CC BY
82
УДК 577.125.158:612.015.1:542
Л.С. Колесниченко, Т.М. Баторова
ДИНАМИКА ПОКАЗАТЕЛЕЙ ПОЛ И АНТИОКСИДАНТНОЙ СИСТЕМЫ ГЛУТАТИОНА МЫШЕЙ ПРИ ВОЗДЕЙСТВИИ ПРЕПАРАТА ЖЕЛЕЗА
Иркутский государственный медицинский университет (Иркутск)
Исследовано влияние введения железосодержащего комплекса феррум лек (ФЛ) в различных дозах на перекисное окисление липидов и систему глутатиона печени и почек мышей. Выявлены, значительные изменения оксидантной и антиоксидантной. систем. Многие нарушения, уменьшаются, или. полностью предупреждаются, при. совместном введении с липоевой кислотой.
Ключевые слова: феррум лек, перекисное окисление липидов, система глутатиона, липоевая кислота
DYNAMICS OF INDICES OF LIPID PEROXIDATION AND ANTIOXIDANT GLUTATHIONE SYSTEM IN MICE AT THE EFFECT OF FERRUM PREPARATION
L.S. Kolesnichenko, T.M. Batorova
Irkutsk State Medical University, Irkutsk
The effect of ferrum-containing complex Ferrum Lek (PL) injection in various doses on the lipid, peroxidation and glutathione system, of liver and kidneys of mice was studied. Significant changes in the oxidant and. antioxidant systems have been revealed. Combined, injection of PL and. lipoic acid, decrease or prevents many negative changes.
Key words: Ferrum Lek, lipid peroxidation, glutathione system, lipoic acid
Число людей с дефицитом железа в мире, по данным ВОЗ, достигает 200 млн. человек. Ключевым компонентом стандарта лечения больных железодефицитной анемией (ЖДА) является терапия препаратами железа. Одной из функций железа является образование активных форм кислорода, которые выполняют двойную функцию: в низких концентрациях стимулируют защитные силы клеток, а в высоких — приводят к развитию окси-дативного стресса, окислительной модификации многих клеточных структур и, как следствие, к повреждению генетического аппарата клетки [4 — 7, 9, 10]. Защиту тканей от оксидативного стресса осуществляют антиоксиданты и, в первую очередь, система глутатиона [1, 2].
Поэтому изучение безопасности и возможных негативных воздействий на различные системы организма препаратов железа имеет большое научно-практическое значение.
Целью нашей работы было изучение динамики показателей перекисного окисления липидов, концентрации глутатиона и активности ферментов его метаболизма в органах экспериментальных животных при введении железосодержащего комплекса — феррум лек (ФЛ) — и разработка возможных методов коррекции.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Эксперименты проведены на 89 белых беспородных мышах разного пола. Грызунов получали из питомника Ангарского НИИ медицины труда и экологии человека СО РАМН. В опытах мыши были разделены на 8 групп: первая группа мышей — контрольная, остальным группам вводили парентерально ФЛ в разных дозах — 5, 15, 30 и 75 мг в сутки — в течение недели отдельно и со-
вместно с курсовым введением внутрибрюшинно альфа-липоевой кислоты (ЛК) в дозе 25 мг/кг в сутки. По прошествии указанного времени животных декапитировали под эфирным наркозом. Для анализа использовали супернатант печени и почек, подготовленный по общепринятым методам. Исследования были проведены с соблюдением международных стандартов и биоэтических норм, в соответствии с «Международными рекомендациями по проведению биомедицинских исследований с использованием животных» принятыми Международным советом медицинских научных обществ (CIOMS) в 1985 г., одобрено Локальным этическим комитетом 19.05.2010 г.
