CC BY
70
УДК:632.3:633.491:579.842
DICKEYA DIANTHICOLA - НОВЫЙ ДЛЯ РОССИИ БАКТЕРИАЛЬНЫЙ
ПАТОГЕН КАРТОФЕЛЯ
А.Н. КАРЛОВ1, В.С. ЗОТОВ3, Э.Ш. ПЕХТЕРЕВА3, Е.В. МАТВЕЕВА3,
Ф.С. ДЖАЛИЛОВ1, И.А. ФЕСЕНКО2, Г.И. КАРЛОВ2, А.Н. ИГНАТОВ4
(1 Лаборатория защиты растений; 2 Центр молекуля рной биотехнологии РГАУ - МСХА имени К.А. Тимиря зева; 3 ВНИИ фитопатологии РАН;
4 Центр «Биоинженерия» РАН)
Проведено изучение видового состава фитопатогенных пектолитических бактерий, поражающих стебли и клубни картофеля. Выделенные из образцов пораженного картофеля штаммы бактерий были идентифицированы до вида и подвида с помощью основных биохимических тестов и ПЦР-анализа со специфичными праймерами. При анализе образцов из Липецкой обл. впервые в Российской Федерации среди возбудителей черной ножки и мокрой гнили картофел были выделены штаммы фитопатогенных бактерий, относ щиес к роду Dickeya, идентифицированные по последовательностям генов pelB, dnaX и спектру AFLP как D. dianthicola.
Ключевые слова: черная ножка картофеля, Dickeya dianihicola, ПЦР, AFLP.
Фитопатогенные пектолитические бактерии вызывают наиболее вредоносные болезни картофеля — черную ножку и мокрую гниль [2]. Обычный возбудитель — РесЬоЪасЬвтшт саго1оьогит имеет два подвида, которые вызывают преимущественно черную ножку у вегетирующих растений картофел и мокрую гниль клубней вегетирующих растений (Р. са-го1оьогит ББр. аЬтозерИспт (Рса)) или гниль клубней картофел после уборки урожая (Р. саго1оьогит ББр. саго1оьогит (Рсс)) [15]. Вид, ранее известный как Егюъта сКгуэапЬНетг, вызывал как сосудистое поражение растений картофел в поле (черную ножку), так увя дание и гниль широ-
кого круга с.-х. и декоративных растений в регионах с жарким климатом. В 2005 г. в результате изучения комплекса физиологических и молеку-ля рных признаков эти бактерии перенесены в новый род Бюкеуа, включающий 6 видов (табл. 1) [11].
В 1990-е годы В1скеуа эрр. (Вер) распространился в странах Западной (Великобритания, Нидерланды), Северной (Финля ндия, Дания, Швеция), Восточной Европы (Польша, Венгрия ) и странах Ближнего Востока (Турция, Израиль), что, вероятно, объя сня ется климатическими изменения ми в Северном Полушарии. Потери от этого патогена в Нидерландах, св занные только с выбраковкой за-
Работа выполнена при финансовой поддержке Федерального агентства по образованию в рамках ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России», государственный контракт П2380 «Молекулярно-генетическая оценка внутривидового полиморфизма возбудителей бактериальных болезней картофеля».
