое, эндемичное растение Запад-ногоТянь-Шаня
3. Iris hippolyti (Vved.) Kamelin 19_TK21 I1 Iris 01 IRIS007-21 Статус 1. Редчайший узколокальный эндемик низкогорий Кызылкума
4. Iris hippolyti (Vved.) Kamelin 20_ShX16 I2 Iris02 IRIS001-21 Статус 1. Редчайший узколокальный эндемик низкогорий Кызылкума
5. Iris magnifica Vved 19_JD31 I12 Iris 03 IRIS008-21 Статус 2. Редкий эндемик Зеравшан-ского хребта
6. Iris magnifica Vved 19_KU04 Iris04 IRIS002-21 Статус 2. Редкий эндемик Зеравшан-ского хребта
7. Iris svetlanae (Vved.) T.Hall & Seisums 19_KU03 I7 Iris07 IRIS005-21 Статус 2. Редкий эндемик Западного Памиро-Алая
8. Iris svetlanae (Vved.) T.Hall & Seisums 20_TK001 I9 Iris08 IRIS006-21 Статус 2. Редкий эндемик Западного Памиро-Алая
9. Tulipa affinis Botschantz. 19_BN64 T66 Tulip01 TULIP001-21 Статус 3. Редкий эндемик Западного Памиро-Алая
10. Tulipa affinis Botschantz. 19_BN62 T64 Tulip02 TULIP002-21 Статус 3. Редкий эндемик Западного Памиро-Алая
11. Tulipa butkovii Botschantz. 20_FB063 T4 Tulip03 TULIP003-21 Статус 2. Редкий эндемик Западного Тянь-Шаня
12. Tulipa butkovii Botschantz. 18_JCh02 T19 Tulip04 TULIP004-21 Статус 2. Редкий эндемик Западного Тянь-Шаня
13. Tulipa carinata Vved 14_TO001 T47 Tulip05 TULIP005-21 Статус 3. Редкий эндемик Юго-Западного Памиро-Алая
14. Tulipa carinata Vved 13_TK001 T46 Tulip06 TULIP006-21 Статус 3. Редкий эндемик Юго-За падного Памиро-Алая
15. Tulipa dasystemon (Regel) Regel 19_BN60 T24 Tulip07 TULIP007-21 Статус 3. Редкий вид Западного Тянь-Шаня и Памиро-Алая
16. Tulipa dubia Vved. 20_FB057 T5 Tulip09 TULIP009-21 Статус 3. Редкий эндемик Западного Тянь-Шаня
17. Tulipa dubia Vved. 19_BN65 T44 Tulip10 TULIP010-21 Статус 3. Редкий эндемик Западного Тянь-Шаня
18. Tulipa ferganica Vved 17_JCh07 T18 Tulip11 TULIP011-21 Статус 2. Редкий эндемик Ферганской долины
19. Tulipa ferganica Vved 20_TK002 T57 Tulip12 TULIP012-21 Статус 2. Редкий эндемик Ферганской долины
20. Tulipa fosteriana W.Irving 17_BN07 T67 Tulip13 TULIP013-21 Статус 2. Очень узкий редкий эндемик Западного Памиро-Алая
21. Tulipa fosteriana W.Irving 19_Unknown07 T69 Tulip14 TULIP014-21 Статус 2. Очень узкий редкий эндемик Западного Памиро-Алая
22. Tulipa greigi Regel Unknown03 T61 Tulip15 TULIP015-21 Статус 3. Редкий эндемик Западного Тянь-Шаня
23. Tulipa greigi Regel 19_BN57 T25 Tulip16 TULIP016-21 Статус 3. Редкий эндемик Западного Тянь-Шаня
24. Tulipa ingens Hoog 19_BN61 T26 Tulip17 TULIP017-21 Статус 3. Редкий эндемик Западного Памиро-Алая
25. Tulipa ingens Hoog 19_Unknown11 T71 Tulip18 TULIP018-21 Статус 3. Редкий эндемик Западного Памиро-Алая
26. Tulipa intermedia Tojibaev & J. de Groot 18_Unknown01 T52 Tulip19 TULIP019-21 Статус 2. Редкий вид адыров северной части Ферганской долины
27. Tulipa intermedia Tojibaev & J. de Groot 17_JCh03 T30 Tulip20 TULIP020-21 Статус 2. Редкий вид адыров северной части Ферганской долины
28. Tulipa kaufmanniana Regel 19_BN62v1 T31 Tulip21 TULIP021-21 Статус 3. Эндемик Западного Тянь-Шаня с сокращающимся ареалом и численностью
29. Tulipa kaufmanniana Regel 19_uknown01 T32 Tulip22 TULIP022-21 Статус 3. Эндемик Западного Тянь-Шаня с сокращающимся ареалом и численностью
30. Tulipa korolkowii Regel 20_TO113 T72 Tulip23 TULIP023-21 Статус 3. Редкий вид Юго-Западного Тянь-Шаня и Па-миро-Алая с разрозненным ареалом
31. Tulipa korolkowii Regel 20_BN11 T7 Tulip24 TULIP024-21 Статус 3. Редкий вид Юго-Западного Тянь-Шаня и Па-миро-Алая с разрозненным ареалом
32. Tulipa lanata Regel 19_Unknown04 T39 Tulip25 TULIP025-21 Статус 3. Редкий эндемик Памиро-Алая
33. Tulipa lanata Regel 20_FB086 T15 Tulip26 TULIP026-21 Статус 3. Редкий эндемик Памиро-Алая
34. Tulipa lehmanniana Merckl. 20_ShX07 T10 Tulip27 TULIP027-21 Статус 3. Редкий вид в Узбекистане
35. Tulipa lehmanniana Merckl. 19_BN56 T34 Tulip28 TULIP028-21 Статус 3. Редкий вид в Узбекистане
36. Tulipa micheliana Hoog 19_BN63 T35 Tulip29 TULIP029-21 Статус 3. Редкий вид Западного Памиро-Алая
37. Tulipa micheliana Hoog 20_BN10 T12 Tulip30 TULIP030-21 Статус 3. Редкий вид Западного Памиро-Алая
38. Tulipa scharipovii Tojibaev 09_TK002 T50 Tulip31 TULIP031-21 Статус 2. Эндемичное растение северных предгорий Ферганской долины
39. Tulipa scharipovii Tojibaev 20_TO126 T13 Tulip32 TULIP032-21 Статус 2. Эндемичное растение северных предгорий Ферганской долины
40. Tulipa tubergeniana Hoog 18_BN02 T36 Tulip33 TULIP033-21 Статус 3. Редкий эндемик Юго-Западного Памиро-Алая
41. Tulipa tubergeniana Hoog 06_I001 T48 Tulip34 TULIP034-21 Статус 3. Редкий эндемик Юго-Западного Памиро-Алая
42. Tulipa uzbekistanica Botschantz. & Sharipov Unknown02 T45 Tulip35 TULIP035-21 Статус 1. Редкий эндемик Юго-Западного Памиро-Алая, находящийся на грани исчезновения
43. Tulipa uzbekistanica Botschantz. & Sharipov 17_BN05 T38 Tulip36 TULIP036-21 Статус 1. Редкий эндемик Юго-Западного Памиро-Алая, находящийся на грани исчезновения
44. Tulipa vvedenskyi Botschantz. 18_JCh03v T63 Tulip37 TULIP037-21 Статус 3. Редкий эндемик Западного Тянь-Шаня
45. Tulipa vvedenskyi Botschantz. 18_JCh01v T41 Tulip38 TULIP038-21 Статус 3. Редкий эндемик Западного Тянь-Шаня
46. Tulipa dasystemon (Regel) Regel 20_FB117 T54 Tulip08 TULIP008-21 Статус 3. Редкий вид Западного Тянь-Шаня и Памиро-Алая
47. Astragalus bucharicus Regel 19NB53 A1 Astr 02 JDAST001-21 Статус 2. Редкий эндемик Юго-Западного Памиро-Алая
48. Astragalus farctissimus Lipsky 12BN01 A3 Astr03 JDAST002-21 Эндемик Западного Памиро-Алая
49. Astragalus farctissimus Lipsky 18_KU02 A44 Astr04 JDAST003-21 Эндемик Западного Памиро-Алая
50. Astragalus farctissimus Lipsky 19_T007 А4 Astr31 JDAST029-21 Эндемик Западного Памиро-Алая
51. Astragalus leptophysus Vved. 16_UM01 A5 Astr05 JDAST004-21 Статус 2. Редкий реликтовый эндемик Западного Памиро-Алая
52. Astragalus leptophysus Vved. 20_FB005 A6 Astr06 JDAST005-21 Статус 2. Редкий реликтовый эндемик Западного Памиро-Алая