Концентрацию восстановленного глутатиона (GSH) и активность ферментов его метаболизма: глутатионтрансферазы (ГТ), глутатионперокси-дазы (ГПО), глутатионредуктазы (ГР) и гамма-глутамилтрансферазы (ГГТ) — определяли стандартными спектрофотометрическими методами [1, 3]. Концентрацию производных тиобарбитуровой кислоты (TBARS) как маркера перекисного окисления липидов в печени и почках мышей измеряли по методу J. Stocks [8]. Все результаты статистически обработаны с использованием критериев F, t-Стьюдента и t-Велча. Описаны только значимые изменения (P < 0,05).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Проведенное комплексное изучение динамики показателей перекисного окисления и системы глутатиона при введении ФЛ позволило выявить активацию перекисного окисления и дестабилизацию системы глутатиона. Показано, что концентрация TBARS и показатели системы глутатиона изменялись в зависимости от дозы
вводимого препарата. Так, при введении ФЛ в дозе 5 мг наблюдалось повышение содержания TBARS в печени на 57 %, снижение концентрации GSH в почках на 32 %. Дальнейшее увеличение дозы вводимого лекарственного препарата сопровождалось синхронным увеличением содержания TBARS и снижением концентрации GSH. При дозе 15 мг наблюдалось повышение концентрации TBARS в печени на 189 %, в почках — на 61 %, снижение концентрации GSH в печени на 35 %, в почках — на 46 %; при дозе 30 мг — повышение концентрации TBARS в печени на 181 %, в почках — на 73 %, снижение содержания GSH в печени — на 66 %, в почках — на 51 %. Введение ФЛ в дозе 75 мг сопровождалось резким повышением концентрации TBARS в печени на 385 %, в почках — на 141 %, снижением концентрации GSH в печени на 77 %, в почках — на 65 % (табл. 1).
Введение ФЛ повышает активность ГР в печени: в дозе 5 мг — на 42 %, в дозе 15 — 30 мг — на 63 % и в дозе 75 мг — на 126 %, в почках вначале происходит увеличение активности ГР — на 71 %, но уже начиная с дозы 15 мг происходит снижение активности ГР на 31—41 %. Активность ГТ в
печени увеличивается только при дозе 75 мг на 54 %, тогда как в почках повышение активности ГТ начинается уже с дозы 5 мг — 54 %, сохраняется при дозе 15 мг и увеличивается до 98 % при 30 мг, и наиболее выраженные изменения происходят при введении 75 мг — 182 %. Активность ГПО в печени увеличивается только при высоких дозах (30 и 75 мг) на 29 — 42 %, тогда как в почках происходит снижение активности ГПО уже при дозе ФЛ 5 мг и сохраняется сниженной от 16 до 28 % при увеличении дозы. Активность ГГТ, единственного фермента, разрушающего GSH, резко увеличивается в печени, начиная с дозы 15 мг, соответственно, на 209 — 347 %. В почках активность ГГТ снижается уже в дозе 5 мг, и это снижение сохраняется (40 — 63 %) при введении всех исследуемых доз (табл. 2, 3).
В печени снижение концентрации GSH хорошо коррелирует с увеличением активности ГГТ. Низкая концентрация GSH может индуцировать синтез ГР, однако повышение активности ГР не приводит к восстановлению концентрации GSH, что, вероятно, может быть связано с нарушением пентозофосфатного пути, главного источника
Таблица 1
Влияние различных доз ФЛ на концентрацию глутатиона и содержание продуктов ПОЛ
в печени и почках мышей
Препарат Печень Почки
GSH (ммоль/г ткани) MDA (по экстинкции) GSH (ммоль/г ткани) MDA (по экстинкции)
Контроль 6,З8 ± О,17 (17) О,О5З ± О,ОО4 (17) З,88 ± О,О9 (17) О,О71 ± О,ООЗ (17)
5 мг ФЛ 6,46 ± О,14 (1О) О,О8З ± О,О17** (1О) 2,64 ± 0,27*** (1О) О,О89 ± О,О1З (1О)
15 мг ФЛ 4,12 ± О,ЗЗ*** (8) О,15З ± О,О15*** (8) 2,11 ± О,46** (7) О,114 ± О,ОО4*** (8)
ЗО мг ФЛ 2,18 ± 0,19*** (9) О,149 ± О,О17*** (9) 1,89 ± О,ЗО*** (8) О,12З ± О,О15** (8)
75 мг ФЛ 1,46 ± О,О8*** (12) О,257 ± О,О27*** (12) 1,З6 ± О,1О***(12) О,171 ± О,О1З*** (11)
ЛК + 15 мг ФЛ 6,З9 ± О,З9ь (1З) О,О89 ± О,ОО5***; b (1З) 2,7З ± О,О9*** (12) О,О71 ± О,ОО2ь (12)
ЛК + ЗО мг ФЛ З,5З ± О,2З***; c (1О) О,О91 ± О,ОО4***; b (1О) 2,59 ± О,О8*; а (9) О,О88 ± О,ОО1***; a (9)
ЛК + 75 мг ФЛ 2,22 ± О,З8*** (1О) О,19О ± О,О29*** (1О) 2,47 ± О,О4***; a (9) О,О99 ± О,ОО9**; b (9)
Примечание (здесь и далее): в скобках - количество мышей в опытах; значимость различий с контролем: * - p < 0,05,