Т а б л и ц а 1
Список оригинальных и коллекционных штаммов бактерий родов Рео1оЬао1емит и Рюкеуа, использованных в работе
Штамм Растение-хозяин Географическое происхождение Биовар / реакция с ADE1/2 Вид
201-3, 204-3 Zea mays Краснодарский край ?/+ Pectobacterium carotovo-rum subsp. atrosepticum
D8, D9, D17, D33 Solanum tuberosum Липецкая обл. ?/+ D. dianthicola
2115 Dahlia sp. Румыния, 1962 А D. dianthicola
2116 S. tuberosum Франция, 1975 7 D. dianthicola
2117 Parthenium argenatum США, 1945 6 D. chrysanthemi bv. parthenii
2118 Chrysanthemum США, 1958 5 D. chrysanthemi bv. chrysanthemi
2119 Helianthus annuus Франция, 1986 5 D. chrysanthemi bv. Chrysanthemi
2120 Pelargonium capitatum Коморские острова, 1960 3 D. dadantii
2121 Ananas comosus Малайзия, 1961 3 D. dadantii
2122 Ipomea batatas Куба, 1987 А D. dadantii
2124 Dieffenbachia sp. Франция, 1972 2 D. dieffenbachiae
2125 Dieffenbachia sp. США, 1957 2 D. dieffenbachiae
2126 Lycopersicon esculentum Куба, 1987 2 D. dieffenbachiae
2127 Musa paradisiacal Колумбия, 1968 4 D. paradisiacal
2128 Zea mays Куба, 1987 4 D. paradisiacal
2129 Musa paradisiacal Колумбия, 1970 A D. paradisiacal
2131 Zea mays США, 1970 3 D. zeae
2132 Chrysanthemum morifolium США, 1970 3 D. zeae
2133 Ananas comosus Франция, Мартиник, 1991 3 D. zeae
2094 S. tuberosum Финляндия, 2005, 04V043k, w0443 " 3 D. solani
2222 S. tuberosum Нидерланды, 2007 3 D. solani
раженного семенного картофеля, составили в 2007 г. более 25 млн евро, а пря мые потери урожая картофеля — более 15 млн евро [13]. Первоначально наиболее часто встречающимс патогеном этого рода был В. д,{аШЫ-со1а, вызывавший медленное увядание растений в поле. В последние годы из растений картофел с симптомами типичной черной ножки была выделена новая группа бактерий, условно названная В. «8о1ат». Считается, что Вэр менее жизнеспособна в почве по
сравнению с Рсс и Рса, но она выживает и размножается в речной воде в ассоциации с водорослями. Ранее Вэр выделяли из растений кукурузы в Краснодарском и Ставропольском кра х [1]. В 2009 г. в результате анализа пораженных черной ножкой и мокрой гнилью образцов из Липецкой обл. нами впервые были выделены штаммы фитопатогенных бактерий, относя щиеся к роду В1скгуа, которые в ходе работы были идентифицированы как В. д,{аШЫсо1а.
Материалы и методы
Выделение и хранение штаммов
Из пораженных образцов картофеля , полученных из Липецкой обл., проводили выделение бактерий на картофельный агар (КА) с генциан-виолетом и на среду Логана в чашках Петри [12]. Чашки инкубировали в термостате в течение 2-4 сут. при 28°С. Изолировали колонии, окаймленные зоной разжижения пектат-ного геля. Бактериальные суспензии изоля тов хранили в 15%-м глицерине при $70°С. Определение фенотипических свойств проводили согласно методам, описанным в методическом руководстве по идентификации фитопатогенных бактерий [2]. Патогенность выделенных культур оценивали по способности вызывать м гкую гниль ломтиков картофеля. Выделение ДНК из бактерий проводили с помощью набора «Проба-ГС» («ДНК-технология», Москва) согласно рекомендаци м производителя. Для генетической характеристики выделенных штаммов проводили ПЦР с праймерами АБЕ1/АБЕ2, специфичными к фрагменту гена ре1В Вжкеуа эрр. [4], и с праймерами дпаХЕ/ д,паХЯ, специфичными к фрагменту гена дпаХ [13]. Для ПЦР использовали 5х Мав1егМ1х (Диалат лтд, Москва). Температурновременной профиль дл праймеров АБЕ1/АБЕ2 составля л: начальная
денатурация — 95°С 9 мин, последующие 25 циклов — 94°С 1 мин и 72°С
2 мин; завершающая элонгация — 72°С 8 мин. Для праймеров дпаХЕ / д,паХЯ начальная денатурация 94°С
3 мин, 35 циклов, включая денатурацию — 94°С 1 мин, отжиг — 59°С 1 мин, и элонгацию — 72°С 2 мин; завершающая элонгация — 72°С 5 мин.
После проведени ПЦР проводили пр мое определение последовательности ДНК амплифицированных фрагментов генов ре1В и дпаХ с помощью автоматического секвенато-
ра ABI-3130XL. Для сравнения использовали ДНК коллекции штаммов Dickeya, любезно предоставленных д-ром Ван дер Вольфом (van der Volf) (Plant Research International (IPO), Wageningen, the Netherlands) (см. табл. 1). Дл определени вида вновь выделенных штаммов оценивали степень пря мого сходства ДНК. Филогенетическое дерево строили методом ближнего соседа [10] с помощью программы MEGA4.0 [14]. Достоверность построенного дерева определ ли методом бутстрепа [6].
