CC BY
4
УДК 539.23, 529.266
Волков Ю.О., Асадчиков В.Е., Рощин Б.С., Нуждин А.Д., Тихонов А.М.
ДИНАМИКА СТРУКТУРЫ ЛАМЕЛЛЯРНЫХ МУЛЬТИСЛОЁВ ФОСФОЛИПИДОВ НА ЖИДКОСТИ ПО ДАННЫМ СИНХРОТРОННОЙ РЕНТГЕНОВСКОЙ РЕФЛЕКТОМЕТРИИ
Волков Юрий Олегович1 — старший научный сотрудник; volkov.y@crys.ras.ru Асадчиков Виктор Евгеньевич1 — и.о. главного научного сотрудника, заведующий лабораторией; Рощин Борис Сергеевич1 — старший научный сотрудник; Нуждин Александр Дмитриевич1 — научный сотрудник;
1 ФНИЦ «Кристаллография и фотоника» РАН, Россия, Москва, 119333, Ленинский проспект, дом 57. Тихонов Алексей Михайлович2 — ведущий научный сотрудник;
2 Институт Физических Проблем им. П.Л. Капицы РАН, Россия, Москва, 119334, ул. Косыгина, 2.
В статье рассмотрено изменение структуры упорядоченных многослойных ламеллярных плёнок фосфолипидов дистеаройл-фосфатидилхолина и димиристойл-фосфатидилсерина, сформированных на поверхности коллоидного раствора кремнезёма, в ходе термотропного фазового перехода плавления, по данным рентгеновской рефлектометрии на синхротронном источнике.
Ключевые слова: многослойные структуры, органические пленки, рентгеновская рефлектометрия
STRUCTURAL DYNAMICS OF LAMELLAR MULTILAYERS OF PHOSPHOLIPIDS ON A LIQUID BY SYNCHROTRON X-RAY REFLECTOMETRY DATA
Volkov Y.O.1, Asadchikov V.E.1, Roshchin B.S.1, Nuzhdin A.D.1, Tikhonov A.M.2
1 FSRC "Crystallography and photonics" RAS, Moscow, Russian Federation
2 P.L. Kapitza Institute for Physical Problems RAS, Moscow, Russian Federation
The article discusses structural changes in ordered multilayer lamellar films of phospholipids distearoyl-phosphatidylcholine and dimyristoyl-phosphatidylserine, formed on a surface of colloidal silica solution, during thermotropic melting phase transition, according to data obtained with synchrotron X-ray reflectometry. Key words: multilayer structures, organic films, X-ray reflectometry
Введение
Фосфолипидные бислои в жидкой среде представляют собой простейшую модель биологической мембраны для биофизических исследований. Однако проблема характеризации таких структур осложняется свойством липидов формировать в водных средах макроскопические трёхмерные агрегаты — мицеллы и липосомы. Ввиду этого плоские образцы липидных слоёв, как правило, формируются на твердотельных подложках либо методом Ленгмюра-Блоджетт, либо конденсацией липосом [1].
Ранее было показано [2], что на поверхности коллоидных водных растворов наночастиц оксида кремния (кремнезолей) благодаря уникальным граничным условиям (градиенту поверхностного потенциала) возможно формировать
макроскопически плоские упорядоченные слои фосфолипидов. В частности, геометрические параметры таких структур (толщину и количество бислоёв) можно изменять, варьируя pH жидкой субфазы. В свою очередь, неразрушающие поверхностно-чувствительные методы, основанные на отражении и рассеянии рентгеновского излучения в скользящем падении, позволяют получить информацию о строении макроскопических плёнок (в том числе жидкофазных) с пространственным разрешением до единиц ангстрем [3].
