CC BY
109
БИОТЕХНОЛОГИЯ
Известия ТСХА, выпуск 3, 2011 год
УДК :632.3:633.491:579.842
ДИАГНОСТИКА БАКТЕРИАЛЬНОГО ПАТОГЕНА КАРТОФЕЛЯ
ыскеул ылтшсоьл
А.Н. КАРЛОВ, А.Н. ИГНАТОВ12, Г.И. КАРЛОВ, Э.Ш. ПЕХТЕРЕВА1,
Е.В. МАТВЕЕВА1, Н.В. ШААД3, Ю.А. ВАРИЦЕВ4, Ф.С. ДЖАЛИЛОВ
(Лаборатория защиты растений, Центр молекулярной биотехнологии
рГаУ - МСХа имени К.А. Тимирязева; 1 ВНИИ фитопатологии РАСХН;
2 Центр «Биоинженерия» РАН; 3 Отдел зарубежных болезней и сорных растений, Министерство сельского хозяйства, Форт Детрик, Мериленд, США;
4 ВНИИ картофельного хозяйства имени А.Г. Лорха РАСХН)
Исследовали круг растений-хозяев и возможность диагностики недавно обнаруженного в России возбудителя черной ножки картофеля — бактерии Шскеуа й1апМсо1а. При искусственном заражении было показано, что помимо картофеля растениями-хозяевами Б. МаММсоЫ являются томат, табак и ирис. Это необходимо учитывать при планировании защитных мероприятий. Были получены специфичные к Б. йгаШЫсоЫ антитела, которые обеспечивали при диагностике методом ИФА высокую специфичность и порог чувствительности 105 клеток/мл в клубневом экстракте. Подобрана проба АБЕ3, которая в сочетании с праймерами АБЕ1/АБЕ2 может быть использована для выявления бактерий рода Шскеуа методом ПЦР в реальном времени.
Ключевые слова: черная ножка картофеля, Бгсквуа ЛапШсо1а, иммуноферментный анализ, ПЦР в реальном времени.
Черная ножка относится к наиболее вредоносным бактериальным болезням картофеля, встречается повсеместно и проявляется в виде некроза прикорневой части стеблей растений и мягкой гнили посадочных или хранящихся клубней [2, 4].
Это заболевание вызывают три самостоятельных, но близкородственных вида пектолитических бактерий из семейства ЕШегоЬа^епасеае:
- Ре^оЬа^епыт саго^огит 8иЬ8р. саго^огит (Рсс, син. Етта саго^уога 8иЬ8р. саго^уога) [15];
- Р atгosepticum (Ра, син. Е. саго^уога 8иЬ8р. atгoseptica) [16];
- Бткеуа 8рр. (Д син. Е. chrysanthemi или Р chгysanthemi) [22].
Первые два вида широко встречаются как патогены картофеля на пространстве бывшего СССР [2, 5, 7, 9, 10, 11].
Бактерии рода Dickeya значительно отличаются от других возбудителей мягких гнилей. Впервые бактерии описаны в начале 1950-х гг. под названием Егм>та chгysanthemi как возбудители болезни хризантемы, а в 80-х гг. прошлого века было
найдено, что они также вызывают заболевания других культур, включая картофель [18]. В дальнейшем вид E. chrysanthemi был переведен в новый род Dickeya и разделен на шесть видов [22]. Бактерии рода Dickeya вызывают поражения широкого круга растений-хозяев в различных климатических условиях [23].
Начиная с 2004 г. штаммы Dickeya spp. стали причинять значительные экономические потери при выращивании картофеля в странах Западной Европы. К наиболее вредоносным патогенам картофеля относят D. dadanthii и D. zeae (биовар 3), которые поражают картофель в жарком климате, и более адаптированный к умеренному климату вид D. dianthicola (биовары 1 и 7), широко распространенный в Европе [22]. Недавно этот патоген был обнаружен в Испании [20] и Финляндии [17]. Фитопатогенные бактерии рода Dickeya Европейская организация по карантину и защите растений включила в список А2 опасных карантинных организмов [24]. В последние несколько лет отмечается появление новой генетической группы агрессивных штаммов, которые предлагается отнести к новому виду D. solani [23].