Оценка межвидового
и внутривидового разнообразия бактерий методом AFLP
ДНК вновь выделенных и типовых штаммов Dickeya sp. разрезали с помощью рестриктаз XbaI и NotI и лигировали с адаптерами, комплементарными сайтам рестрикции, как было описано ранее [ 9]. Последующую ПЦР проводили в объеме реакционной смеси 25 мкл, включая: 1х буфер для полимеразы BioTaq, 5 нМ dNTP, 50 нг ДНК-матрицы, 12.5 пкМ праймера и 1.25 ед. BioTaq («Диалат ЛТД», Росси ). Дл амплификации использовали следующий температурновременной профиль: первый цикл — 94°С 3 мин.; последующие 35 циклов — 94°С 30 с, 37°С 40 с и 72°С 1 мин; окончательная элонгация — 7 мин при 72°С. Продукт амплификации анализировали электрофорезом в агарозном геле и документировали при помощи системы UVP GelDoc (Великобритани ).
Наличие или отсутствие AFLP-фрагментов у отдельных штаммов учитывали как 1 или 0 соответственно, и попарное фенетическое расстоя -ние между штаммами определяли по показателю, равном 1 — коэффициент коррел ции Пирсона.
Результаты и их обсуждение
Растени картофел с типичными симптомами черной ножки и мокрой
бактериальной гнили были получены из нескольких хоз йств Липецкой обл. летом 2009 г. В результате выделения бактерий из пораженных клубней картофеля на среду КА с генцианвиолетом колонии имели
специфический вид, а именно — сгусток бледно-белого цвета в центре с прозрачной слизистой каймой. Так как пектолитические бактерии разжижают пектатный гель, то изолировали колонии, формирующие углубления в среде Логана. Было выделено и изучено по физиологическим диагностическим признакам 134 изо-л та. Выделенные бактерии в основном принадлежали Pcc (более 60%), но ряд изолятов обладал характерными для Dsp морфологическими и физиологическими признаками [11] (табл. 2).
Все исследуемые штаммы были проверены на их способность вызывать сверхчувствительную реакцию (СВЧ) на листьях табака. Штаммами с положительной СВЧ-реакцией были инокулированы ломтики картофел . Все исследуемые штаммы были патогенными дл этих растений-хоз ев, но их агрессивность была различной. Принадлежность бактерий к роду Dickeya была подтверждена амплификацией в ПЦР, специфичных для этого рода фрагментов с праймерами ADE1/2.
Анализ последовательностей фрагментов гена dnaX показал высокое сходство штаммов D8, D9, D17 и D33 и типовых культур D. dianthicola (рис. 1). Последовательности различались только в одной позиции сек-венированного фрагмента длиной 464 п.о. Различи последовательностей ДНК этого гена со штаммами других видов в среднем составл -ли 5%, но наиболее близкой группой была D. «solani» (до 3% различий). У ряда типовых штаммов Dickeya не был получен ожидаемый продукт амплификации c праймерами ADE1/2 (см. табл. 1). Анализ последовательности гена pelB, амплифицируемой этими диагностическими праймерами, вы вил более высокую степень полиморфизма (до 10% различий), что обусловлено наличием нескольких локусов и аллельных вариантов изучаемого гена.
Анализ полученных спектров AFLP-фрагментов подтвердил принадлежность штаммов D8, D9, D17 и D33, выделенных из картофел в Липецкой обл. к виду D. dianthicola (рис. 2), в то врем как ранее выделенные из подсолнечника штаммы 2 01 и 204, положительно реагировавшие с диагностическими праймерами ADE1/2, не имели аналогов среди типовых культур 6 видов и группы D. «solani» и по последовательности фрагмента гена
Т а б л и ц а 2
Основные диагностические признаки штаммов бактерий й/'квуа врр. из Липецкой обл.
Тест
Штамм РСЧ ПЦР ADE1/2 синтез индола рост на среде Логана пектолитическая активность образование редуц. сахаров
3 + — + + + —
32 + - + + + -
33 + - + + + -
35 + - + + + -
36 + + + + + —
D8 + + + + + —
D9 + + + + + -
D17 + + + + + -
D33 + + + + + -
79
"55і
89
D8
D9a
D17a
100 D9b
D. dianthicola 2116
—7% D33
D17b -1
2094
D. solani
100 2222
2124
166 D. dieffenbachiae
2125
2126
2120
100 D. dadantii
81 2122
2117
2118 □.chrysanthemi
100
100 2119
21ЭЭ
21Э1 D.zeae
100
73 21Э2
2128
2127 D. paradisiacal
100
67 2129
201
100 204
D. dianthicola
Рис. 1. Филогенетическое дерево для последовательности фрагмента гена сІпаХ 23 штаммов Dickeya sp. и 2 штаммов Pectobacterium carotovorum sbsp. atrosepticum (201 и 204), построенное методом ближнего соседа, (N13) с помощью программы МБ0А4. Достоверность топологии дерева определена методом бутстрепа с 1000 повторений
dnaX были с большой долей веро т-ности отнесены к виду Pectobacterium carotovorum sbsp. atrosepticum (сходство 97%) (см. рис. 1). Cpавнение спектров AFLP (см. рис. 2) также показало большую близость вновь выделенных штаммов из Липецкой обл. к D. dian-thicola (среднее расстоя ние 0,12), чем к другим видам рода Dickeya (среднее рассто ние 0,5б).