В настоящей работе было исследовано термотропное поведение ламеллярных мультислоёв фосфолипидов 1,2-дистеаройл-sn-глицеро-3 -
фосфохолина C44H88NO8P (DSPC) и 1,2-димиристойл-sn-глицеро-З -фосфо^-серина C34H65NO1oPNa
(DMPS), сформированных на поверхности кремнезоля 5-нм наночастиц SiO2. Оба липида при повышении температуры выше критического значения Tc = 55°C и 37°С соответственно претерпевают фазовый переход плавления, с переходом структуры в объёме в жидкое состояние [4]. Информация о распределении плотности образцов по глубине была получена методом рентгеновской рефлектометрии — измерением коэффициента зеркального отражения при различных углах скольжения. Информация о поверхностной упаковке липидных молекул была получена методом скользящей дифракции — измерением интенсивности рассеянного излучения в азимутальной плоскости при фиксированном угле падения.
Материалы и методы
Образцы липидных плёнок приготавливались капельным методом во фторопластовой тарелке диаметром 100 мм, размещённой в герметизируемом одноступенчатом термостате [5] с точностью по температуре в пределах 0.5°C. Раствор липида в хлороформе (Avanti Polar Lipids) наносился
калиброванным шприцом на поверхность кремнезоля (Ludox, диаметр наночастиц ~5 нм, объёмная концентрация ~16%, рН ~ 9.5). После приготовления образец выдерживался при температуре 23 °С в течение часа для стабилизации исходной плёнки. Последующие измерения проводились в интервале температур от 23°С до 60°С.
о.оо
0.12
0.24
.0.36
^ [А1]
0.48
0.60
0.00
0.12
0.24
0.36
0.48
0.60
[А"1]
Рис.1. Экспериментальные (точки) и расчётные (линии) кривые отражения, измеренные для мультислоёв фосфолипида DSPC (а) и DMPS (б) при температурах выше и ниже точки плавления. Для ясности кривые смещены по вертикали.
Рентгеновские измерения проводились на станции ГО31 синхротрона ESRF [6] при энергии фотонов 71 кэВ (длина волны 1 ~ 0.175 А). Пучок сечением 10x250 мкм обеспечивал интегральную интенсивность 10 ~ 1010 имп/с. Экспериментальные зависимости коэффициента отражения R = 1ехр/Ь от волнового вектора рассеяния qz = 4тата/Х (где а = в — углы скольжения и отражения), полученные при температурах ниже и выше критической температуры плавления Тс, представлены на Рис. 1.
Анализ экспериментальных данных и расчёт распределений плотности по глубине проводились в рамках модельно-независимого подхода [7], основанного на экстраполяции асимптотики угловой зависимости отражения в область больших qz. Ключевое преимущество подхода заключено в том, что он не требует априорных предположений о внутренней структуре образца и позволяет извлечь распределение плотности по глубине р^) непосредственно. Рассчитанные распределения плотности приведены на Рис. 2. Далее для оценки количественных структурных параметров профили р^) были аппроксимированы стандартными структурными моделями липидного бислоя [2]. Полученные параметры приведены в Табл. 1.
1.4
1.2
1.0
г
о..
.0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
б)
40°С I
23°С ^
-500
-400
-300
-200 2 [А]
-100
100
Рис. 2. Распределения плотности по глубине, нормированные на табличную электронную плотности воды р„ = 0.333 А~3, рассчитанные по данным рефлектометрии для мультислоёв фосфолипида DSPC (а) и DMPS (б) при температурах выше и ниже точки плавления. Для ясности кривые смещены по вертикали на 0.2.