В 2009 г. при анализе пораженных клубней картофеля из Липецкой обл. нами впервые на территории России были обнаружены бактерии рода Dickeya. С помощью ряда микробиологических и молекулярно-генетических тестов была установлена принадлежность выделенных штаммов к виду D. dianthicola [6]. Главный источник инфекции — посадочные клубни. Во многих странах поражение картофеля, вызванное Dickeya, связывают с импортом посадочного материала из Нидерландов [23]. В нашей стране эта опасность может увеличиться в связи с предстоящим вступлением в ВТО и как следствие увеличением потока посадочного материала, произведенного в других странах с зачастую более сложной, чем в России фитосанитарной обстановкой. Чтобы сократить ущерб от поражения, необходимо создание достоверных методов определения и диагностики, которые обладали бы высокой чувствительностью и специфичностью.
Целью работы было уточнение круга растений-хозяев российских штаммов Dickeya sp. и разработка методов молекулярно-генетической и серологической диагностики патогена.
Материалы и методы
Выделение бактерий проводили из пораженных образцов картофеля, полученных из различных областей РФ в 2009-2010 гг. методом посева на картофельный агар (КА) или питательный бульон с дрожжевым экстрактом (NBY) в чашках Петри. Чашки инкубировали в термостате 2-3 сут. при температуре 27°С. Плоские, слегка прозрачные колонии, пересевали на среду Логана и отбирали те из них, которые разжижают пектатный гель и образуют небольшое углубление в среде. Отобранные изоляты хранили в 15%-м глицерине при -70°С и в воде при комнатной температуре.
Все выделенные изоляты были соответствующим образом проанализированы с помощью биохимических и физиологических тестов. Определение фенотипических свойств проводили согласно «Методическому руководству по идентификации фитопатогенных бактерий» [13]. Проводили тест на образование редуцирующих веществ из сахарозы, а также определяли наличие индола.
Патогенность штаммов оценивали по способности размягчать ломтики картофеля при температуре 28°C через 24 и 48 ч после заражения. Для определения вирулентных свойств бактерий проводили инокуляцию растений из различных семейств. Были использованы гвоздика (Dianthus caryophyllus L., сорт Маргарита), георгин
(Dahlia variabilis Desf., F1 Фигаро), ячмень (Hordeum vulgaris L., сорт Михайловский), пшеница (Triticum aestivum L., сорт Московская 39), клевер (Trifolium repens L., сорт Красный), лен культурный (Linum usitatissimum L., сорт Смоленский), люпин белый (Lupinus albus L., сорт Гамма), овес посевной (Avena sativa L., сорт Скакун), вика посевная (Vicia sativa L., сорт Льговская 22), рапс (Brassica napus L., сорт Гриффин), тритикале (Triticale Wittm. & A. Camus, сорт Валентин), ирис (Iris germanica L., сорт Rimefire), картофель (Solanum tuberosum L., сорт Удача), томат (Lycopersicon esculentum L., сорт Белый налив), табак (Nicotiana tabacum L., сорт Самсун).
Заражение проводили методом введения бактериальной суспензии концентрацией 108 кл/мл стерильным шприцем в пазуху листа. Для каждого штамма использовали по 4 растения каждого вида, а для инокуляции были использованы штаммы D. dianthicola D9, D33 и P atrosepticum Eca 393, в качестве отрицательного контроля использовали стерильную воду. При проявлении симптомов на растении проводили учет и реизоляцию патогена для выполнения триады Коха.