53. Astragalus leptophysus Vved. 20_AF012 А7 Astr32 JDAST030-21 Статус 2. Редкий реликтовый эндемик Западного Памиро-Алая
54. Astragalus lipskyi Popov 12_T001 A9 Astr07 JDAST006-21 Эндемик Памиро-Алая
55. Astragalus lipskyi Popov 20_FB108 F8 Astr08 JDAST007-21 Эндемик Памиро-Алая
56. Astragalus nobilis Bunge ex B.Fedtsch. 12_BN03 A52 Astr10 JDAST008-21 Эндемик Памиро-Алая
57. Astragalus nobilis Bunge ex B.Fedtsch. 20_ FB163 A42 Astr33 JDAST031-21 Эндемик Памиро-Алая
58. Astragalus pseudanthylloide s Gontsch. 13 _TO01 А11 Astr11 JDAST009-21 Статус 2. Редкий эндемик Западного Гиссара
59. Astragalus pseudanthylloide s Gontsch. 19 _PS02 А12 Astr12 JDAST010-21 Статус 2. Редкий эндемик Западного Гиссара
60. Astragalus pseudoeremophy sa Popov 20_ FB099 А15 Astr13 JDAST011-21 Статус 2. Редкий вид Южного Памиро-Алая
61. Astragalus pseudoeremophy sa Popov 19 _JD34 A13 Astr14 JDAST012-21 Статус 2. Редкий вид Южного Памиро-Алая
62. Astragalus pterocephalus Bunge 20_ FB129 A28 Astr15 JDAST013-21 Эндемик горной Средней Азии
63. Astragalus pterocephalus Bunge 20_ FB143 A30 Astr16 JDAST014-21 Эндемик горной Средней Азии
64. Astragalus rumpens Meffert 12 _TO06 A49 Astr17 JDAST015-21 Эндемик Памиро-Алая
65. Astragalus rumpens Meffert 19 _BN65 A19 Astr18 JDAST016-21 Эндемик Памиро-Алая
66. Astragalus stenocystis Bunge 20_ FB125 A33 Astr19 JDAST017-21 Эндемик горной Средней Азии
67. Astragalus stenocystis Bunge 20_ FB128 A34 Astr20 JDAST018-21 Эндемик горной Средней Азии
68. Astragalus subbijugus Ledeb. 15 _BN01 A17 Astr 21 JDAST019-21 Эндемик останцо-вых низкогорий Кы-зылкума и Нуратин-ских гор, эндемик Узбекистана
69. Astragalus subbijugus Ledeb. 19 _TK20 А16 Astr22 JDAST020-21 Эндемик останцо-вых низкогорий Кы-зылкума и Нуратин-ских гор, эндемик Узбекистана
70. Astragalus terrae-rubrae Butkov 19 _BN47 А21 Astr23 JDAST021-21 Статус 3. Редкий эндемик Юго-Западного Памиро-Алая
71. Astragalus terrae-rubrae Butkov 20_ FB030 А23 Astr24 JDAST022-21 Статус 3. Редкий эндемик Юго-Западного Памиро-Алая
72. Astragalus tibetanus Bunge 20_ FB126 А38 Astr25 JDAST023-21 Эндемик горной Средней Азии
73. Astragalus tibetanus Bunge 20_ FB124 А37 Astr 26 JDAST024-21 Эндемик горной Средней Азии
74. Astragalus urgutinus Lipsky 19 _UF01 А24 Astr 27 JDAST025-21 Эндемик Западного Памиро-Алая
75. Astragalus urgutinus Lipsky 20_ FB132 А32 Astr28 JDAST026-21 Эндемик Западного Памиро-Алая
76. Astragalus xanthomeloides Korovin & Popov 20_ FB109 А26 Astr29 JDAST027-21 Эндемик горной Средней Азии
77. Astragalus xanthomeloides Korovin & Popov 12_TO07 А47 Astr30 JDAST028-21 Эндемик горной Средней Азии
78. Dracocephalum nuratavicum Adyl. 18_AN02 D3 Dracoceph alum02 DRCPH002-21
79. Dracocephalum nuratavicum Adyl. 18_AN02 D3 Dracoceph alum02 DRCPH002-21
80. Dracocephalum nuratavicum Adylov. 20_FB139 D2 Dracoceph alum01 DRCPH001-21
81. Dracocephalum nuratavicum Adylov. 20_FB139 D2 Dracoceph alum01 DRCPH001-21
82. Dracocephalum spinulosum Popov 12_MI07 D12 Dracoceph alum03 DRCPH003-21 Статус 3. Редкий узколокальный эндемик Западного Тянь-Шаня
83. Dracocephalum spinulosum Popov 12_MI08 D13 Dracoceph alum04 DRCPH004-21 Статус 3. Редкий узколокальный эндемик Западного Тянь-Шаня
84. Dracocephalum spinulosum Popov 12_MI07 D12 Dracoceph alum03 DRCPH003-21 Статус 3. Редкий узколокальный эндемик Западного Тянь-Шаня
85. Dracocephalum spinulosum Popov 12_MI08 D13 Dracoceph alum04 DRCPH004-21 Статус 3. Редкий узколокальный эндемик Западного Тянь-Шаня
86. Ferula foetida (Bunge) Regel 20_SHX02 F1 Fer01 APIAC001-21 -
87. Ferula foetida (Bunge) Regel 20_KH004 F4 Fer02 APIAC002-21 -
88. Ferula sumbul (Kauffm.) Hook. f. 20_FB041 F5 Fer03 APIAC003-21 Статус 3. Редкий эндемик Памиро-Алая
89. Ferula sumbul (Kauffm.) Hook. f. 13_T003 F11 Fer04 APIAC004-21 Статус 3. Редкий эндемик Памиро-Алая
90. Ferula tadshikorum Pimenov 20_ХА01 F7 Fer05 APIAC005-21 Статус 3. Эндемик Юго-Западного Па-миро-Алая с сокращающейся численностью
91. Ferula tadshikorum Pimenov 78_N01 F10 Fer06 APIAC006-21 Статус 3. Эндемик Юго-Западного Па-миро-Алая с сокращающейся численностью
92. Hedysarum baldshuanicum B. Fedtsch 19_JI01 H55 Hedy03 HEDY003-21 Эндемик Центральной Азии
93. Hedysarum baldshuanicum B. Fedtsch 19_JI02 H56 Hedy04 HEDY004-21 Эндемик Центральной Азии
94. Hedysarum bucharicum B. Fedtsch. 20_FB008 H2 Hedy01 HEDY001-21 Статус 2. Очень редкий вид Юго-Западного Памиро-Алая
95. Hedysarum bucharicum B. Fedtsch. 19_AA03 H4 Hedy02 HEDY002-21 Статус 2. Очень редкий вид Юго-Западного Памиро-Алая
96. Hedysarum denticulatum Regel & Schmalh. 87_D01 H47 Hedy05 HEDY005-21 Эндемик Центральной Азии
97. Hedysarum denticulatum Regel & Schmalh. 12_T004 H46 Hedy06 HEDY006-21 Эндемик Центральной Азии
98. Hedysarum drobovii Korotkova 20_FB023 H7 Hedy07 HEDY007-21 Статус 1. Редкий узколокальный эндемик Западного Тянь-Шаня
99. Hedysarum drobovii Korotkova 20_FB024 H8 Hedy08 HEDY008-21 Статус 1. Редкий узколокальный эндемик Западного Тянь-Шаня
100. Hedysarum gypsaceum Korotk. 20_JI01 H41 Hedy09 HEDY009-21 Эндемик Центральной Азии
101. Hedysarum gypsaceum Korotk. 20_JI02 H40 Hedy10 HEDY010-21 Эндемик Центральной Азии
102. Hedysarum iomuticum B. Fedtsch. 20_FB146 H10 Hedy11 HEDY011-21 Эндемик Центральной Азии
103. Hedysarum iomuticum B. Fedtsch. 20_FB150 H14 Hedy12 HEDY012-21 Эндемик Центральной Азии
104. Hedysarum jaxarticum Popov 60_PM01 H60 Hedy13 HEDY013-21 Эндемик Центральной Азии
105. Hedysarum jaxarticum Popov 75_Li01 H59 Hedy14 HEDY014-21 Эндемик Центральной Азии
106. Hedysarum magnificum Kudr. 19_T006 H36 Hedy15 HEDY015-21 Статус 3. Редкий вид Юго-Западного Па-миро-Алая, находящийся на грани исчезновения
107. Hedysarum magnificum Kudr. 19_AA10 H34 Hedy16 HEDY016-21 Статус 3. Редкий вид Юго-Западного Па-миро-Алая, находящийся на грани исчезновения
