CC BY
71
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ В БИОЛОГИИ И МЕДИЦИНЕ
УДК 577.158:547.915.5:615.9:612.015.471
Т.М. Баторова, Л.С. Колесниченко
КОРРЕКЦИЯ ПРОЦЕССОВ ПЕРЕКИСНОГО ОКИСЛЕНИЯ ЛИПИДОВ И СИСТЕМЫ АНТИОКСИДАНТНОЙ ЗАЩИТЫ ЭТАНОЛОМ И ЛИПОЕВОЙ КИСЛОТОЙ ПРИ ТОКСИЧЕСКОМ ДЕЙСТВИИ МЕТАНОЛА
Иркутский государственный медицинский университет (Иркутск)
Введение метанола вызывает сдвиги оксидантной и антиоксидантной систем, сопровождается признаками, активного окислительного стресса, выражающиеся, активацией перекисного окисления. Совместное введение метанола с этанолом, или. липоевой кислотой предупреждает, негативные сдвиги, вызванные метанолом.. Выживаемость в условиях отравления, метанолом, составила 7 ч, на фоне этанола — 10 ч, а на фоне липоевой кислоты. — 16 ч.
Ключевые слова: перекисное окисление липидов, система глутатиона, метанол
CORRECTION OF LIPID PEROXIDATION AND ANTIOXIDANT PROTECTIVE SYSTEM PROCESSES BY ETHANOL AND LIPOIC ACID AT ACUTE METHANOL INTOXICATION
T.M. Batorova, L.S. Kolesnichenko Irkutsk State Medical University, Irkutsk
Methanol injections causes changes in oxidant and antioxidant systems and is accompanied, with signs of active oxidative stress, expressed by the peroxide oxidation activation. Methanol and. ethanol or lipoic acid, combined, injection prevents negative changes caused, by the first one. Methanol poisoning survival lasts 7 hours, ethanol poisoning survival — 10 hours and. lipoic acid, injection survival — 16 hours.
Key words: lipid peroxidation, glutathione system, methanol
Метиловый спирт (метанол) широко применяется в промышленности в качестве растворителя лаков, красок, как исходное вещество для получения диметилсульфата, хлористого метила, формальдегида, фармацевтических препаратов, органических красителей. Используется в качестве антифриза для охлаждения радиаторов двигателя. Метанол может также содержаться в этаноле при денатурировании последнего, а также в некоторых суррогатах алкогольных напитков и косметических средств.
Отравления чаще всего связаны с ошибочным использованием его вместо этанола с целью опьянения. Реже встречаются производственные отравления парами. Отравления метанолом опасны, так как характеризуются высокой частотой смертельных исходов и высокой инвалидизацией отравленных.
Метанол — сильный преимущественно нервный и сосудистый яд с резко выраженным кумулятивным эффектом. При отравлении через желудок вызывает циркуляторный коллапс; недостаточная насыщенность крови кислородом и ацидоз играют важную роль в картине отравления. Наибольшее количество его накапливается в печени, затем в почках, меньше всего — в мышцах, жировой ткани
и головном мозге [15]. Особую токсичность метанола обычно связывают с образованием из него в организме формальдегида и муравьиной кислоты. При любом способе введения метанола типичны поражения зрительного нерва и сетчатки глаза, отмечаемые как в острых, так и при выраженных хронических отравлениях. Пары метанола сильно раздражают слизистые оболочки глаз и дыхательных путей.
Установлено, что при алкогольной интоксикации интенсификация свободнорадикального окисления [2, 9, 11, 14—16] связана прежде всего с угнетением функционирования антиоксидантной глутатионовой системы [1, 3, 5 — 7, 12].
Учитывая, что этанол ингибирует превращение метанола в формальдегид, а также принимая во внимание, что этанол имеет значительно большее сродство к алкогольдегидрогеназе (20 : 1), его используют в качестве антидота при лечении отравлений метиловым спиртом. Это объясняется тем, что этанол уменьшает скорость окисления метанола почти на 50 %, а следовательно, понижает его токсичность [8].
Отмечен положительный эффект альфа-липоевой кислоты в лечении поражения печени алкоголем [4, 13].