Для получения специфичной поликлональной антисыворотки проводили иммунизацию кроликов бактериальной суспензией D. dianthicola штаммов D9 и D17 после выращивания на среде YDC в течение 48 ч при 27°С. Подготовку бактериальных антигенов к иммунизации проводили по методике Алан и Келман [12]. Иммунизацию кроликов породы шиншилла в возрасте 4-5 мес. проводили по схеме, разработанной в ГНУ ВНИИ картофельного хозяйства для получения антисывороток к бактериальным антигенам. Иммуноглобулины выделяли на хроматографической колонке, заполненной аффинным сорбентом — А-белком Staphylococus aureus, иммобилизованным на сефарозе [3], доводили до концентрации 1 мг/мл и хранили аликвотами по 1 мл при -20°C.
Титр полученных иммуноглобулинов определяли в непрямом варианте имму-ноферментного анализа (ИФА) с использованием ослиных антител против глобулинов кролика, меченых пероксидазой производства НИИЭМ имени Н.Ф. Гамалея (г. Москва). Получение конъюгатов иммуноглобулинов с пероксидазой хрена проводили с использованием метода перйодатного окисления, предложенного японским исследователем Накане [19]. Использовали также коммерческий набор для диагностики P atrosepticum методом ИФА производства ВНИИ картофельного хозяйства имени А.Г. Лорха РАСХН
Чувствительность иммуноглобулинов определяли в ИФА со штаммами Dickeya sp., Pa, Pcc, в качестве отрицательного контроля использовали штамм возбудителя кольцевой гнили картофеля Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus Cms204. Все бактериальные антигены вносили в концентрации 108 кл/мл.
Чувствительность ИФА-диагностикума к D. dianthicola определяли с использованием гомологичного штамма D9. Для проведения эксперимента готовили суспензию суточной культуры возбудителя в буфере и экстракте клубней, доводили концентрацию до 109 кл/мл, а затем наносили на сорбированную антителами планшету и проводили десятикратные разведения до концентрации 10-1 кл/мл. Далее проводили ИФА по методике «двойного сэндвича» [1]. Повторность экспериментов — 3-кратная. Оптическую плотность продукта ферментативной реакции в ИФА измеряли с помощью вертикального микропланшетного фотометра (Bio-Rad, модель 680) при длине волны 450 нм.
Выделение ДНК из бактерий проводили с помощью набора «Проба-ГС» (ООО «ДНК-Технология», Москва) согласно рекомендациям производителя. Использовали также ДНК-коллекции штаммов Dickeya, любезно предоставленные док-
тором Ван дер Вольфом (van der Volf, Plant Research International, Wageningen, the Netherlands), как было описано ранее [6].
Для проведения ПЦР в реальном времени были использованы праймеры ADE1/ ADE2, специфичные к фрагменту гена пектатлиазы pelB Dickeya spp. [14], и разработанная нами проба ADE3 (FAM- gcg ccg tcg tgc tgc aca tat ttt tcg ccg -BHQl). При проведении ПЦР в реальном времени в качестве положительного контроля использовали штаммы D. dianthicola (D9, D17), а в качестве отрицательного — штаммы Pcc и Pca (Ecc 3, Ecc 36 и Eca 393), концентрация ДНК — 10 мкг/мл. Реакцию проводили с использованием набора MasterMix (ООО «Диалат Лтд», Москва). Для постановки реакции использовали амплификатор «iCycler iQ5» (Bio-Rad Laboratories, США). Температурно-временной профиль ПЦР: начальная денатурация — 95 °С, 9 мин; последующие 40 циклов: денатурация — 94°С — 1 мин, отжиг — 57°С — 1 мин и элонгация — 72°С — 2 мин.
Статистическую обработку данных проводили методами дисперсионного анализа и сравнения по критерию Дункана с помощью программы SPSS 15.
Результаты и их обсуждение
В 2009-2010 гг. из растений, имеющих типичные симптомы черной ножки, полученных из различных областей РФ, были выделены бактериальные изоляты. На среде КА с генцианвиолетом колонии имели вид сгустка бледно-белого цвета в центре с прозрачной слизистой каймой. В случае выделения на среду NBY колонии были плоскими и практически прозрачными. Имеющие такой внешний вид колонии отсевали на среду Логана с полипектатом натрия. Бактерии, образовавшие лунки в пектатном геле, в основном принадлежали к роду Pectobacterium, но в результате проведения дальнейших тестов были также обнаружены колонии бактерий, принадлежавшие к роду Dickeya. Все исследуемые изоляты были инфильтрованы в листья табака, и те из них, которые давали реакцию сверхчувствительности (РСЧ), оценивали на патогенность с использованием ломтиков картофеля.