108. Hedysarum mogianicum (B. Fedtsch.) B. Fedtsch. 20_FB152 H16 Hedy17 HEDY017-21 Эндемик Центральной Азии
109. Hedysarum mo-gianicum (B. Fedtsch.) B. Fedtsch. 20_FB156 H20 Hedy18 HEDY018-21 Эндемик Центральной Азии
110. Hedysarum nuratense Popov 20_AF002 H21 Hedy19 HEDY019-21 Эндемик Узбекистана
111. Hedysarum nuratense Popov 20_AF003 H22 Hedy20 HEDY020-21 Эндемик Узбекистана
112. Hedysarum olgae B. Fedtsch. 20_XA02 H43 Hedy21 HEDY021-21 Эндемик Узбекистана
113. Hedysarum olgae B. Fedtsch. 19_JI04 H58 Hedy22 HEDY022-21 Эндемик Узбекистана
114. Hedysarum pskemense Popov ex B. Fedtsch. 19_TK25 Н51 Hedy23 HEDY023-21 Эндемик Центральной Азии
115. Hedysarum pskemense Popov ex B. Fedtsch. 19_TK26 Н52 Hedy243 HEDY024-21 Эндемик Центральной Азии
116. Hedysarum talassicum Nikitina & Sultanova 19_TK24 Н50 Hedy25 HEDY025-21 Эндемик Центральной Азии
117. Hedysarum talassicum Nikitina & Sultanova 19_TK22 Н48 Hedy26 HEDY026-21 Эндемик Центральной Азии
118. Hedysarum taschkendicum Popov 20_FB157 Н25 Hedy27 HEDY027-21 Эндемик Центральной Азии
119. Hedysarum taschkendicum Popov 20_FB160 Н28 Hedy28 HEDY028-21 Эндемик Центральной Азии
120. Hedysarum turkestanicum Regel & Schmalh. 20_TO130 Н38 Hedy29 HEDY029-21 Эндемик Центральной Азии
121. Hedysarum turkestanicum Regel & Schmalh. 20_OE02 Н44 Hedy30 HEDY030-21 Эндемик Центральной Азии
122. Hedysarum uzbekistanicum sp. nova 20_FB072 Н30 Hedy31 HEDY031-21 Новый вид
123. Hedysarum uzbekistanicum sp. nova 20_FB073 Н31 Hedy32 HEDY032-21 Новый вид
124. Salvia drobovii Botsch. 18_KU01 S1 Salvia01 SALVI001-21 -
125. Salvia drobovii Botsch. 18_TK01 S2 Salvia02 SALVI002-21 -
126. Salvia korolkowii Regel et Schmalh. 20_TOB01 S4 Salvia03 SALVI003-21 Статус 2. Редкий эндемик Западного Тянь-Шаня
127. Salvia lilacinocoerulea Nevski 16_ShX01 S7 Salvia04 SALVI004-21 Статус 1. Редкий эндемик Южного Памиро-Алая
128. Salvia margaritae Botsch. 19_AM01 S9 Salvia05 SALVI005-21 Статус 2. Редкий узкий эндемик Алайского хребта
129. Salvia margaritae Botsch. 64_X01 S11 Salvia06 SALVI006-21 Статус 2. Редкий узкий эндемик Алайского хребта
130. Salvia submutica Botsch. & Vved. 20_FB052 S12 Salvia07 SALVI007-21 Статус 2. Редкий узкий реликтовый эндемик Нуратау
131. Salvia submutica Botsch. & Vved. 12_BN02 S13 Salvia08 SALVI008-21 Статус 2. Редкий узкий реликтовый эндемик Нуратау
132. Salvia tianschanica Makhm. 20_FB097 S15 Salvia09 SALVI009-21 Статус 2. Редкий эндемик Западного Тянь-Шаня
133. Salvia tianschanica Makhm. 20_FB102 S22 Salvia10 SALVI010-21 Статус 2. Редкий эндемик Западного Тянь-Шаня
Рис. 2. Визуальная оценка качества ДНК в 1.2%-агарозном геле после инкубирования ПЦР-продукта с ExoSAP-IT™ PCR Product Clean-up для видов Tulipa (а) и Dracocephalum и Hedysarum (б) (праймер rbcL)
Рис. 3. Визуальная оценка качества ДНК в 1.2%-агарозном геле после инкубирования ПЦР-продукта с ExoSAP-IT™ PCR Product (Clean-up для видов Asrtragalus (а) и Dracocephalum и Hedysarum D2-H41 (61 (праймер rbcL-FP/rbcL-RP)
Продукты циклического секвенирования, которые включали целевые последовательности, соли, невстроенные терминаторы красителей, dNTPs, очищали
с использованием набора реактивов BigDye XTerminator™ (Applied Biosystems, Inc., США). Очистка выполнялась менее чем за 40 мин и требовала менее 10 мин работы вручную.
Рабочий раствор для очистки продуктов циклического секвенирования включал 10 мкл раствора BigDye XTerminator, 45 мкл раствора SAM и 10 мкл раствора, содержащего целевую ДНК. Рабочий раствор перемешивали в течение 25 мин на вортексе и затем центрифугировали в течение 5 мин.
Супернатант объемом 1.2 мкл смешивали с 9 мкл Hi-Di формамида (Applied Biosystems, Inc., США), общий объем составлял 10.2 мкл раствора се-квенируемой ДНК. Секвенирование ДНК проводили на автоматическом капиллярном ДНК-секвенаторе ABI PRISM 3500 (Applied Biosystems, США), при этом использовали капилляры длиной 50 см и полимерную матрицу РОР-7™.
Редактирование и выравнивание сиквенсов. Платформа Geneious R10.0.9 [7] была использована для визуализации, редактирования и de novo сборки нуклео-тидных последовательностей. Сгенерированные последовательности выравнивали с помощью программного обеспечения MUSCLE [8] на платформе Geneious R10.0.9. Выравненные нуклеотидные последовательности просматривали с целью исключения пробелов, анализа вставок и делеций. Нуклеотидные последовательности участков ITS2, matK и rbcL далее экспортировали из Geneious R10.0.9 с целью загрузки на портал информационной системы данных BOLD v4 (Barcode of Life Data System) [9].
Оценка эффективности использования нуклеотидных последовательностей для идентифицирования растений проводилась при помощи трех подходов: средства поиска основного локального выравнивания BLAST [10], генетических дистанций и филогенетических методов ближайшего связывания (Neighbor Joining) и максимального правдоподобия (Maximum Likelihood) [11, 12].
Анализ нуклеотидных последовательностей с использованием BLAST.
Для поиска гомологий исследуемых последовательностей с последовательностями, размещенными в международных базах данных, использовали программу анализа нуклеотидных последовательностей BLAST (URL: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/).
Анализ нуклеотидных последовательностей на основе оценки генетических дистанций. Кластеризацию выборок методом невзвешенной попарной группировки UPGMA [13] проводили в программе MEGA6 [14]. Внутри-и межвидовая генетические дистанции рассчитывались для каждого вида внутри рода у двух групп - однодольных и двудольных видов.
Загрузка нуклеотидных последовательностей в системы базы данных
BOLDv4. Barcode of Life Data Systems (BOLD), созданная в 2005 г., является веб-платформой, предназначенной для сбора баркод-информации, обработки и анализа данных (URL: https://v4.boldsystems.org/index.php).