Следует отметить, что вопрос о коррекции нарушений в условиях токсического действия метанола изучен недостаточно.
Целью работы было изучить влияние токсического действия метанола на перекисное окисление липидов и систему глутатиона печени и почек мышей и разработать возможные методы коррекции выявленных нарушений.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Эксперименты проведены на 97 взрослых белых беспородных мышах разного пола массой 18 — 29 г. Грызунов получали из питомника Ангарского научно-исследовательского института медицины труда и экологии человека Сибирского отделения РАМН и из Иркутского научно-исследовательского противочумного института Сибири и Дальнего
Востока. В опытах мыши были разделены на 17 групп: первая группа мышей — контрольная; 2 — 5-й группам вводили метанол в дозе 40,5 и 81 мг на 2 и 4 ч; 6 — 7-й группам — метанол 162 мг на 4 и 7 ч; 8-й группе — метанол 324 мг на 4 ч; 9-й группе вводили метанол в дозе 162 мг на выживание; 10-й — метанол 324 мг на выживание (7 ч); 11-й группе вводили этанол в дозе 162 мг и затем метанол 162 мг на 4 ч; 12-й группе — этанол 162 мг, затем метанол 324 мг на 7 ч; 13-й группе вводили этанол 162 мг, затем метанол 324 мг на выживание (10 ч); 14-й группе вводили липоевую кислоту в дозе 100 мг/кг и затем метанол 162 мг на 7 ч; 15-й группе — липоевую кислоту, затем метанол 324 мг на 4 ч; 16-й группе вводили липоевую кислоту, затем метанол 162 мг на выживание; 17-й группе — липоевую кислоту, затем метанол 324 мг на выживание (16 ч). Метанол вводили интраперитонеально (1Р) в 0,9% растворе №С1, этанол и липоевую кислоту вводили интраперитонеально. По прошествии указанного времени животных декапитировали под эфирным наркозом.
Исследования были проведены с соблюдением международных стандартов и биоэтических норм, в
соответствии с «Международными рекомендациями по проведению биомедицинских исследований с использованием животных», принятыми Международным советом медицинских научных обществ (CIOMS) в 1985 г., и были одобрены локальным этическим комитетом 19.05.2010 г.
Концентрацию восстановленного глутатиона (GSH) и активность ферментов его метаболизма: глутатионтрансферазы (ГТ), глутатионпероксида-зы (ГПО), глутатионредуктазы (ГР) — определяли стандартными спектрофотометрическими методами [5, 10]. Концентрацию производных тиобар-битуровой кислоты (TBARS) как маркера перекис-ного окисления липидов в печени и почках мышей измеряли по методу J. Stocks [16]. Все результаты статистически обработаны с использованием критериев F, t-Стьюдента и t-Велча. Описаны только значимые изменения (P < 0,05).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
В результате проведенного нами исследования установлен дисбаланс в антиоксидантной системе глутатиона при введении метанола. Показано, что функционирование системы глутатиона изменялось в зависимости от дозы и времени. При введении метанола в дозе 40,5 мг на 2 ч не наблюдалось выраженных изменений в печени. Увеличение вводимой дозы 81 —324 мг сопровождается признаками активного окислительного стресса, выражающимися активацией перекисного окисления — снижением содержания GSH в печени на 16 — 52 %, в почках на 16 — 74 % (рис. 1) и повышением концентрации TBARS в печени на 98—166 %, в почках — на 82 — 137 % (рис. 2). Наблюдалось снижение активности глутатионредуктазы в печени на 18 — 29 %, в почках на 35 — 52 %; снижение активности глутатионтрансферазы в печени на 21—34 %, в почках — на 32 — 49 %, и глутатионпе-роксидазы в печени на 30 — 39 %, в почках — на 50 — 58 % (табл. 1, 2).
Изучали выживаемость мышей в условиях интоксикации метанолом отдельно и с применением
препарат (доза, время)
Рис. 1. Влияние метанола на концентрацию глутатиона печени и почек мышей.
препарат (доза, время)
Рис. 2. Влияние метанола на концентрацию TBARS печени и почек мышей.