Постановка ПЦР со специфичными к гену pelB праймерами ADE1/2 подтвердила принадлежность ряда выделенных штаммов к роду Dickeya (табл. 1), штаммы Pcc давали в ПЦР с праймерами ADE1/2 отрицательную реакцию, но не отличались от бактерий рода Dickeya по РСЧ, реакции на синтез индола, образованию редуцированных сахаров из глюкозы и по пектолитической активности.
Искусственное заражение таких растений, как гвоздика, георгин, ячмень, пшеница, клевер, лен, люпин, овес, вика, рапс, тритикале не дало каких-либо видимых симптомов поражения (табл. 2).
Растения ириса и картофеля поражались штаммами D9, D33 и Eca 393. На растениях картофеля через 4-5 дней в месте инокуляции формировалось темное расплывающееся по стеблю пятно, которое впоследствии разрасталось. Бактерии, распространяясь по сосудистой системе, вызывали увядание листьев, которые теряли тургор и в конечном итоге полностью засыхали. Растения ириса в месте введения суспензии через 2-3 дня чернели с образованием бактериального экссудата, лист становился мягким, ткань разрушалась, в дальнейшем распространение бактерий сопровождалось потемнением всей поверхности листа (рис. 1).
Растения томата и табака не поражались штаммом Eca 393, но поражались штаммами D9, D33. В том месте, где производили инокуляцию, через 5-6 дней растение томата ломалось и падало, а листья увядали. На растениях табака через 3-4 дня стебель темнел и терял тургор параллельно с распространением бактерий от места укола к его верхней части (см. рис. 1).
Т а б л и ц а 1
Штаммы бактерий рода РвсіоЬасівгіит и йісквув, использованные в работе
Род, вид Штамм Место происхождения, время выделения Растение-хозяин
Коллекция лаборатории защиты растений РГАУ- МСХА имени К.А. Тимирязева
йісквуа эр. 09Тг Москва, лаборатория Зараженные
защиты растений, 2010 г. растения томата
йісквуа эр. 023 Московская обл., 2010 г. Картофель
йісквуа эр. 0.П! Воронежская обл., 2010 г Картофель
Коллекция ГНУ ВНИИ фитопатологии РАСХН
РвсіоЬасівгіит а&оэврИсит Еса 393, Московская обл., 2002 г. Картофель
Еса31а, Еса21
РвсіоЬасівгіит саго^огит Р3, Р32, Р33, Московская обл., 2002 г. Капуста
эиЬэр.саго^огит Р35, Р36, РБ1
йісквуа СіапіЬісоїа 033 Нижегородская обл., 2009 г. Картофель
йісквуа СіапіЬісоїа 09 Нижегородская обл., 2009 г. Картофель
йісквуа СіапіЬісоїа 08 Нижегородская обл., 2009 г. Картофель
йісквуа СіапіЬісоїа 017 Нижегородская обл., 2009 г. Картофель
йісквуа эр. 03В Воронежская обл., 2010 г. Картофель
йісквуа эр. 01 Воронежская обл., 2010 г. Картофель
йісквуа эр. 09В Воронежская обл., 2010 г. Картофель
Т а б л и ц а 2
Оценка патогенности и определение круга растений-хозяев
й. сИапМ1со!а, Р а&озврИсит при искусственном заражении
Растение й. Сіапіііісоїа, 09, 033 Р. аіговвріісит, Еса 393, Еса21, Еса31а Контроль (Н20)
Картофель + + -
Гвоздика - - -
Табак + - -
Томат + - -
Георгин - - -
Ирис + + -
Ячмень - - -
Пшеница - - -
Клевер - - -
Лен - - -
Люпин - - -
Овес - - -
Вика - - -
Рапс - - -
Тритикале - - -
Горчица - - -
П р и м е ч а н и е. «+» типичные симптомы увядания и некроз, «-» отсутствие поражения.