Рис. 4. Вид страницы в системе данных BOLD с гербарным образцом Hedysarum baldshuanicum B. Fedtsch (а) и его сиквенсами 1ТИ2, matK и rHcL (б) и с гербарным образцом Tulipa fosteriana W. Irving (в) и его сиквенсами ITS2, matK и rbcL (г)
В глобальную систему данных BOLD нами загружена информация для 133 образцов 65 видов (рис. 4), занесенных в Красную книгу Республики Узбекистан (2019) [16] и/или являющихся эндемиками. Для каждого образца информация представлена в следующем виде.
A. Информация о ваучере образца (Таксономия вида. Код образца (BOLD), например Tulip05. Код процесса (BOLD), например TULIP005-21. Полевой регистрационный номер образца, например 20_FB160. Название организации, где депонирован ваучер образца. Ф.И.О. коллектора и идентификатора. Дата сбора. Место сбора. Информация об ассоциированных видах, произрастающих в той же ценопопуляции, где собран образец. Информация о фазе развития растения. Полная информация по таксономии вида, включая царство, класс, порядок, семейство, подсемейство, род и вид. GPS координаты места сбора с уточнением времени сбора (утро, день, вечер). Высотность. Метод определения координат. Метод сбора).
Б. Информация о загруженных нуклеотидных последовательностях (Таксономия вида. Код образца (BOLD), например Tulip05. Код процесса (BOLD), например TULIP005-21. Полевой регистрационный номер образца, например 20_IJ001. Дата секвенирования. Направление (Форвард или Реверс). Качество нуклеотидных последовательностей. Принадлежность организации).
После анализа качества нуклеотидных последовательностей присваивается уникальный код BIN для данного образца. Кроме того, загруженные в систему
данных BOLD v4 нуклеотидные последовательности регистрируются в базе данных GenBank.
Результаты исследования
Нуклеотидные последовательности трех ДНК-баркодов 65 видов растений, занесенных в Красную книгу Республики Узбекистан и/или являющихся эндемиками местной флоры или флоры Центральной Азии, были секвенированы и загружены в глобальную систему данных BOLD v4, в том числе 23 однодольных (19 видов рода Tulipa L. и 4 вида рода Iris L.) и 42 двудольных (15 видов рода Astragalus L., 2 вида рода Dracocephalum L., 16 видов рода Hedysarum L., 6 видов рода Salvia L., 3 вида Ferula L.) видов.
Амплификация и секвенирование ДНК образцов. Результаты амплификации трех ДНК-баркодов и их секвенирования различались между собой (см. табл. 3). Выделение ДНК из образцов осуществлялось в трех и более повторно-стях. Отобранные образцы характеризовались высоким качеством ДНК с концентрацией > 50 нг/мкл и отношением показателей преломления A260/A280, равным 1.8 ± 0.1, и A260/A230 - в пределах 1.8-2.2 (см. Приложение). Амплифицируе-мость баркод-участка определялась соотношением количества образцов, нуклео-тидные последовательности которых успешно амплифицированы, к общему числу образцов. Наилучшие показатели амплификации ITS2 участка матрицы ДНК отмечены для видов Iris (100%) и Hedysarum (100%), самые низкие показатели -у Dracocephalum (45%); для ДНК-баркодов rbcL самые высокие показатели зафиксированы для видов Iris (93%), Tulipa (93%) и Hedysarum (93%), самые низкие показатели - у Dracocephalum (36%). Из трех ДНК-баркодов амплификация матрицы ДНК с участием matK дала самый наименьший результат по сравнению с другими двумя участками: амплификация нуклеотидных последовательностей видов Astragalus имела значение 87%, самый низкий показатель выявлен у Dracocephalum (28%). Это связано с высоким содержанием вторичных метаболитов, что отмечалось также в процессе выделения ДНК.
Секвенирование было наиболее успешным для ДНК-баркода rbcL: определены нуклеотидные последовательности 100% исследованных видов Iris, Tulipa, Dracocephalum и Ferula. Для ITS2-участка также отмечаются хорошие результаты: определены нуклеотидные последовательности 80-100% исследованных видов. Сравнительно низкие результаты секвенирования отмечены для всех видов по ДНК-баркоду matK: успешно просеквенированы нуклеотидные последовательности лишь 41-56% исследованных видов (табл. 4).
Вследствие того что матричная ДНК не всех образцов успешно амплифициро-вана и секвенирована из-за высокой загрязненности образцов или высокого содержания вторичных метаболитов, в систему данных BOLD v4 загружены нуклео-тидные последовательности, а также информация по ваучерам 8 образцов 4 видов Iris L. (Iridaceae Juss.), 38 образцов 19 видов Tulipa L. (Liliaceae Juss.), 31 образца
15 видов Astragalus L. (Fabaceae Lindl.), 8 образцов 2 видов Dracocephalum L. (Lamiaceae Martinov), 6 образцов 3 видов Ferula L. (Apiaceae Lindl.), 32 образцов
16 видов Hedysarum L. (Fabaceae Lindl.) и 10 образцов 6 видов Salvia L. (Lamiaceae Martinov). Всего 133 образца 65 видов.
Табл. 3
Показатели степени амплификации и секвенирования трех баркод-зон (%)
Класс Вид ПЦР-амплификация Секвенирование
1ТБ2 гЪсЬ таГК 1ТБ2 гЪсЬ таГК
Однодольные /га Ь. ТыНраЬ. 100 88 93 93 41 82 87 89 100 100 41 54
Astгagalus Ь. 83 89 87 82 93 43
ОгасосеркаЫт Ь. 45 36 28 80 100 41
Двудольные Ееги1а Ь. 80 90 50 100 100 45
Hedysaгum Ь. 100 93 82 83 83 56
БаЫа Ь. 68 82 60 83 83 43
Табл. 4
Успешность идентификации кандидатных ДНК-баркодов на видовом и родовом уровнях с помощью ВЬАБТЫ-анализа
Вид Видовой уровень | Родовой уровень
1ТБ2 гЪсЬ таГК 1ТБ2 гЪсЬ таГК
/га Ь. 20% 15% 16% 74% 90% 87%
ТиНра Ь. 18% 12% 14% 76% 94% 86%
Astгagalus Ь. 11% 14% 10% 80% 94% 84%
ОгасосеркаЫт Ь. 9% 16% 9% 79% 95% 86%
Ееги1а Ь. 12% 15% 8% 89% 90% 88%
Hedysaгum Ь. 14% 17% 15% 86% 89% 85%
БаЫа Ь. 15% 17% 15% 88% 89% 85%
Табл. 5
Нуклеотидная дивергентность и вариабельность ДНК-баркодов, рассчитанные с помощью DNAsp
Вид Нуклеотидная дивергентность, И Доля консервативных сайтов С, % доля полиморфных (сегрегирующих) сайтов Б, %
1ТБ2 гЪсЬ таГК 1ТБ2 гЪсЬ таГК
С Б С Б С Б
/га Ь. 0.07795 0.00178 0.04634 76 24 98.3 1.7 85 15
Т^1ра Ь. 0.07938 0.00191 0.05179 79 21 99.5 0.5 86 14
Astгagalus Ь. 0.08420 0.00132 0.04517 80 20 98 2 84 16
ОгасосеркаЫт Ь. 0.07150 0.00757 0.04271 81 19 98 2 83.2 16.8
ЕвтЬ Ь. 0.06710 0 0.03800 81 19 100 0 81.9 18.1
Hedysaгum Ь. 0.06995 0.00578 0.04238 78 22 97.5 2.5 83 17
БаЫа Ь. 0.06414 0.00142 0.04304 76 24 98.8 1.2 80 20
Полиморфизм и дивергентность ДНК-баркодов. В качестве основных индикаторов генетического разнообразия исследованы значения нуклеотидной ди-вергентности (Р^ и доли консервативных (С) и полиморфных, или сегрегирующих (Б), участков (табл. 5). Наиболее дивергентными оказались участки 1ТБ2 с долей консервативных участков в пределах 76-81%, доля полиморфных участков варьировала в пределах 19-24%. Более консервативными оказались участки гЪ^ с долей консервативных участков в пределах 97.5-100%, вариабельных участков - 0-2.5%. Средние значения были характерны для участков таГК с долей консервативных участков в пределах 81.9-86% и вариабельных участков - 14-20%.
