CC BY
130
УДК 632.3
Черная ножка - опасное заболевание картофеля
М.Д. ЕРОХОВА, аспирант
Всероссийского НИИ картофельного хозяйства Н.В. ДРЕНОВА, старший научный сотрудник ФГБУ«ВНИИКР»
e-mail: [email protected] e-mail: htt/lnkd.in/2aWrJY
Мокрая (мягкая) гниль картофеля, также называемая черной ножкой или водянистой гнилью стеблей, относится к числу вредоносных бактериальных болезней культуры, активно распространяющихся в последнее время. Черную ножку на вегетирующих растениях картофеля и мягкую гниль клубней вызывают пектолитические бактерии сем. Enterobacteriaceae. Развивающиеся симптомы, независимо от вида вызывающих их бактерий, сходны, различаясь лишь степенью проявления. Наиболее широко распространены Pectobacterium atrosepti-cum (van Hall) Gardan et al. и P. caro-tovorum susp. carotovorum (Jones) Hauben & al. emend. Gardan et al., ранее принадлежавшие к роду Erwinia (см. таблицу). Источником сведений об авторах является база данных Национального центра биотехнологической информации NCBI (База данных..., 2013)*.
Другая группа пектолитических бактерий, поражающих картофель, впервые была обнаружена на хризантеме садовой, позднее из растений других видов с симптомами
* Список литературы представлен в электронной версии статьи на сайте журнала http://www.z-i-k-r.ru.
мягкой гнили и увядания также были выделены пектобактерии.
В настоящее время вид Е. оЬгу-ваМЬвт! отнесен к роду й'1сквуа, который включает 6 видов. В последние годы были выделены новые штаммы, отличающиеся от них и, вероятнее всего, представляющие новые виды этого рода. Возможно, такое генетическое и серологическое разнообразие изолятов Е. оЬгу-вап^вт! не позволяет внести ясность в таксономическое положение бактерии.
Начиная с 2004-2005 гг., на картофеле выявляются вредоносные штаммы, относящиеся к й'юквуа врр., которые в настоящее время условно обозначают 'й. во!ап1'. Одним из наиболее вредоносных возбудителей бактериозов картофеля является йсквуа сИап1Ыео!а, вызывающая мягкую гниль клубней картофеля и запасающих органов (клубни, корни, луковицы, клубнелуковицы) у широкого круга растений. В условиях теплого климата у картофеля заболевание может привести к загниванию материнских, а при хранении - дочерних клубней и значительной потере урожая, возможно развитие черной ножки (рис. 1).
Симптомы мягкой гнили появляются в виде небольших, обводненных зон лизиса, которые быстро увеличиваются и приводят к мацерации пораженных тканей (рис. 2). й. diaпthico!a включена в список А2 карантинных организмов, рекомендованных для регулирования и ограниченно распространенных на территории стран - членов ЕОКЗР
(А2/53) (ЕОКЗР ШЬ.., 2013). В России карантинного статуса не имеет. Патоген распространен в ряде стран Европы, в США, Израиле, Японии, Новой Зеландии (База данных под-карантинных вредных организмов..., 2013; Мар/Р1ап1М1ве..., 2013). На территории Российской Федерации выявлен в Липецкой (Карлов, 2011), Нижегородской, Воронежской и Московской областях, однако пока не был проведен широкий мониторинг для достоверной оценки его распространенности.
Согласно проведенному анализу фитосанитарного риска (Дренова, Ерохова, 2011) й. diaпthico!a и 'й. вo!aпi' были признаны соответствующими требованиям к организмам для придания им статуса карантинных и предложены для включения в проект Перечня карантинных организмов.
Поскольку национальные сертификационные допуски на семенной картофель разнятся, экономический ущерб, причиняемый заболеванием в разных странах, неодинаков. В Нидерландах из-за строгих допусков к качеству семенного картофеля выбраковка зараженных партий семенных клубней приводит к ежегодным потерям около 30 млн евро (Контроль., 2005; Рте, 2008).
Зачастую невозможно разграничить потери, вызываемые Рв^о-bactвrium и й'1сквуа. Проявление симптомов в период проведения сертификации семенных клубней зависит главным образом от преобладающего климата, особенно в начале сезона.