В экспериментах, проведенных недавно в Испании, было показано, что при искусственном заражении штаммами Dickey a spp. симптомы заболевания развивались на картофеле, кукурузе, луке, цикории и листьях узамбарской фиалки [21]. Полученные нами результаты позволяют включить в список растений-хозяев для D. dianthicola табак, томат и ирис. Это расширяет наши представления о циркуляции патогена и показывает целесообразность пространственной изоляции картофеля от указанных выше видов растений.
Результаты ИФА показали, что D. dianthicola, P atrosepticum и P. carotovorum subsp. carotovorum являются серологически обособленными видами. Так, штаммы
D. dianthicola и штаммы Pa реагировали лишь с гомологичными диагностикумами и не давали перекрестных реакций. Штаммы Pcc не давали положительных результатов с двумя вышеназванными антителами (табл. 3).
Таким образом, было достоверно установлено, что три различных возбудителя черной ножки картофеля серологически несхожи между собой и могут быть легко различимы с помощью ИФА.
Анализ чувствительности ИФА при диагностике D. dianthicola в буфере и клубневом экстракте показал отсутствие различий при анализе бактерий в буфере и в клубневом экстракте (табл. 4). Значения, достоверно отличающиеся от контроля, и в том, и в другом варианте были на уровне 105 кл/мл. Это свидетельствовало как о высокой специфичности полученных нами антител, так и об отсутствии в экстрактах клубней веществ, ингибирующих прохождение реакции. Полученные данные свидетельствуют о возможности диагностики Dickeya sp. методом ИФА непосредственно в
Т а б л и ц а 3
Реакция возбудителей черной ножки картофеля с различными ИФА-диагностикумами
(оптическая плотность продукта при 450 нм)
Вид Штамм ИФА-диагностикум к штамму
D. dianthicola P. atrosepticum
D9 D17 Eca 393 Eca 31a Eca 21
D. dianthicola D9 0,832 c 0,657 b 0,026 a 0,016 a 0,018 abc
D8 0,871 d 0,638 b 0,021 a 0,021 a 0,015 ab
D17 0,759 b 0,662 b 0,020 a 0,015 a 0,010 ab
D33 0,827 c 0,650 b 0,025 a 0,028 a 0,026 abc
P atrosepticum Eca 21 0,020 a 0,023 a 0,300 b 0,118 c 0,229 d
Eca 393 0,030 a 0,020 a 0,841 c 0,300 d 0,546 e
Eca 31a 0,047 a 0,017 a 0,320 b 0,128 c 0,256 d
P. carotovorum subsp. carotovorum P39 0,013 a 0,013 a 0,008 a 0,009 ab 0,009 a
P3-2 0,038 a 0,023 a 0,030 a 0,053 a 0,010 ab
P3-3 0,030 a 0,020 a 0,026 a 0,014 ab 0,015 ab
Отрицательный контроль — C.m. sepedonicus Cms204 0,037 a 0,019 a 0,024 a 0,034 ab 0,021 abc
П р и м е ч а н и е. В таблицах 3 и 4 между вариантами, обозначенными одинаковыми буквами, при сравнении в пределах столбцов нет статистически достоверных различий по критерию Дункана при 95%-м уровне вероятности.