Таблица 1
Влияние метанола на активность ферментов системы глутатиона печени мышей
Препарат Глутатионредуктаза, нмоль/мин мг белка Глутатионтрансфераза, нмоль/мин мг белка Глутатионпероксидаза, нмоль/мин мг белка
Контроль 31,8 ± 1,28 (17) 1284 ± 118 (17) 75,3 ± 8,07 (17)
Метанол 40,5 мг, 2 ч 33,1 ± 1,85 (4) 1073 ± 21,3 (4) 85,5 ± 4,56 (4)
Метанол 40,5 мг, 4 ч 28,7 ± 0,87 (5) 980 ± 22,9* (5) 64,1 ± 3,16 (5)
Метанол 81 мг, 2 ч 30,7 ± 2,29 (6) 1039 ± 21,6* (6) 80,1 ± 5,67 (6)
Метанол 81 мг, 4 ч 31,2 ± 1,55 (5) 1007 ± 34,4* (5) 86,7 ± 3,12 (5)
Метанол 162 мг, 4 ч 26,0 ± 0,60*** (5) 1014 ± 29,8* (5) 61,8 ± 2,04 (5)
Метанол 162 мг, 7 ч 22,5 ± 0,32*** (5) 864 ± 14,5** (5) 46,3 ± 4,71** (5)
Метанол 324 мг, 4 ч 21,1 ± 0,84*** (5) 879 ± 21,5** (5) 50,2 ± 2,83* (5)
Метанол 324 мг, 7 ч 22,6 ± 0,63*** (5) 844 ± 32,2** (5) 52,7 ± 1,88* (5)
Этанол 162 мг, Метанол 162 мг, 4 ч 38,4 ± 1,36 (5) 1159 ± 28,7 (5) 75,5 ± 4,86 (5)
Этанол 162 мг Метанол 324 мг, 7 ч 28,9 ± 1,92 (5) 1146 ± 64,6 (5) 76,9 ± 4,88 (5)
Этанол 162 мг Метанол 324 мг, на выжив. (10 ч) 26,0 ± 0,96** (4) 898 ± 33,8 (4) 68,7 ± 2,19 (4)
Липоевая кислота 100 мг/кг Метанол 162 мг, 7 ч 32,9 ± 3,35 (5) 1146 ± 15,9 (5) 92,5 ± 5,87 (5)
Липоевая кислота 100 мг/кг Метанол 324 мг, 4 ч 30,3 ± 0,63 (5) 993 ± 17,6* (5) 111 ± 1,77** (5)
Липоевая кислота 100 мг/кг Метанол 324 мг, на выжив. (16 ч) 30,9 ± 0,71 (4) 1027 ± 23,8 (4) 70,0 ± 2,80 (4)
Примечание (здесь и далее): в скобках - количество мышей в опытах; значимость различий с контролем: * - p < 0,05,
** - р < 0,01, *** - р < 0,001.
корректоров — этанола и липоевой кислоты. Доза 162 мг метанола оказалась нетоксичной. На фоне этанола на 4 ч сохраняется повышенной концентрация ТВАЯЗ в печени на 62 %, в почках — на 34 % (рис. 2), сниженной концентрация GSH в печени на 12 %, в почках — на 60 % (рис. 1). Активность ферментов нормализуется, и только активность глутатионпероксидазы в почках снижена на 18 %. На фоне липоевой кислоты на 7 ч концентрация ТВАRS в печени нормализовалась, в почках сохраняется сниженной на 51 %; уровень GSH остается сниженным в печени на 31 %, в почках — на 21 %; активность ферментов близка к показателям контрольной группы (табл. 1, 2).
Доза 324 мг метанола оказалась токсичной, смерть наступала через 7 ч. На фоне этанола время жизни составило 10 ч; при этом концентрация ТВАRS остается повышенной в печени на 134 %, в почках — на 66 % (рис. 2); содержание GSH остается сниженным в печени на 34 %, в почках — на 52 % (рис. 1); снижается активность глутатионредуктазы в печени на 18 %, в почках — на 33 %; глутатионтранс-феразы в печени — на 30 %, в почках — на 21 %; глутатионпероксидазы в почках — на 18 — 25 %. На фоне липоевой кислоты время жизни увеличилось до 16
ч. При этом резко увеличена концентрация ТВАRS в печени на 236 %, в почках — на 314 %; активность ферментов нормализовалась (табл. 1, 2).