Идентификация видов с использованием BLAST. Поиск идентичных последовательностей в глобальной базе нуклеотидов NCBI осуществлялся с использованием встроенного в Geneious 10.0.9. плагина BLAST. Вследствие того что исследуемые виды занесены в Красную книгу РУз [16], причем многие из них, и работа по изучению нуклеотидных последовательностей данных видов проводилась впервые, поиск на видовом уровне показал низкие результаты. BLAST поиск позволил идентифицировать близкие виды на видовом уровне, принадлежность которых на родовом уровне составила 82-100% для ITS2, 83100% для rbcL и 41-56% для matK.
Обсуждение
Создание электронной базы данных генетического разнообразия редких, исчезающих видов, а также эндемиков флоры, изучение генетического полиморфизма в контексте глобальной международной программы ДНК-штрихкодирования (BoL, Barcode of Life) - идентификации биологических образцов по последовательностям их ДНК - является важным вкладом Республики Узбекистан в документирование генетических ресурсов растений. При выделении ДНК-баркодов использовали только документированный материал, гербарные образцы которого были определены специалистами и зарегистрированы в Национальном гербар-ном фонде TASH (г. Ташкент, Республика Узбекистан).
Применение баркодирования в фармацевтической промышленности позволит избежать потерь, связанных с некорректной идентификацией видов, в дорогостоящих биотехнологических процессах, а природоохранным и таможенным службам - предотвратить бесконтрольный браконьерский сбор сырья из природы, а также идентифицировать присутствие компонентов редких видов, вывозимых из страны.
Нуклеотидные последовательности 133 образцов 65 видов высокого качества были секвенированы с использованием трех пар праймеров ITS2, matK и rbcL. Анализ полиморфизма и нуклеотидной дивергентности по трем ДНК-участкам показал наличие наибольшего количества полиморфных участков для ITS2-региона. BLAST-анализ выявил отсутствие нуклеотидных последовательностей по участкам ITS2, matK и rbcL исследуемых видов. Это объясняется тем, что нуклеотидные последовательности 65 видов, относящихся к 7 родам и 5 семействам флоры Республики Узбекистан, являющиеся в основном видами, занесенными в Красную книгу и/или эндемиками, исследованы и загружены в глобальную систему данных BOLD v4 впервые.
Баркодирование редких видов и/или эндемиков Республики Узбекистан с использованием трех пар праймеров ITS2, matK и rbcL позволяет идентифицировать виды и является универсальным для представителей как однодольных, так и двудольных растений. Необходимо отметить, что участок ITS2 характеризовался более высокими значениями нуклеотидной дивергенции, а также количеством полиморфных участков, способностью легко амплифицироваться и секвениро-ваться.
Благодарности. Авторы благодарят сотрудников Научно-исследовательского института гематологии и переливания крови Министерства здравоохранения Республики Узбекистан за содействие в проведении исследований. Особую благодарность выражаем К.Т. Бабаеву и З.З. Ибрагимову.
Исследования проведены в рамках проекта МКВ-АК-2019-30 «Генетическая инвентаризация редких и исчезающих видов растений Беларуси и Узбекистана с применением технологии ДНК-штрихкодирования», договора 23/2020 между Институтом ботаники и Государственным комитетом РУз по экологии и охране окружающей среды и государственной программы ПФИ-5 «Дерево жизни: однодольные Узбекистана» Института ботаники Академии наук Республики Узбеки-
стан.
Ресурсы
BOLD Barcode of Life Data System (URL: https://v4.boldsystems.org) IRIS003-21, IRIS004-21, IRIS007-21, IRIS001-21, IRIS008-21, IRIS002-21, IRIS005-21, IRIS006-21, TULIP001-21, TULIP002-21, TULIP003-21, TULIP004-21, TULIP005-21, TULIP006-21, TULIP007-21, TULIP009-21, TULIP010-21, TULIP011-21, TULIP012-21, TULIP013-21, TULIP014-21, TULIP015-21, TULIP016-21, TULIP017-21, TULIP018-21, TULIP019-21, TULIP020-21, TULIP021-21, TULIP022-21, TULIP023-21, TULIP024-21, TULIP025-21, TULIP026-21, TULIP027-21, TULIP028-21, TULIP029-21, TULIP030-21, TULIP031-21, TULIP032-21, TULIP033-21, TULIP034-21, TULIP035-21, TULIP036-21, TULIP037-21, TULIP038-21, TULIP008-21, JDAST001-21, JDAST002-21, JDAST003-21, JDAST029-21, JDAST004-21, JDAST005-21, JDAST030-21, JDAST006-21, JDAST007-21, JDAST008-21, JDAST031-21, JDAST009-21, JDAST010-21, JDAST011-21, JDAST012-21, JDAST013-21, JDAST014-21, JDAST015-21, JDAST016-21, JDAST017-21, JDAST018-21, JDAST019-21, JDAST020-21, JDAST021-21, JDAST022-21, JDAST023-21, JDAST024-21, JDAST025-21, JDAST026-21, JDAST027-21, JDAST028-21, DRCPH002-21, DRCPH002-21, DRCPH001-21, DRCPH001-21, DRCPH003-21, DRCPH004-21, DRCPH003-21, DRCPH004-21,
APIAC001-21, HEDY003-21, HEDY007-21, HEDY013-21, HEDY019-21, HEDY025-21, HEDY031-21,
APIAC002-21, HEDY004-21, HEDY008-21, HEDY014-21, HEDY020-21, HEDY026-21, HEDY032-21,
APIAC003-21, HEDY001-21, HEDY009-21, HEDY015-21, HEDY021-21, HEDY027-21, SALVI001-21,
APIAC004-21, HEDY002-21, HEDY010-21, HEDY016-21, HEDY022-21, HEDY028-21, SALVI002-21,
APIAC005-21, HEDY005-21, HEDY011-21, HEDY017-21, HEDY023-21, HEDY029-21, SALVI003-21,
APIAC006-21, HEDY006-21, HEDY012-21, HEDY018-21, HEDY024-21, HEDY030-21, SALVI004-21,
SALVI005-21, SALVI006-21, SALVI007-21, SALVI008-21, SALVI009-21, SALVI010-21
Приложение
Показатели качества ДНК, выделенных методом СТАБ из листьев объектов исследований
№
Код образца
Название вида
(ДНК)
1 T2 T. affinis
2 T66 T. affinis
3 T64 T. affinis
4 T4 T. butkovii
5 T19 T. butkovii
6 T20 T. butkovii
Полевой регистрационный № образца
Концентрация, нг/мкл
A260/A2
A260/A2
I. Tulipa L. Liliaceae Juss, 20_BN13 19_BN64 19_BN62 20_FB063 18_JCh01 18 JCh02
231.50 1.797 1.335
84.250 1.856 1.836
56.400 2.029 1.649
134.55 1.801 1.871
125.70 1.900 1.944
101.15 1.831 2.708
7 T47 T. carinata 14 T0001 117.95 1.958 1.895
8 T46 T. carinata 13_TK001 14.550 1.890 2.064
9 T74 T. carinata 90.000 2.011 1.361
10 T55 T. dasystemon 20 FB137 509.00 2.053 1.612
11 T24 T. dasystemon 19 BN60 124.05 1.919 1.624
12 T54 T. dasystemon 20 FB117 128.00 2.019 1.248
13 T5 T. dubia 20_FB057 341.45 1.878 2.931
14 T22 T. dubia 19 BN58 296.20 1.826 2.136