В последние 5 лет потери картофеля, вызванные йсквуа эрр., существенно увеличились на определенных сортах в европейских странах и Израиле, который является крупным импортером семенного карто-
Возбудители водянистой гнили стеблей и черной ножки картофеля
Современное название
Прежнее название
Pectobacterium atrosepticum (van Hall) Hauben et al. P. carotovorum subsp. carotovorum (Jones) Hauben et al. Dickeya spp. (D. dianthicola Samson et al., 'D. solani')
Erwinia carotovora subsp. atroseptica (van Hall) Dye (Approved Lists) E. carotovora subsp. carotovora (Jones) Bergey et al. (Approved Lists) E. chrysanthemi Burkholder et al. (Approved Lists)
феля из Европы. При поражении 15 % стеблей в поле потери урожая составляли 20-25 % ^еИО е1 а1., 1987; Тэгог е1 а1., 2009) в странах с теплым климатом. В Финляндии прямые потери урожая в среднем составили 5-6 % ^аигПа е1 а1., 2008).
Особая опасность патогена, его способность распространяться с латентно зараженным посадочным материалом, схожесть симптомов с другими заболеваниями картофеля, а также отсутствие устойчивых сортов требуют его эффективной лабораторной диагностики. В связи с распространением D. dianthicola на территории стран ЕОКЗР необходимо проведение регламентирующих мероприятий, направленных на предотвращение ее завоза в нашу страну и распространения на ее территории. Особоезначениездесь получает лабораторный контроль ввозимого картофеля.
Поскольку многие фитопатоген-ные вирусы и бактерии остаются в виде латентной инфекции в растительном материале в небольшой концентрации, требуются высокоспецифичные и достоверные методы. В настоящее время видоспеци-фичная диагностика Dickeya эрр. разработана недостаточно, нет общепринятого диагностического
2. Мягкая гниль клубней картофеля
(http://www.cabi.org/portfollo/0x100/
68500.img)
протокола (ЕОКЗР URL..., 2013). Используют в основном серологические, молекулярные и культурально-морфологические методы диагностики.
Серологические методы. В роде Dickeya выявлены 10 различных се-рогрупп. Метод ИФА для анализа семенного картофеля на наличие латентной инфекции Dickeya spp. оказался недостаточно чувствительным и специфичным. Антитела к серогруппе 1 позволяли распознать не более 68 % штаммов р. Dickeya и в большинстве случаев реагировали против P. c. carotovora (Samson et al., 1990). Проблемы низкой специфичности часто возникают при анализе бактерий в растительном материале, почве и воде из-за большого количества
других микроорганизмов, присутствующих в образце, и трудностей при получении достаточно специфичных поликлональных антител.
В последние годы в РФ в связи с участившимися случаями выявления Dickeya эрр. на картофеле и с возрастанием ущерба, наносимого данными патогенами, проводятся разработки в области получения отечественных антител к Dickeya эрр. и создания на их основе коммерческих диагностических наборов для ИФА. В частности, такие исследования проводились в РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева в сотрудничестве с ВНИИ фитопатологии, ВНИИ картофельного хозяйства, ФГБУ «ВНИИКР». Были получены поликлональные антитела к двум оригинальным штаммам D. dianthicola ф9, Нижегородская область, картофель, 2009, и D17, Нижегородская область, картофель, 2009) (Карлов, 2011), изолированным на территории РФ, и показана их высокая специфичность к Dickeya эрр., позволяющая избегать ложноположительных реакций с возбудителями других бактериозов картофеля (Карлов, 2011). Чувствительность метода ИФА с указанными антителами достигала 2х104-105 кл/мл в картофельном экстракте, при этом отмечено более высокое качество сыворотки, полученной на основе штамма D9.
Для повышения чувствительности метода ИФА рекомендуется применять предварительное обогащение образца на специальных средах. В настоящий момент совместно с сотрудниками ВНИИКХ ведется работа по оптимизации применения созданных наборов ИФА для диагностики D. dianthicola.
Молекулярные методы. В качестве стандартного отборочного метода все чаще используется ПЦР, позволяющий идентифицировать бактерии Dickeya до рода ^итЬ е1 а1., 1986). В качестве молекулярных классификационных исследований для идентификации изолятов
3. Электрофореграмма продуктов амплификации с праймерами ADE1/ADE2: 1, 2, 3, 4 — штаммы Dickeya spp., 5 — вода, 6 — положительный контроль
D. dianthicola применяют анализ последовательностей 16 SpPHK, recA, а также REP ERIC, BOX.
Анализ полиморфизма длины ре-стрикционных фрагментов (ПДРФ) (Nassar et al., 1996) позволяет идентифицировать патоген до вида. Наиболее эффективный способ идентификации 'D. solani'- секвенирование генов recA (Parkinson et al., 2009) или dnaX (Stawiak et al., 2009).