Таблица 2
Влияние метанола на активность ферментов системы глутатиона почек мышей
Препарат Глутатионредуктаза нмоль/мин мг белка Глутатионтрансфераза нмоль/мин мг белка Глутатионпероксидаза нмоль/мин мг белка
Контроль 84,8 ± 4,08 (17) 408 ± 26,6 (17) 142 ± 6,74 (17)
Метанол 40,5 мг, 2 ч 73,4 ± 3,43 (4) 374 ± 11,2 (4) 127 ± 3,04 (4)
Метанол 40,5 мг, 4 ч 67,0 ± 2,00** (5) 358 ± 12,4 (5) 104 ± 0,91*** (5)
Метанол 81 мг, 2 ч 73,2 ± 1,91* (6) 376 ± 11,8 (6) 121 ± 4,00* (6)
Метанол 81 мг, 4 ч 62,3 ± 2,34** (5) 346 ± 11,9 (5) 66,1 ± 2,53*** (5)
Метанол 162 мг, 4 ч 54,8 ± 3,01*** (5) 278 ± 18,7** (5) 69,1 ± 3,25*** (5)
Метанол 162 мг, 7 ч 46,3 ± 4,71*** (5) 228 ± 19,6*** (5) 70,3 ± 2,77*** (5)
Метанол 324 мг, 4 ч 40,5 ± 3,90*** (5) 207 ± 21,5*** (5) 60,3 ± 5,10*** (5)
Метанол 324 мг, 7 ч 45,8 ± 1,41*** (5) 265 ± 5,03** (5) 71,0 ± 3,26*** (5)
Этанол 162 мг, Метанол 162 мг, 4 ч 79,6 ± 3,81 (5) 438 ± 19,0 (5) 117 ± 2,91** (5)
Этанол 162 мг Метанол 324 мг, 7 ч 74,1 ± 4,41 (5) 421 ± 18,5 (5) 123 ± 5,68 (5)
Этанол 162 мг Метанол 324 мг, на выжив. (10 ч) 57,2 ± 3,71** (4) 322 ± 12,7* (4) 105 ± 2,31*** (4)
Липоевая кислота 100 мг/кг Метанол 162 мг, 7 ч 92,5 ± 5,87 (5) 445 ± 13,4 (5) 148 ± 5,55 (5)
Липоевая кислота 100 мг/кг Метанол 324 мг, 4 ч 79,2 ± 5,06 (5) 404 ± 10,2 (5) 137 ± 10,7 (5)
Липоевая кислота 100 мг/кг Метанол 324 мг, на выжив. (16 ч) 88,1 ± 5,15 (4) 398 ± 9,85 (4) 129 ± 16,1 (4)
При совместном введении метанола и липоевой кислоты сохраняется повышенной концентрация TBARS в печени на 30 — 62 %, в почках — на 46 — 51 % и сниженной — концентрация GSH в печени на 11—31%, в почках — на 21—55 %. Активность ферментов нормализуется, только при дозе 324 мг метанола на 4 ч активность глутатионтрансферазы в печени снижена на 23 % на фоне повышения активности глутатионпероксидазы на 47 %.
Механизм защитного действия липоевой кислоты связан со снижением концентрации токсических продуктов метаболизма метанола, увеличением соотношения NADH / NAD, снижением пероксидации липидов, повышением синтеза глутатиона, приводящим к преобладанию активности антиоксидантных систем над процессами свободнорадикального окисления.
ВЫВОДЫ
1. Введение метанола вызывает сдвиги окси-дантной и антиоксидантной систем.
2. Введение этанола и липоевой кислоты на фоне метанола предупреждает негативные сдвиги. Полученные данные свидетельствуют о возможности коррекции функционирования антиокси-дантной системы при интоксикации метанолом с помощью этанола и липоевой кислоты, при этом липоевая кислота дает наиболее выраженный эффект.