15 T44 T. dubia 19 BN65 210.45 1.799 2.563
16 T57 T. ferganica 20 TK001 122.70 1.768 1.818
17 T21 T. ferganica 17 JCh08 22.500 1.899 1.619
18 T18 T. ferganica 17 JCh07 118.55 1.937 1.165
19 T57 T. ferganica 20 TK001 122.70 1.768 1.818
20 T16 T. fosteriana 17 BN09 59.600 1.935 1.481
21 T67 T. fosteriana 17 BN07 27.850 2.237 2.048
22 T68 T. fosteriana 17 BN08 144.50 2.179 1.695
23 T69 T. fosteriana 19 Unknown07 36.150 1.965 2.037
24 T49 T. greigii 09 TK001 139.15 1.623 0.757
25 T60 T. greigii 19 LG01 97.950 1.749 1.802
26 T25 T. greigii 19 BN57 127.50 1.916 1.974
27 T42 T. greigii 19_Unknown09 38.050 1.766 1.333
28 T61 T. greigii Unknown03 52.700 1.875 1.327
29 T26 T. ingens 19 BN61 328.25 1.945 1.738
30 T70 T. ingens 19_Unknown10 141.70 1.877 1.849
31 T71 T. ingens 19 Unknown11 216.95 1.929 1.645
32 T30 T. intermedia 17_JCh03 171.55 1.794 1.122
33 T51 T. intermedia 12 TK001 115.25 1.818 1.825
34 T52 T. intermedia 18 Unknown01 426.65 1.759 1.538
35 T31 T. kaufmanniana 19 BN62 169.45 1.801 1.667
36 T33 T. kaufmanniana 19_Unknown02 199.40 1.805 2.329
37 T32 T. kaufmanniana 19 uknown01 65.900 1.755 1.899
38 T72 T. korolkovii 20_T0113 429.95 2.032 2.330
39 T73 T. korolkovii 20_BN07 181.40 1.906 1.695
40 T7 T. korolkowii 20 BN11 405.40 1.878 2.204
41 T8 T. korolkowii 20_BN05 268.00 1.811 2.966
42 T39 T. lanata 19 Unknown04 190.15 2.131 2.316
43 T15 T. lanata 20_FB086 157.40 2.027 1.607
44 T59 T. lanata 20_FB087 97.700 2.108 2.012
45 T10 T. lehmanniana 20 ShX07 260.50 1.861 1.697
46 T34 T. lehmanniana 19 BN56 33.700 2.113 1.867
47 T53 T. lehmanniana 07 TK001 36.650 2.047 1.204
48 T12 T. micheliana 20 BN10 68.400 1.817 2.276
49 T35 T. micheliana 19 BN63 30.400 2.219 1.630
50 T13 T. sharipovii 20_T0126 72.750 1.842 2.263
51 T43 T. sharipovii Unknown01 176.10 1.867 2.652
52 T50 T. sharipovii 09_TK002 186.05 1.774 1.427
53 T36 T. tubergeniana 18 BN02 20.750 1.948 2.331
54 T48 T. tubergeniana 06 I001 57.750 1.769 1.851
55 T48 T. tubergeniana 06_I001 57.750 1.769 1.851
56 T45 T. uzbekistanica Unknown02 235.30 1.479 2.000
57 T45 T. uzbekistanica Unknown02 197.45 1.810 2.729
58 T38 T. uzbekistanica 17 BN05 105.30 2.083 1.839
59 T75 T. uzbekistanica 19 AA06 119.70 2.413 0.840
60 T63 T. vvedenskyi 18 JCh03v 348.15 1.791 1.806
61 T62 T. vvedenskyi 18 JCh02v 200.95 1.866 1.447
62 T41 T. vvedenskyi 18 JCh01v 113.10 1.766 1.981
II. Iris L. Iridaceae Juss.
1 J1 I. hippolyti 19 TK21 359.70 1.835 1.963
2 J2 I. hippolyti 20_ShX16 189.40 1.667 1.948
3 J12 I. magnificum 19 JD31 484.45 1.892 2.402
4 J10 I. magnificum 19 KU09 369.10 1.857 1.301
5 J11 I. magnificum 19 KU04 242.40 1.834 1.037
6 J3 I. orchioides 20_FB043 361.65 1.832 2.074
7 J6 I. orchioides Unknown01 233.25 1.861 1.716
8 J6 I. orchioides unknown1 440.10 1.883 1.853
9 J4 I. orchioides 20 FB044 24.500 1.756 0.203
10 J7 I. svetlanae 19_KU03 124.15 1.854 2.466
11 J8 I. svetlanae 20 TO129 167.55 1.805 1.535
12 J9 I. svetlanae 20 TK001 58.900 1.846 2.866
III. Dracocephalum L. Lamiaceae Martino
1 D1 D. nuratavicum 20 FB138 50.75 1.859 0.657
2 D2 D. nuratavicum 20 FB139 17.4 1.794 0.16
3 D3 D. nuratavicum 18 AN02 27.750 1.751 1.869
4 D8 D. adylovii 18_HI01 357.85 0.795 0.571
5 D9 D. adylovii 11 MI05 255.10 0.878 0.647
6 D10 D. adylovii 11 MI06 469.45 0.807 0.622
7 D5 D. komarovii 20_FB119 54.550 1.658 1.812
8 D6 D. komarovii 20_FB120 33.500 1.900 0.400
9 D11 D. spinulosum 18_AN03 116.00 1.711 1.662
10 D12 D. spinulosum 12_MI07 120.85 1.865 2.769
11 D13 D. spinulosum 12 MI08 129.05 1.852 1.605
IV. Salvia L. Lamiaceae Martinov
1 S1 S. drobovii 18 KU01 59.500 1.712 1.766
2 S2 S. drobovii 18 TK01 52.450 1.597 1.129
3 S1 S. drobovii 18 KU01 76.600 1.800 1.739
4 S2 S. drobovii 18_TK01 43.10 1.980 2.080
5 S25 S. drobovii 9.0500 0.345 0.157
6 S4 S. korolkovii 20_T0B01 93.250 1.557 1.827
7 S27 S. korolkovii 62.800 1.310 1.889
8 S28 S. korolkovii 116.90 1.468 1.527
9 S7 S. lilacinocaerulea 16 ShX01 80.000 1.695 1.841
10 S8 S. lilacinocaerulea 16 ShX02 52.100 1.586 1.923
11 S7 S. lilacinocoerulea 16 ShX01 97.650 1.784 0.793
12 S8 S. lilacinocoerulea 16_ShX02 92.950 1.619 0.600
13 S26 S. lilacinocoerulea 58.150 1.643 1.998
14 S9 S. margaritae 19 AM01 8.3000 1.747 0.206
15 S10 S. margaritae 79 MA01 62.750 1.837 0.583
16 S11 S. margaritae 64 X01 14.450 1.818 0.382
17 S9 S. margaritae 19 AM01 33.800 2.200 1.270
18 S10 S. margaritae 79 MA01 50.70 2.030 0.820
19 S11 S. margaritae 64 X01 75.400 1.870 1.040
20 S12 S. submutica 20_FB052 92.250 2.199 0.679
21 S13 S. submutica 12_BN02 62.350 1.722 0.438
22 S14 S. submutica 98 BN01 55.500 1.606 0.420
23 S18 S. submutica 20_FB046 38.300 1.860 0.980
24 S15 S. tianschanica 20_FB097 41.450 1.768 0.587
25 S16 S. tianschanica 20 FB100 64.650 1.604 0.415
26 S17 S. tianschanica 76_FO01 187.50 1.808 0.952
27 S22 S. tianschanica 20 FB102 34.90 1.900 1.380
28 S17 S. tianschanica 76 P001 232.90 1.842 1.567
Литература
1. Kress W.J., Erickson D.L. (Eds.) DNA Barcodes: Methods and Protocols. - N. Y.: Humana Totowa, 2012. - 485 p. - doi: 10.1007/978-1-61779-591-6.
2. Hebert P.D.N., Penton E.H., Burns J.M., Janzen D.H., Hallwachs W. Ten species in one: DNA barcoding reveals cryptic species in the neotropical skipper butterfly Astraptes fulgerator // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. - 2004. - V. 101, No 41. - P. 14812-14817. doi: 10.1073/pnas.0406166101.
3. Baraloto C., Hardy O.J., Paine C.E.T., Dexter K.G., Cruaud C., Dunning L.T., Gonzalez M.-A., Molino J.-F., Sabatier D., Savolainen V., Chave J. Using functional traits and phylogenetic trees to examine the assembly of tropical tree communities // J. Ecol. -2012. - V. 100, No 3. - P. 690-701. - doi: 10.1111/j.1365-2745.2012.01966.x.
4. Muellner A.N., Schaefer H., Lahaye R. Evaluation of candidate DNA Barcoding loci for economically important timber species of mahogany family (Meliaceae) // Mol. Ecol. Resour. -2011. - V. 11, No 3. - P. 450-460. - doi: 10.1111/j. 1755-0998.2011.02984.x.
5. CBOL Plant Working Group. A DNA barcode for land plants // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. - 2009. - V. 106, No 31. - P. 12794-12797. - doi: 10.1073/pnas.0905845106.