** - p < 0,01, *** - p < 0,001; значимость различий между сериями: а - p < 0,05, ь - p < 0,01, с - p < 0,001.
Таблица 2
Динамика изменений активности ферментов в печени мышей при введении ФЛ в различных дозах
Препарат ГР ГТ ГПО ГГТ
Контроль З1,8 ± 1,28 (17) 1284 ± 118 (17) 75,З ± 8,О7 (17) 4О7 ± 44,2 (17)
5 мг ФЛ 45,1 ± З,З5** (1О) 124О ± 1З2 (1О) 89,6 ± 2З,4 (1О) З54 ± 69,О (1О)
15 мг ФЛ 51,9 ± 9,16* (8) 145З ± 1З8 (8) 82,6 ± 17,9 (8) 1257 ± 146*** (8)
ЗО мг ФЛ 51,7 ± 2,6О* (9) 157О ± 125 (9) 97,1 ± 8,15* (9) 1748 ± 178*** (9)
75 мг ФЛ 71,8 ± 1,61*** (12) 197З ± 119** (12) 1О7 ± 8,О9** (12) 1818 ± 1З6*** (12)
ЛК + 15 мг ФЛ 29,4 ± 1,74а (1З) 961 ± 74,9*; ь (1З) 7З,О ± 5,67 (1З) З45 ± 28,1е (1З)
ЛК + ЗО мг ФЛ З8,7 ± 2,9Оа (1О) 1181 ± 164 (1О) 69,7 ± 7,24а (1О) 478 ± 52,5е (1О)
ЛК + 75 мг ФЛ 51,9 ± 4,29*; с (1О) 1462 ± 142а (1 О) 66,5 ± 9,8Зь (1О) 51З ± 61,8е (1О)
Примечание: в таблицах 2 и 3 активность ферментов выражена в нмоль/мин на 1 мг белка; активность ГГТ выражена в печени в нмоль на 1 мг белка; в почках - в мкмоль на 1 мг белка.
Таблица 3
Динамика изменений активности ферментов в почках мышей при введении ФЛ в различных дозах
Препарат ГР ГТ ГПО ГГТ
Контроль 84,8 ± 4,08 (17) 408 ± 26,6 (17) 142 ± 6,74 (17) 215 ± 28,5 (17)
5 мг ФЛ 145 ± 14,7** (10) 627 ± 58,0** (10) 116 ± 9,98*** (10) 129 ± 10,0** (10)
15 мг ФЛ 50,9 ± 13,7** (8) 563 ± 32,5** (8) 119 ± 3,07** (8) 78,9 ± 5,89*** (8)
30 мг ФЛ 58,9 ± 10,2** (9) 808 ± 42,0*** (9) 136 ± 11,0 (9) 84,5 ± 12,5*** (9)
75 мг ФЛ 50,4 ± 7,61** (12) 1149 ± 27,8*** (12) 102 ± 7,04** (12) 127 ± 19,9* (12)
ЛК + 15 мг ФЛ 76,1 ± 5,98**; c (13) 602 ± 67,3** (13) 135 ± 11,3 (13) 135 ± 20,6*; a (13)
ЛК + 30 мг ФЛ 61,0 ± 7,58** (10) 658 ± 21,4***; a (10) 137 ± 7,08 (10) 107 ± 10,1** (10)
ЛК + 75 мг ФЛ 68,4 ± 8,01** (10) 997 ± 28,3***; c (10) 131 ± 11,2 (10) 160 ± 28,9 (10)
НАДФН. Умеренное повышение активности ГТ и ГПО в печени может быть результатом индукции активными формами окислительного стресса, и это можно рассматривать как благоприятный фактор. В почках происходит значительное увеличение активности ГТ, что, безусловно, является результатом индукции. Отличия ГТ в двух органах, вероятно, могут быть связаны с содержанием разных изоферментов в печени и почках. Еще более резкие изменения связаны с другими ферментами. В почках, в отличие от печени, изначально высокая активность ГГТ, поэтому снижение активности ГГТ можно рассматривать как компенсаторное сохранение концентрации GSH, снижение активности ГР и ГПО тоже может свидетельствовать о минимизации процессов и адаптации. Таким образом, выявлены тканевые различия в действии ФЛ на активность ГР, ГПО и ГГТ. Введение высоких доз ФЛ вызывает выраженный оксидативный стресс, сопровождающийся активным процессом перекисного окисления липидов (высокая концентрация ТВАЯЗ) и низкой концентрацией GSH в печени и в почках, в печени это усиливается высокой активностью ГГТ, а в почках — снижением активности ГР и ГПО.