В. д1аШЫсо1а обычно вызывает медленное увя дание растений, сопровождающееся внутренним некрозом стебля, а впоследствии усыханием инфицированного стебл . В отличие от этих симптомов признаки заражения В. «8о1ат» больше сходны с симптомами типичной черной ножки, вызванной Рса, т.е. увя дание может быть быстрым с черной м гкой гнилью,
(а)
Рис. 2. Оценка межвидового и внутривидового разнообразия Dickeya методом AFLP с использованием рестриктаз Xbal и Notl.
(a) 1-4 штаммы D. dianthicola 2116, D8, D9, D17, 5 и 6 — P carotovorum sbsp. atrosepticum 204 и 201, М — Маркер Dialat М1кЬ, (Ь) 1 и 2 — D. solani 2094 и 2222, 3-5 — D. zeae 2131-2133;
6 -8 — D. paradisiaca 2127-2129; 9 — D. dieffenbachiae 2124; 10-12 — D. dadantii 2120-2122; 13-15 — D. chrysanthemi bv. parthenii 2117-2119; 16 и 17 — D. dianthicola 2115 и 2116;
М — Маркер Dialat М1кЬ
развивающейс вверх по сосудистой системе от инфицированного клубня . В. д,{аШЫсо1а и В. «8о1ат» больше адаптированы к теплой погоде, чем Рса и поэтому ранн тепла погода, которая установилась в Англии в 2 007 и 2009 гг., привела к сильному поражению В. «8о1ат» картофеля в поле и к моменту уборки значительна часть клубней нового урожая имели симптомы бактериального загнивани [5].
Бюкеуа поражает также цветочные луковичные растения, в частности, сильно страдает гиацинт. Так, в 2007 г. потери от этого патогена при выращивании луковичных в Голландии составили 15 млн евро. С учетом
значимости этой проблемы в Голландии утверждена исследовательская программа, посвященная изучению патогенов Dickeya, в размере 7,5 млн евро, которая будет финансироваться за счет государственного бюджета и производственных компаний [5].
Таким образом, в популяции возбудителей черной ножки, выделенных из картофел в Липецкой обл., нами впервые были обнаружены штаммы нового дл Российской Федерации опасного патогена картофел D. dianthicola. Дл учета распространенности этого возбудител и оценки возможного экономического ущерба требуютс дальнейшие исследовани .
Библиографический список
1. Матвеева Е.В., Игнатов А.Н. Бактериозы картофеля / В сб.: Интегрированная система защиты картофеля от фитофтороза, грибных, вирусных и бактериальных болезней. М., 2007. С. 16-27.
2. Bradbury J.F. Guide to plant pathogenic bacteria. Wallingford, UK: CABI. 1986.
3. Chatterjee A.Y., Liu Y., Chatterjee A.K. Nucleotide sequence of pectate lyase structural gene, pel 1 of Erwinia carotovora subsp. atroseptica strain71 and relationship of pel 1 with other pel genes of Erwinia species // MRMI, 1995. V.8, № 1. P. 92-95.
4. Darrasse A., Priou S., Kotoujansky A., Bertheau Y. PCR and restriction fragment length polymorphism of a pel gene as a tool to identify Erwinia carotovora in relation to potato diseases // Appl. Environ.Microbioology, 1994. V. 60. P. 1437-1443.
5. Elphinstone J. Erwinia chrysanthemi (Dickeya spp.) update // Plant Clinic News, 2009. No. 8.
6. Felsenstein J. Confidence limits on phylogenies: An approach using the bootstrap // Evolution, 1985. V. 39. P. 783-791.
7. Grabe G., van der Wolf J.M. Biochemical and genetical analysis reveal a new clade of biovar 3 Dickeya spp. strains isolated from potato in Europe // European Journal of Plant Pathology, 2009. V.125. P. 245-261.