6. Doyle J.J., Doyle J.L. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue // Phytochem. Bull. - 1987. - V. 19, No 1. - P. 11-15.
7. Kearse M., Moir R., Wilson A., Stones-Havas S., Cheung M., Sturrock S., Buxton S., Cooper A., Markowitz S., Duran C., Thierer T., Ashton B., Meintjes P., Drummond A. Geneious Basic: An integrated and extendable desktop software platform for the organization and analysis of sequence data // Bioinformatics. - 2012. - V. 28, No 12. -P. 1647-1649. - doi: 10.1093/bioinformatics/bts199.
8. Edgar R.C. MUSCLE: A multiple sequence alignment method with reduced time and space complexity // BMC Bioinf. - 2004. - V. 5. - Art. 113, P. 1-19. - doi: 10.1186/14712105-5-113.
9. Ratnasingham S., Hebert P.D.N.BOLD: The Barcode of Life Data System (http://www.barcodinglife.org) // Mol. Ecol. Notes. - 2007. - V. 7, No 3. - P. 355-364. -doi: 10.1111/j.1471-8286.2007.01678.x.
10. Altschul S.F., Gish W., Miller W., Myers E. W., Lipman D.J. Basic local alignment search tool // J. Mol. Biol. - 1990. - V. 215, No 3. - P. 403-410. - doi: 10.1016/S0022-2836(05)80360-2.
11. Saitou N., Nei M. The neighbor-joining method: A new method for reconstructing phylogenetic trees // Mol. Biol. Evol. - 1987. - V. 4, No 4. - P. 406-425. - doi: 10.1093/oxfordjournals.molbev.a040454.
12. Haynes W. Maximum likelihood estimation // Dubitzky W., Wolkenhauer O., Cho K.H., Yokota H. (Eds.) Encyclopedia of Systems Biology. - N. Y. Springer, 2013. - P. 11901191. - doi: 10.1007/978-1-4419-9863-7_1235.
13. Nei M. Estimation of average heterozygosity and genetic distance from a small number of individuals // Genetics. - 1978. - V. 89, No 3. - P. 583-590. - doi: 10.1093/genetics/89.3.583.
14. Tamura K., Stecher G., Peterson D., Filipski A., Kumar S. MEGA6: Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 6.0 // Mol. Biol. Evol. - 2013. - V. 30, No 12. -P. 2725-2729. - doi: 10.1093/molbev/mst197.
15. Nylander J.A.A. MrModeltest Version 2. Program Distributed by the Author. - Uppsala: Uppsala Univ., Evol. Biol. Cent., 2004.
16. Красная книга Республики Узбекистан. Т. 1: Растения. - Ташкент: Chinor ENK, 2019. -356 с.
17. Clement W.L., Donoghue M.J. Barcoding success as a function of phylogenetic related-ness in Viburnum, a clade of woody angiosperms // BMC Evol. Biol. - 2012. - V. 12. -Art. 73. P. 1-13. - doi: 10.1186/1471-2148-12-73.
18. Kim W.J., Ji Y., Choi G., Kang Y.M., Yang S., Moon B.C. Molecular identification and phylogenetic analysis of important medicinal plant species in genus Paeonia based on rDNA-ITS, matK, and rbcL DNA barcode sequences // Genet. Mol. Res.: GMR. - 2016. -V. 55, No 3. - P. 1-12. - doi: 10.4238/gmr.15038472.
Поступила в редакцию 09.02.2022
Мустафина Феруза Усмановна, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Институт ботаники Академии наук Республики Узбекистан
ул. Дурмон йули, д. 32, г. Ташкент, 100125, Республика Узбекистан E-mail: mustafinaferuza@yahoo.com
Жамалова Дилафруз Неъматилла кизи, младший научный сотрудник
Институт ботаники Академии наук Республики Узбекистан
ул. Дурмон йули, д. 32, г. Ташкент, 100125, Республика Узбекистан E-mail: dilafruz_jamalova.91@mail.ru
Турдиев Достон Эргаш угли, младший научный сотрудник
Институт ботаники Академии наук Республики Узбекистан
ул. Дурмон йули, д. 32, г. Ташкент, 100125, Республика Узбекистан E-mail: doston. turdiyev. 91@mail. ru
Курбаниязова Гулсауир Танирберген кизи, младший научный сотрудник
Институт ботаники Академии наук Республики Узбекистан
ул. Дурмон йули, д. 32, г. Ташкент, 100125, Республика Узбекистан E-mail: kurbaniyazova94@list.ru
Газиев Алим Джавдетович, специалист
Институт ботаники Академии наук Республики Узбекистан
ул. Дурмон йули, д. 32, г. Ташкент, 100125, Республика Узбекистан E-mail: gazievalim644@gmail. com
Бешко Наталья Юрьевна, кандидат биологических наук, заведующий лабораторией Институт ботаники Академии наук Республики Узбекистан
ул. Дурмон йули, д. 32, г. Ташкент, 100125, Республика Узбекистан E-mail: natalia_beshko@mail.ru
Тожибаев Комилжон Шаробиддинович, доктор биологических наук, заведующий лабораторией Институт ботаники Академии наук Республики Узбекистан
ул. Дурмон йули, д. 32, г. Ташкент, 100125, Республика Узбекистан E-mail: ktojibaev@mail.ru
Ибрагимов Зафар Зокиржонович, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Институт биоорганической химии имени А.С. Садыкова Академии наук Республики Узбекистан
ул Мирзо Улугбека, д. 83, г. Ташкент, 100125, Республика Узбекистан E-mail: z.ibragim@gmail.com
Бобоев Кодиржон Тухтабоевич, доктор биологических наук, заведующий отделением
НИИ гематологии и переливания крови Министерства здравоохранения Республики Узбекистан
массив Чиланзар, квартал 5, г. Ташкент, 100097, Республика Узбекистан E-mail: saboboev@mail.ru
ISSN 2542-064X (Print) ISSN 2500-218X (Online)
UCHENYE ZAPISKI KAZANSKOGO UNIVERSITETA. SERIYA ESTESTVENNYE NAUKI (Proceedings of Kazan University. Natural Sciences Series)
2022, vol. 164, no. 3, pp. 408-437
ORIGINAL ARTICLE
doi: 10.26907/2542-064X.2022.3.408-437
Assessing the Effectiveness of Barcoding for Conservation of Rare Plant Species in the Republic of Uzbekistan
F.U. Mustafina a, D.N. Jamalova a , D.E. Turdiev a , G.T. Kurbaniyazova a , A.Dj. Gaziev a*"", N.Yu. Beshko a""", K.Sh. Tojibaev a***"" Z.Z. Ibragimovb , K.T. Boboevc
aInstitute of Botany, Academy of Sciences of the Republic of Uzbekistan, Tashkent, 100125 Republic of Uzbekistan bA.S. Sadykov Institute ofBioorganic Chemistry, Academy of Sciences of the Republic of Uzbekistan, Tashkent, 100143 Republic of Uzbekistan cResearch Institute of Hematology and Blood Transfusion of the Ministry of Health of the Republic of Uzbekistan, Tashkent, 100097 Uzbekistan E-mail: mustafinaferuza@yahoo.com, dilafruzjamalova.91@mail.ru, doston.turdiyev.91@mail.ru, kurbaniyazova94@list.ru, gazievalim644@gmail.com, natalia_beshko@mail. ru, ktojibaev@mail.ru, z.ibragim@gmail. com,
saboboev@mail. ru
Received February 9, 2022 Abstract
This article presents, for the first time, a reference database of the nucleotide sequences for three DNA barcodes (ITS2, matK, and rbcL) of 65 rare and critically endangered plant species of the Republic of Uzbekistan (133 samples, two samples per species), including 23 monocots and 42 dicots. ITS2 region was proposed as the most variable, easily amplified and sequenced for both monocot and dicot species. Therefore, it was recommended as the main DNA barcode. The obtained reference database uploaded to the BOLD v4 platform should be useful for pharmaceutical companies, environmental and customs offices, as well as for phylogenetic research.
Keywords: barcoding, rare species, endemics, biodiversity conservation, BOLD
Acknowledgments. We thank our colleagues from the Research Institute of Hematology and Blood Transfusion of the Ministry of Health of the Republic of Uzbekistan for their kind cooperation and help. K.T. Babaeva and Z.Z. Ibragimov are specially acknowledged for their valuable contributions.