Присоединение ЛК нормализует изменения концентрации GSH в печени при введении 15 мг ФЛ, уменьшает снижение с 66 % до 45 % при 30 мг ФЛ и с 77 % до 65 % при введении 75 мг ФЛ. При этом повышение концентрации ТВАRS в печени значительно снижается, так, при введении 15 мг ФЛ увеличение составляет 40 % вместо 189 %, при 30 мг — 72 % вместо 181 % и при 75 мг — 258 % вместо 385 %. Активность ГР в печени и в почках нормализуется при совместном введении ЛК и ФЛ в дозе 15 мг, но сохраняется повышенной в печени и сниженной в почках при использовании более высоких доз. Активность ГТ в печени снижается при совместном введении ЛК с ФЛ на 26 % и нормализуется при введении 75 мг ФЛ, в почках повышение сохраняется, но становится менее выраженным. Активность ГПО нормализуется в печени и почках при всех дозах ФЛ. Активность ГГТ в печени нормализуется при всех исследованных дозах, в
почках сохраняется сниженной, но становится менее выраженной.
ВЫВОДЫ
1. Введение ФЛ сопровождается признаками активного окислительного стресса, дестабилизацией системы глутатиона в печени и почках, проявляющейся снижением концентрации GSH, изменением активности ГР, ГПО, ГТ и ГГТ.
2. ЛК при совместном введении с ФЛ значительно снижает активацию ПОЛ и нормализует активность ГГТ в печени.
3. Введение ЛК сглаживает снижение и/или увеличение активности всех трех ферментов метаболизма глутатиона, потенцируя работу системы глутатиона. Таким образом, ЛК обладает позитивным влиянием на систему глутатиона.
ЛИТЕРАТУРА
1. Кулинский В.И., Колесниченко Л.С. Биологическая роль глутатиона // Успехи современной биологии. - 1990. - Т. 110, № 1 (4). - С. 20-33.
2. Кулинский В.И., Колесниченко Л.С. Система глутатиона I. Синтез, транспорт, глутатионтранс-феразы, глутатионпероксидазы. // Биомедицинская химия. - 2009. - № 3. - С. 255-277.
3. Anderson M.E. Enzymatic and chemical methods for the determination of glutathione // N.-Y., 1989. - Pt. A. - P. 339-366.
4. Hodkova A., Cerna P., Kotyzova D., Eybl V. The effect of iron (III) on the activity of selenoenzymes and oxidative damage in the liver of rats. Interaction with natural antioxidants and deferiprone // Hemoglobin. - 2010. - Vol. 34 (3). - P. 278-283.
5. Kew MC. Hepatic iron overload and hepatocellular carcinoma // Cancer Lett. - 2009. -Vol. 286 (1). - P. 38-43.
6. King S.M., Donangelo C.M., Knutson M.D., Walter P.B. et al. Daily supplementation with iron increases lipid peroxidation in young women with low iron stores // Exp. Biol. Med. (Maywood). - 2008. -Vol. 233 (6). - P. 701 -707.
7. Pardo A.G.L., Inada N.M., Vercesi A.E., Curti C. Uncoupling and oxidative stress in liver mitochondria isolated from rats with acute iron overload // Arch. Toxicol. - 2009. - Vol. 83 (1). - P. 47-53.
8. Stocks J., Gutteridge J.M., Sharp R.J. et al. Assay using brain homogenate for measuring the antioxidant activity of biological fluids // Clin. Sci. Mol. Med. - 1974. - Vol. 47, N 3. - P. 215-222.
9. Toxqui L., de Piero A., Courtois V., Bastida S. et al. Iron deficiency and overload. Implications in
oxidative stress and cardiovascular health // Nutr. Hosp. - 2010. - Vol. 25 (3). - P. 350-365.
10. Youngster I., Abu-Kishk I., Kozer E., Braunstein R. et al. Hyperbaric oxygen treatment reduces mortality in acute iron intoxication in rats // Basic Clin. Pharmacol. Toxicol. - 2010. - Vol. 107 (3). - P. 737-741.
Сведения об авторах
Колесниченко Лариса Станиславовна - доктор медицинских наук, профессор, заведующая кафедрой химии Иркутского государственного медицинского университета (664003, г. Иркутск, ул. Красного Восстания, 1; тел.: 8 (3952) 24-38-25; e-mail: kolesnichenkols@mail.ru)
Баторова Татьяна Матвеевна - аспирант кафедры химии Иркутского государственного медицинского университета (тел.: 8 (902) 761-48-69; e-mail: batorovat@mail.ru)