8. Hoepelman A., de Neeling A.J., Bonten M.J.M. Epidemic and Nonepidemic Multidrug-Resistant Enterococcus faecium // Emerging Infectious Diseases, 2003 Vol. 9. No.9. P. 1108-1115.
9. Leavis H.L., Willems R.J.L., Top J., Spalburg E., Mascini E.M., Fluit A.C., Pe-rombelon M.C.M., Kelman A. Ecology of the soft-rot erwinias // Ann. Rev. Phytopathology., 1980. V. 18. P. 361-387.
10. Saitou N., Nei M. The neighbor-joining method: A new method for reconstructing phylogenetic trees // Molecular Biology and Evolution, 1987. V. 4. P. 406-425.
11. Samson R, Legrandre J.B, Christen R, Fischer-Le Saux M., Achouak W.,
Gardan L. Transfer of Pectobacterium chrysanthemi (Burkholder et al., 1953)
Brenner et al. (1973) and Brenneria paradisiaca to the genus Dickeya gen. nov. as Dickeya chrysanthemi comb. nov. and Dickeya paradisiaca comb. nov. and delineation of four novel species, Dickeya dadantii sp. nov., Dickeya dianthicola sp. nov., Dickeya dieffenbachiae sp. nov. and Dickeya zeae sp. nov.International // Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 2005. V.55. P. 1415-1427.
12. Schaad N.W., Jones J.B., Lacy G.H. Laboratory guide for the identification of
plant pathogenic bacteria. 3rd edition. St. Paul, Minnesota // American
Phytopathological Society, 2001.
13. Siawiak M., van Beckhoven J.R.C.M., Speksnijder A.G.C.L., Czajkowski R., Stanghellini M.E., Meneley J.C. Identification of soft-rot Erwinia associated with blackleg of potato in Arizona // Phytopathology, 1975. V.65. P. 86-87.
14. Tamura K., Dudley J., Nei M., Kumar S. MEGA4: Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) software version 4.0. Molecular Biology and Evolution, 2007. 10.1093/molbev/msm092.
15. Thompson S., Hilderbrand D.C., Schroth M.N. Identification and nutritional differentiation of the Erwinia sugar beet pathogen from members of Erwinia carotovora and Erwinia chrysanthemi // Phytopathology, 1981. V.71. P. 1037-1042.
Рецензент — д. б. н. А.А. Соловьев
SUMMARY
Research into species composition of phytopathogenic pectolytic bacteria, affecting both stems and potato tubers, has been done. Strains of bacteria, secured from affected potato samples, have been identified as both species and subspecies, by means of basic biochemical tests and PCR-analysis with specific primers. It is the first time in Russian Federation, when analyzing samples from Lipetsk region, among
causative agents of both black stem and wet rot, phytopathogenic bacteria strains have been secured, the bacteria belonging to Dickeya type, identified according to sequences of genes pelB, dnaX and AFLP spectrum as D. dianthicola.
Key words: black stem (blackleg) of potato, Dickeya dianthicola PCR, AFLP.
Карлов Александр Николаевич — асп. лаборатории защиты растений РГАУ -
МСХА имени К.А. Тимирязева. Тел. 976-12-79. Эл. почта: karlov.zara@gmail.com Зотов Василий Сергеевич — асп., ВНИИ фитопатологии РАСХН.
Тел. 8 (498) 694-09-04. Эл. почта: adni83@yandex.ru
Пехтерева Эрна Шарифовна — к. б. н., ВНИИ фитопатологии РАСХН.
Тел. 8 (498) 694-09-04. Эл. почта: phytobac@vniif.rosmail.com
Матвеева Евгения Владимировна — к. б. н., ВНИИ фитопатологии РАСХН.
Тел. 8 (498) 694-09-04. Эл. почта: matveeva@vniif.rosmail.com Джалилов Февзи Сеид-Умерович — д. б. н. Тел. 976-12-79.
Эл. почта: labzara@mail.ru
Фесенко Игорь Александрович — к. б. н. Тел. 977-70-01.
Карлов Геннадий Ильич — к. б. н. Тел. 977-70-01.
Эл. почта: karlov@timacad.ru
Игнатов Александр Николаевич — д. б. н., Центр «Биоинженерия» РАН.
Тел. +7 (916) 671-21-47. Эл. почта: An.ignatov@gmail.com