Таблица 1. Оценочные структурные параметры липидных слоёв
липид T Lh, A Ph/pw Lt, A Pt/pw Oeff, A A, A2 Гн20
DSPC 23°C 15.3 1.38 10.5 1.01 3.6 41.6 2±1
58°C 9.1 1.12 17.5 0.97 5.2 — 3±2
DMPS 23°C 11.6 1.53 14.7 1.03 3.8 40.8 5±1
40°C 12.8 1.27 12.1 0.92 >10 — 14±1
Результаты и обсуждение
Как следует из полученных распределений плотности, при нормальных условиях (Т < Тс) плёнки обоих липидов формируют упорядоченный мультислой, состоящий из совокупности ламеллярных бислоёв. Отметим, что липид DSPC формирует достаточно плотную периодическую структуру, в то время как в плёнке липида DMPS бислои, по-видимому, отделены друг от друга прослойками несвязанной воды. Такое качественное различие потенциально значимо для моделирования липидных мембран и требует более тщательного изучения. Также на поверхности плёнки DMPS, по-видимому, присутствует дополнительный
упорядоченный монослой, аналогичный
ленгмюровскому. Оценочное значение площади на молекулу липида А по данным скользящей дифракции составляет 41.6 А2 для липида DSPC и 40.8 А2 для липида DMPS, что соответствует известным в литературе значениям для жидкокристаллической ленгмюровской фазы; в сочетании с оценочными структурными параметрами это указывает на высокую упорядоченность молекул липида в мультислоях. При этом характерная степень гидратации Г (число молекул воды в пересчёте на каждую молекулу липида, аккумулированных непосредственно в объёме бислоя) составляет ~2 для плёнки DSPC и ~5 для плёнки DMPS.
При температуре Т > Тс в результате плавления заметно существенное сокращение плотности в приповерхностном липидном монослое и разрушение глубинных бислоёв. При этом оценочная структурная плотность полярных групп рь в бислое существенно снижается, а параметр межслойной шероховатости ое£т возрастает, что также свидетельствует о разупорядочении структуры. Отметим, что для липида DMPS оценочное значение Оег в жидкой фазе существенно превосходит физически допустимое по модели шероховатости капиллярных волн [8] при сохранении интегральной
плотности алифатических хвостов, что может быть объяснено дополнительной гидратацией молекул липида в жидкой фазе (Г ~ 15).
Авторы выражают благодарность В. Хонкимаки (ESRF) за помощь в проведении экспериментов, а также И.В, Кожевникову (ФНИЦ КиФ РАН), Х. Райхерту (ESRF) и Ю.А. Ермакову (ИФХЭ РАН) за полезные обсуждения результатов работы. Эксперименты на станции ID31 проводились в рамках проектов ESRF SC4246 и SC4461.
Список литературы
1. Theato P.; Zentel R. Formation of Lipid Bilayers on a New Amphiphilic Polymer Support. // Langmuir -2000 - V. 16 - P. 1801.
2. Тихонов А.М. Мультислой фосфолипидных мембран на гидрозольной подложке. // Письма в ЖЭТФ - 2010 - Т. 92 - С. 394.
3. Delcea M.; Helm C.A. X-ray and Neutron Reflectometry of Thin Films at Liquid Interfaces. // Langmuir - 2019 - Vol. 35 - P. 8519.
4. Small D.M. The Physical Chemistry of Lipids. NY: Plenum Press, 1986. — 672 pp.
5. Тихонов А.М. Термостатная камера для рентгеновских исследованийтонкоплёночных структур на жидких подложках. // Приборы и техника эксперимента - 2021 - №1 - С. 146.
6. Honkimaki V.; Reichert H.; Okasinski J.S.; Dosch H. X-ray Optics for Liquid Surface/Interface Spectrometers. // J. Synchrotron Radiation - 2006 - V. 13 - P. 426.
7. Kozhevnikov I.V.; Peverini L.; Ziegler E. Development of a Self-consistent Free-form Approach for Studying the Three-dimensional Morphology of a Thin Film // Physical Review B - 2012 - V. 85 - Iss. 12 - P. 125439.
8. Braslau A.; Deutsch M.; Pershan P.S.; Weiss A.H.; Als-Nielsen J.; Bohr J. Surface Roughness of Water Measured by X-ray Reflectivity. // Physical Review Letters - 1985 - V. 54 - P. 114.