The study was performed as part of: project MRB-AN-2019-30 "Genetic inventory of rare and endangered plant species in Belarus and Uzbekistan using DNA barcoding technology"; 23/2020 agreement between the Institute of Botany and the State Committee of the Republic of Uzbekistan for Ecology and Nature Conservation; and state project "Tree of life: Monocots of Uzbekistan" (PFI-5) funded by the Institute of Botany, Academy of Sciences of the Republic of Uzbekistan.
Figure Captions
Fig. 1. Studied species: a) Iris orchioides Carrière; b) Iris magnifica Vved.; c) Tulipa butkovii Botschantz.; d) Tulipa dubia Vved.; e) Tulipa greigii Regel.; f) Tulipa ingens Hoog; g) Tulipa kaufmanniana Regel; h) Tulipa lehmanniana Merckl.; i) Tulipa vvedenskyi Botschantz.; j) Tulipa carinata Vved.; k) Tulipa kaufmanniana Regel; l) Astragalus pterocephalus Bunge; m) Astragalus xanthomeloides Korovin & Popov; n) Astragalus pterocephalus Bunge; o) Ferula tadshikorum Pimenov; p) Ferula foetida (Bunge) Regel; q) Hedysarum taschkendicum Popov; r) Ferula tad-shikorum Pimenov.
Fig. 2. Visual assessment of the DNA quality in 1.2% agarose gel after the PCR product treatment with the ExoSAP-IT™ PCR Product Clean-up reagent for species of the following genera: Tulipa (a), Dracocephalum and Hedysarum (b) (primer rbcL).
Fig. 3. Visual assessment of the DNA quality in 1.2% agarose gel after the PCR product treatment with the ExoSAP-IT™ PCR Product Clean-up reagent for species of the following genera: Asrtragalus (a), Dracocephalum and Hedysarum D2-H41 (b) (primer rbcL-FP/rbcL-RP).
Fig. 4. Page on the BOLD platform with the herbarium specimen image of Hedysarum baldshuanicum B. Fedtsch (a) and its ITS2, matK, and rbcL sequences (b), as well as with the herbarium specimen image of Tulipa fosteriana W. Irving (c) and its ITS2, matK, and rbcL sequences (d).
References
1. Kress W.J., Erickson D.L. (Eds.) DNA Barcodes: Methods and Protocols. New York, Humana Totowa, 2012. 485 p. doi: 10.1007/978-1-61779-591-6.
2. Hebert P.D.N., Penton E.H., Burns J.M., Janzen D.H., Hallwachs W. Ten species in one: DNA barcoding reveals cryptic species in the neotropical skipper butterfly Astraptes fulgerator. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 2004, vol. 101, no. 41, pp. 14812-14817. doi: 10.1073/pnas.0406166101.
3. Baraloto C., Hardy O.J., Paine C.E.T., Dexter K.G., Cruaud C., Dunning L.T., Gonzalez M.-A., Molino J.-F., Sabatier D., Savolainen V., Chave J. Using functional traits and phylogenetic trees to examine the assembly of tropical tree communities. J. Ecol., 2012, vol. 100, no. 3, pp. 690-701. doi: 10.1111/j.1365-2745.2012.01966.x.
4. Muellner A.N., Schaefer H., Lahaye R. Evaluation of candidate DNA Barcoding loci for economically important timber species of mahogany family (Meliaceae). Mol. Ecol. Resour., 2011, vol. 11, no. 3, pp. 450-460. doi: 10.1111/j.1755-0998.2011.02984.x.
5. CBOL Plant Working Group. A DNA barcode for land plants. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 2009, vol. 106, no. 31, pp. 12794-12797. doi: 10.1073/pnas.0905845106.
6. Doyle J.J., Doyle J.L. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue. Phytochem. Bull., 1987, vol. 19, no. 1, pp. 11-15.
7. Kearse M., Moir R., Wilson A., Stones-Havas S., Cheung M., Sturrock S., Buxton S., Cooper A., Markowitz S., Duran C., Thierer T., Ashton B., Meintjes P., Drummond A. Geneious Basic: An integrated and extendable desktop software platform for the organization and analysis of sequence data. Bioinformatics, 2012, vol. 28, no. 12, pp. 1647-1649. doi: 10.1093/bioinformatics/bts199.
8. Edgar R.C. MUSCLE: A multiple sequence alignment method with reduced time and space complexity. BMC Bioinf., 2004, vol. 5, art. 113, pp. 1-19. doi: 10.1186/1471-2105-5-113.
9. Ratnasingham S., Hebert P.D.N. BOLD: The Barcode of Life Data System (http://www.barcodinglife.org). Mol. Ecol. Notes, 2007, vol. 7, no. 3, pp. 355-364. doi: 10.1111/j.1471-8286.2007.01678.x.
10. Altschul S.F., Gish W., Miller W., Myers E.W., Lipman D.J. Basic local alignment search tool. J. Mol. Biol, 1990, vol. 215, no. 3, pp. 403-410. doi: 10.1016/S0022-2836(05)80360-2.
11. Saitou N., Nei M. The neighbor-joining method: A new method for reconstructing phylogenetic trees. Mol. Biol. Evol, 1987, vol. 4, no. 4, pp. 406-425. doi: 10.1093/oxfordjournals.molbev.a040454.
12. Haynes W. Maximum likelihood estimation. In: Dubitzky W., Wolkenhauer O., Cho K.H., Yokota H. (Eds.) Encyclopedia of Systems Biology. New York, Springer, 2013, pp. 1190-1191. doi: 10.1007/978-1-4419-9863-7_1235.
13. Nei M. Estimation of average heterozygosity and genetic distance from a small number of individuals. Genetics, 1978, vol. 89, no. 3, pp. 583-590. doi: 10.1093/genetics/89.3.583.
14. Tamura K., Stecher G., Peterson D., Filipski A., Kumar S. MEGA6: Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 6.0. Mol. Biol. Evol., 2013, vol. 30, no. 12, pp. 2725-2729. doi: 10.1093/molbev/mst197.
15. Nylander J.A.A. MrModeltest Version 2. Program Distributed by the Author. Uppsala, Uppsala Univ., Evol. Biol. Cent., 2004.
16. Krasnaya kniga Respubliki Uzbekistan [Red Book of the Republic of Uzbekistan]. Vol. 1: Plants. Tashkent, Chinor ENK, 2019. 356 p. (In Russian)
17. Clement W.L., Donoghue M.J. Barcoding success as a function of phylogenetic relatedness in Viburnum, a clade of woody angiosperms. BMC Evol. Biol., 2012, vol. 12, art. 73, pp. 1-13. doi: 10.1186/1471-2148-12-73.
18. Kim W.J., Ji Y., Choi G., Kang Y.M., Yang S., Moon B.C. Molecular identification and phylogenetic analysis of important medicinal plant species in genus Paeonia based on rDNA-ITS, matK, and rbcL DNA barcode sequences. Genet. Mol. Res.: GMR, 2016, vol. 55, no. 3, pp. 1-12. doi: 10.4238/gmr.15038472.
Для цитирования: Мустафина Ф.У., Жамалова Д.Н., Турдиев Д.Э., Курбаниязова Г.Т., Газиев А.Дж., Бешко Н.Ю., Тожибаев К.Ш., Ибрагимов З.З., Бобоев К.Т. Оценка эффективности использования баркодирования для сохранения редких видов флоры Республики Узбекистан // Учен. зап. Казан. ун-та. Сер. Естеств. науки. - 2022. - Т. 164, кн. 3. - С. 408-437. - doi: 10.26907/2542-064X.2022.3.408-437.
For citation: Mustafina F.U., Jamalova D.N., Turdiev D.E., Kurbaniyazova G.T., Ga-ziev A.Dj., Beshko N.Yu., Tojibaev K.Sh., Ibragimov Z.Z., Boboev K.T. Assessing the effectiveness of barcoding for conservation of rare plant species in the Republic of Uzbekistan. Uchenye Zapiski Kazanskogo Universiteta. Seriya Estestvennye Nauki, 2022, vol. 164, no. 3, pp. 408-437. doi: 10.26907/2542-064X.2022.3.408-437. (In Russian)