Т а б л и ц а 4
Чувствительность ИФА при диагностике й. С1ап^1со!а штамм Р9 в буфере и клубневом экстракте
Концентрация й. СіапШсоїа, клеток/мл (Фактор А) Уровень экстинкции, А450 (Фактор В) В среднем по фактору А НСР05 = 0,080
суспензия бактерий в буфере суспензия бактерий в экстракте клубней
106 2,934c 2,117c 2,525c
105 0,745b 0,710b 0,727b
104 0,266a 0,288a 0,277a
103 0,257a 0,227a 0,242a
102 0,234a 0,223a 0,228a
101 0,220a 0,228a 0,224a
100 0,217a 0,229a 0,223a
10-1 0,230a 0,239a 0,234a
Контроль — фосфатный буфер 0,235a 0,237a 0,236a
В среднем по фактору В Рф < Р05 0,593 0,500
НСР05 для частных различий — 0,253
Т а б л и ц а 5
Результаты ПЦР в реальном времени с ДНК штаммов рода йсквуа, праймеры АРЕ1/А0е2, проба АРЕЗ
Штамм Dickeya sp. Пороговые значения цикла, Ct
2132 23,67 ± 1,47
2124 22,26 ± 0,03
2126 21,26 ± 0,16
2117 23,16 ± 0,25
2115 24,83 ± 0,15
2118 23,64 ± 0,02
2127 33,07 ± 0,19
2121 28,04 ± 0,50
2122 24,46 ± 0,16
2120 22,01 ± 0,54
2133 23,68 ± 0,01
2094 22,51 ± 0,01
2128 37,57 ± 0,41
2222 22,38 ± 0,11
2131 23,14 ± 0,11
2119 25,82 ± 0,03
2125 23,01 ± 0,04
2116 24,51 ± 0,19
2129 22,88 ± 0,11
D9 26,84 ± 0,32
Отрицательный контроль — Pcc н.р.*
Отрицательный контроль — Pa н.р.*
* Отсутствие реакции.
клубневом экстракте, не прибегая к трудоемкому процессу выделения бактерий в чистую культуру.
Для разработки методики диагностики патогена методом ПЦР в реальном времени нами на основе последовательностей ДНК гена пектатлиазы pelB штаммов Dickeya и других энтеробактерий, имеющихся в Генбанке (www.ncbi.nlm.nih.gov), была подобрана флуоресцентная проба ADE3. Чувствительность и специфичность разработанной пробы ADE была оценена в варианте с ДНК бактерий различных видов рода Dickeya и Pectobacterium. График накопления флуоресценции пересекал линию порогового значения в среднем на 25-м цикле (разброс 21-37 циклов) при использовании ДНК 20 типовых штаммов рода Dickeya и штамма D9 D. dianthicola (табл. 5), т.е. наблюдалась родоспецифичная реакция.
В результате проведенного эксперимента показано, что проба ADE3 в сочетании с прайме-
Log КОЕ/мл
Рис. 2. Зависимость порогового значения цикла (С,) от исходной концентрации клеток
D. dianthicola
рами ADE1/ADE2 может быть использована для достоверного выявления бактерий рода Dickeya, а в дальнейшем для создания на ее основе диагностической системы.
Надежная идентификация видов рода Dickeya пока возможна лишь при секве-нировании продуктов апмплификации с праймерами, специфичными к фрагментам гена dnaX [6].
Определение зависимости порогового значения цикла в ПЦР в реальном времени от концентрации клеток проводили с использованием подобранных праймеров и пробы. В результате эксперимента установлено, что с увеличением концентрации клеток D. dianthicola происходило уменьшение пороговых значений цикла (С4). Полученные данные позволили построить калибровочную кривую зависимости С от концентрации клеток патогена (рис. 2).
Рассчитанная по формуле Е = 101/a эффективность ПЦР в реальном времени [8] составила 1,98, что свидетельствовало об увеличении количества копий ДНК за каждый цикл в 1,98 раза, что является достаточно высоким значением и подтверждает перспективность данной тест-системы для практического применения.
Выводы
1. В список растений-хозяев D. dianthicola следует включить томат, табак и ирис. Необходимо соблюдать пространственную изоляцию картофеля от этих видов растений при планировании защитных мероприятий.
2. Разработан ИФА-диагностикум к D. dianthicola, обеспечивающий высокую специфичность и порог чувствительности 105 клеток/мл в клубневом экстракте.
3. Подобрана флуоресцентная проба ADE3, которая в сочетании с праймерами ADE1/ADE2 может быть использована для быстрого выявления бактерий рода Dickeya методом ПЦР в реальном времени.