В настоящее время нами оптимизировано применение ПЦР на основе праймеров ADE1/ADE2 как для идентификации чистых культур бактерий, так и для выявления патогена в растительных экстрактах (рис. 3).
Культурально-морфологические методы. Одним из главных недостатков серологических и молекулярных методов является их способность обнаруживать нежизнеспособные и/или некультурабельные клетки в растительных тканях, поэтому в схему диагностики фитопатогенных бактерий включают этап изоляции патогена на питательные среды.
Широко используется селективная среда CVP (кристалл-виолет пектат) (Cuppels et al., 1974), а также различные модификации двухслойных сред с пектатом (Bdliya et al., 2005, Hyman et al., 2001). Для изоляции P. atrosepticum, P. caroto-vorum и Dickeya spp. (Pérombelon et al., 1986). Недавно было показано, что использование различных сред
на основе селективного вещества индиготина, которое стимулирует образование синего пигмента у бактерий рода Dickeya, позволяет отличить их от бактерий Pecto-bacterium spp. (Lee et al., 2006).
В настоящее время доступны коммерческие наборы производства европейских компаний для определения Dickeya spp. методами иммуноферментного, иммунофлуо-ресцентного, ПЦР-анализов.
В целом диагностика данного вида может быть проведена по следующей схеме: родоспецифичес-кая диагностика Dickeya spp. в образце с помощью скрининг-тестов (иммуноферментного, иммунофлу-оресцентного, ПЦР-анализов) и/или изоляция бактерий на специальные среды с последующей идентификацией изолятов с характерной морфологией до вида с применением преимущественно молекулярных методов (секвенирование последовательностей ДНК, REP-ПЦР ПДРФ и анализ полиморфизма длин амплифицированных фрагментов (ПДАФ).
Система мер по предотвращению проникновения и распространения возбудителей мокрой гнили на территории нашей страны должна включать:
контроль семенного и продовольственного картофеля, а также других растений - хозяев возбудителей
черной ножки при ввозе в страну. Для этого необходимо ввести этих возбудителей в перечень карантинных организмов или в список некарантинных регулируемых организмов;
использование для посадки только семенного материала, выращенного в системе сертификации согласно ГОСТ Р 53136-2008 «Картофель семенной. Технические условия»;
соблюдение севооборота и агротехнических мероприятий, предотвращающих накопление патогенов картофеля в почве, в том числе инспектирование посадок картофеля и, при необходимости, проверка подозрительных образцов в лаборатории.
Аннотация. Фитопатогенная бактерия Dickeya dianthicola Samson et al., включенная в список А2 ЕОКЗР вызывает опаснейшее заболевание картофеля -черную ножку (мягкую гниль). В статье представлены данные о возбудителях черной ножки (мягкой гнили) Pecto-bacterium atrosepticum (van Hall) Hauben et al., P. carotovorum subsp. carotovo-rum (Jones) Hauben et al., Dickeya spp. (D. dianthicola Samson et al., 'D. solani') и методах их диагностики.
Ключевые слова. Erwinia chrysanthemi, Dickeya dianthicola, 'Dickeya solani', черная ножка картофеля, мягкая гниль, водянистая гниль стеблей картофеля, анализ фитосанитарного риска, диагностика, кристалл виолет пектат, CVP, праймеры ADE1/ADE2.
Abstract. Phytopathogenic bacterium Dickeya dianthicola Samson et al., listed to A2/53 EPPO and cause harmful disease of potato black leg (soft rot). Data about pathogenic bacteria Pectobacterium atrosepticum (van Hall) Hauben et al., P. carotovorum subsp. carotovorum (Jones) Hauben et al., Dickeya spp. (D. dianthicola Samson et al., 'D. solani') are published at the article, about diagnostic methods of detection and identification.
Keywords. Erwinia chrysanthemi, Dickeya dianthicola, 'Dickeya solani', black leg, soft rot, pest risk assesment/pest quarantine risk, crystal violet pectate, polygalacturonic acid, CVP, rec^genes.