ЛИТЕРАТУРА
1. Аллекрад Х. и др. Уровень глутатиона в тканях крыс при хронической алкогольной интоксикации и действии протекторов // Сб. тр. «Орга-
низация и регуляция физиолого-биохимических процессов». — 2009. — Вып. 11. — С. 37 — 40.
2. Забродский П.Ф., Киричук В.Ф., Серов В.В. Влияние острого отравления метанолом на пере-кисное окисление липидов и концентрацию в крови кортикостерона // Вестник новых медицинских технологий. — 2007. — № 1. — С. 81.
3. Калинина Е.В., Чернов Н.Н., Алеид Р. и др. Современные представления об антиоксидантной роли глутатиона и глутатионзависимых ферментов // Вестник Российской АМН. — 2010. — № 3. — С. 46-53.
4. Карлович Т.И., Ильченко Л.Ю. Альфа-липоевая кислота в гепатологии // Трудный пациент. - 2008 - № 11. - С. 43-47.
5. Кулинский В.И., Колесниченко Л.С. Биологическая роль глутатиона // Успехи современной биологии. - 1990. - Т. 110. - № 1 (4). -С. 20-33.
6. Кулинский В.И., Колесниченко Л.С. Глута-тион митохондрий // Биохимия. - 2007. - № 7. -C. 856-859.
7. Кулинский В.И., Колесниченко Л.С. Глутати-он ядра клетки и его функции // Биомедицинская химия. - 2010. - Т. 56, № 6. - С. 657-662.
8. Лужников Е.А., Костомарова Л.Г. Острые отравления: рук-во для врачей. - 2000. - С. 434.
9. Серов В.В. Нарушения механизмов регуляции системы иммунитета при остром отравлении метанолом и их коррекция : автореф. дис. ... канд. мед. наук. - Саратов, 2007. - 24 с.
10. Anderson M.E. Enzymatic and chemical methods for the determination of glutathione // N.-Y., 1989. - Pt A. - P. 339-366.
11. Farbiszewski R., Witek A., Skrzydlewska E. N-acetylcysteine or trolox derivative mitigate the toxic effects of methanol on the antioxidant system of rat brain // Toxicology. — 2000. — N 7. — C. 47 — 55.
12. Guerri C., Grisolia S. Changes in glutathione in acute and chronic alcohol intoxication // Pharmacol. Biochem. Behavior. — 1980. — Vol. 13. — P. 53 — 61
13. Jesudason E.P., Masilamoni J.G., Jebaraj C.E. et al. Efficacy of DL-alpha lipoic acid against systemic inflammation-induced mice: antioxidant defense system // Mol. Cell. Biochem. — 2008. — Vol. 313 (1-2). - P. 113-123.
14. Parthasarathy N.J., Kumar R.S., Manikan-dan S., Narayanan G.S. et al. Effect of methanol-
induced oxidative stress on the neuroimmune system of experimental rats // Chem. Biol. Interact. — 2006. — N 15. - C. 14-25.
15. Pollack J., Brouwer K., Kawagoe I. Toxicokie-netics of intravenous methanol in the female rat // Fun-dam. Appl. Toxicol. - 1993. - N 21. - P. 105-110.
16. Sandhir R., Kaur K. Influence of ethanol on methanol-induced oxidative stress and neurobehavioral deficits // J. Biochem. Mol. Toxicol. - 2006. - N 5. -P. 247-254.
17. Stocks J., Gutteridge J.M., Sharp R.J. et al. Assay using brain homogenate for measuring the antioxidant activity of biological fluids // Clin. Sci. Mol. Med. - 1974. - Vol. 47, N 3. - P. 215-222.
Сведения об авторах
Баторова Татьяна Матвеевна - аспирант кафедры химии Иркутского государственного медицинского университета (664003, г. Иркутск, ул. Красного Восстания, 1; тел.: 8 (902) 761-48-69; e-mail: [email protected])
Колесниченко Лариса Станиславовна - доктор медицинских наук, профессор, заведующая кафедрой химии Иркутского государственного медицинского университета