1. Варицев Ю.А., Белов Г.Л., Усков А.И., Варицева Г.П., Завриев С.К., Аршава Н.В.,
Зайцев В.В. Методические указания по диагностике возбудителей черной ножки (Erwinia carotovora (Jones) Bergey et al.) и кольцевой гнили картофеля (Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus (Spieck. et Kotth.) Skaptasson et Burk.) методами иммуноферментного анализа, им-мунофлуоресцентной микроскопии и полимеразной цепной реакции. М.: ВНИИ картофельного хозяйства, 2003.
2. Генералова И.В. Биологические особенности развития возбудителей черной ножки в Белоруссии в связи с селекцией на болезнеустойчивость и разработка мер борьбы: Автореф. канд. дис. Минск, 1977.
3. Егоров А.М., Осипов А.П., Дзантиев Б.Б., Гаврилова Е.М. Теория и практика иммуноферментного анализа. М.: Высшая школа. 1991.
4. Израильский В.П. Бактериальные болезни растений. М.: Колос, 1979.
5. Капустин М.Н., Князева В.П. Способы распространения возбудителей мокрой (мягкой) гнили // Защита растений, 1986. № 10. С. 32-33.
6. Карлов А.Н., Зотов В.С., Пехтерева Э.Ш., Матвеева Е.В., Джалилов Ф.С., Фесен-ко И.А., Карлов Г.И., Игнатов А.Н. Dickeya dianthicola — новый для России бактериальный патоген картофеля // Известия ТСХА, 2010. Вып. 3. С. 134-141.
7. Лазарев А.М. Биологические особенности возбудителя черной ножки картофеля в Северо-Западной зоне РСФСР и методы его диагностики: Автореф. канд. дис. Л.: ВИЗР, 1985.
8. Ребриков Д.В., Саматов Г.А., Трофимов П.А., Семенов П.А., Савилова А.М., Кофиа-ди И.А., Абрамов Д.Д. ПЦР «в реальном времени». М.: БИНОМ. Лаборатория знаний, 2009.
9. Санаа Рамадан ЭльХатиб. Особенности патогенеза черной ножки в зависимости от вирулентности свойств возбудителя: Автореф. канд. дис. М.: ТСХА, 1977.
10. Хэ Ли Юань. Некоторые особенности биологии возбудителя черной ножки картофеля: Автореф. канд. дис. М., 1961.
11. Шнейдер Ю.И. Бактериозы картофеля, вызываемые бактериями родов Pecto-bacterium, Pseudomonas и Bacillus: Автореф. докт. М., 1972.
12. Alan E., Kelman A. Immunofluorescent stain procedures for detection and identification of Erwinia carotovora var. atroseptica // Phytopathol., 1977. 67. 1305-1312.
13. Bradbury J.F. Guide to plant pathogenic bacteria. Wallingford, UK: CABI, 1986.
14. Darrasse A., Priou S., Kotoujansky A., Bertheau Y. PCR and restriction fragment length polymorphism of a pel gene as a tool to identify Erwinia carotovora in relation to potato diseases // Appl. Environ.Microbioology, 1994. V. 60. P. 1437-1443.
15. De Haan E.G., Dekker-Nooren T.C. E.M., Van den Bovenkamp G.W. Speksnij-der A.G. C.L., Van der Zouwen P.S., Van der Wolf J.M. Pectobacterium carotovorum subsp. caroto-vorum can cause potato blackleg in temperate climates // European Journal of Plant Pathology, 2008. 122, 561-569.
16. Gardan L., Gouy C., Christen R., Samson R. Elevation of three subspecies of Pectobacterium camtovorum to species level: Pectobacterium atrosepticum sp. nov., Pectobacterium betavas-culorum sp.nov. and Pectobacterium wasabiae sp. nov // International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 2003, 53, 381-391.
17. Joutsjoki T., Laurila J., Pirhonen M., Lehtinen A., Hannukkala A. Diagnostics and incidence of black leg caused by Erwinia bacteria in Finland. Proceedings of the 16th Triennial Conference of the EAPR. Bilbao, Spain, 2005. 717-718.
18. Lumb V.M., PerombelonM.C.M., Zutra D. Studies of a wilt disease of the potato plant in Israel caused by Erwinia chrysanthemi // Plant Pathology, 1986. 35. 196-202.
19. Nakane P.K. New developments in tissue enzyme-labeled immunoassays // Immunoassays: clinical laboratory techniques for the 1980s, Alan R., Liss Inc., New York, 1980. 157-169.
20. Palacio-BielsaA., CambraM.A., LopezM.M. Characterization of potato isolates of Dickeya chrysanthemi in Spain by a microtitre system for biovar determination // The Annals of Applied Biology, 2006. 148. 157-164.
21. Palacio-Bielsa A., Mosquera M.E.R., AlvarezM.A.C., Rodriguez I.M.B., Lopez-Solanilla
E., Rodriguez-Palenzuela P Phenotypic diversity, host range and molecular phylogeny of Dickeya isolates from Spain // Eur. J. Plant Pathol., 20І0. 127:311-324.
22. Samson R., Legendre J.B., Christen R., Fischer Le Saux M., Achouak W., Gardan L. Transfer of Pectobacterium chrysanthemi (Burkholder et al. І953) Brenner et al. І973 and Brenneria paradisiacal to the genus Dickeya gen. nov. as Dickeya chrisanthemi comb. nov. and Dickeya paradisiacal comb. nov. and delineation of four novel species, Dickeya dadantii sp. nov., and Dickeya dianthicola sp. nov., Dickeya dieffenbachiae sp. nov., and Dickeya zeae sp. nov // International Journal of Systematic Evolution and Microbiology, 2005. 55. І4І5-І427.
23. Tsror L., Erlich O., Lebiush S, Hazanovsky M., Zig U., Slawiak M. et al. Assessment of recent outbreaks of Dickeya sp. (syn. Erwinia chrysanthemi) slow wilt in potato crops in Israel // European Journal of Plant Pathology, 2008. І23, 3ІІ-320.
24. Европейская организация защиты растений, 20 і і http:// www.eppo.org/
QUARANTINE/_listA2.htm
Работа выполнена при финансовой поддержке ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России», государственный контракт П2380 и грантов МНТЦ № 3431 и 3978.
Рецензент — д. б. н. А.А. Соловьев
SUMMARY
Both host plants’ circle and possibility of diagnostics of a newly discovered causative agent of potato blackleg in Russia - bacterium Dickeya dianthicola have been researched. When infecting artificially, it has been discovered that besides potato host plants of Dickeya dianthicola can be tomato plants, tobacco and blueflag (Iris). This should be taken into consideration when planning protective measures. Specific to Dickeya dianthicola antibodies are obtained that ensure both considerable specificity and threshold of sensitivity - 105 cells/ml. in tuber extract by IFA method of diagnostics. A test ADE3 for Dickeya dianthicola bacteria detection by PCR method at real time, in combination with ADE1 and ADE2 primers, has been chosen.
Key words: blackleg of potato, Dickeya dianthicola, immune-enzyme analysis, real time PCR method.
Карлов Александр Николаевич — аспирант лаборатории защиты растений РГАУ -МСХА имени К.А. Тимирязева. Тел. (499) 976-12-79. Эл. почта: [email protected] Игнатов Александр Николаевич — д. б. н. Эл. почта: [email protected] Карлов Геннадий Ильич — д. б. н. Тел. (499) 977-70-01. Эл. почта: [email protected] Пехтерева Эрна Шарифовна — к. б. н. Эл. почта: [email protected] Матвеева Евгения Владимировна — к. б. н. Эл. почта: [email protected] Шаад Норман — Ph.D. Эл.почта: [email protected] Варицев Юрий Алексеевич — к. б. н. Эл. почта: [email protected] Джалилов Февзи Сеид-Умерович — д. б. н. Тел. (499) 976-12-79, Эл. почта: [email protected]
