CC BY
44ОРИГИНАЛЬНАЯ СТАТЬЯ
https://doi.org/10.26442/18151434.2021.1.200762 (cQ]by-nc-sa 4.о!
Диагностика и мониторинг минимальной остаточной болезни при остром мегакариобластном лейкозе у детей
А.Д. Палладина1, А.В. Попа2, Т.Т. Валиев1, В.Г. Никитаев3, О.А. Чернышева1, Н.А. Купрышина1, И.Н. Серебрякова1, Т.В. Шведова1, К.Л. Кондратчик2,4, Н.Н. Тупицын1
1ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России, Москва, Россия; 2ФГАОУ ВО «Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова» Минздрава России, Москва, Россия; 3ФГАОУ ВО «Национальный исследовательский ядерный университет "МИФИ"», Москва, Россия; 4ГБУЗ «Морозовская детская городская клиническая больница» Департамента здравоохранения г. Москвы, Москва, Россия
Аннотация
Острый мегакариобластный лейкоз (ОМегЛ) - это редкий вариант острого миелоидного лейкоза (ОМЛ), который характеризуется неблагоприятным прогнозом для всех пациентов, кроме детей с t(1;22) или с синдромом Дауна. Частота полных ремиссий при ОМегЛ сравнима с таковой при других вариантах ОМЛ, при этом медиана выживаемости значительно ниже. Это обусловливает необходимость в уточнении критериев оценки эффекта проводимого лечения с использованием проточно-цитометрического определения уровня минимальной остаточной болезни (МОБ). В настоящее время единые стандартизованные подходы к измерению МОБ при миелоидных лейкозах, в том числе при ОМегЛ, отсутствуют, что препятствует адекватной оценке эффекта терапии и в ряде случаев - определению показаний к аллогенной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток. В статье определены особенности диагностики и описаны подходы к измерению уровня МОБ при ОМегЛ.
Цель. Продемонстрировать алгоритмы диагностики и определения МОБ при ОМЛ М7 у детей.
Материалы и методы. В статье проанализированы клинические и иммунологические данные 10 мальчиков и 4 девочек с впервые выявленным диагнозом ОМегЛ в возрасте от 3 мес до 12 лет, 13 из которых получали лечение в ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина» и 1 - в ГБУЗ «Морозовская ДГКБ» в период с 1995 по 2020 г. У 6 пациентов оценена МОБ. Оценка МОБ проводилась как морфоцитохимическим методом, так и методом многопараметровой проточной цитомет-рии с использованием маркеров мегакариоцитов (CD61, CD42, CD41) в сочетании с общемиелоидными маркерами (CD13, CD33), CD34, CD117 и маркерами аберрантности (наиболее часто - CD7).
Результаты. Показано, что адекватное измерение уровня МОБ требует подробного иммунофенотипирования при диагностике для установления аберрантности мегакариобластов. Наиболее часто на бластных клетках ОМегЛ помимо мегака-риоцитарных маркеров (100% случаев) экспрессированы маркеры CD9 (100%), общемиелоидный антиген CD33 (69,2%), стволовоклеточный антиген CD34 (46,2%), CD13 (38,5%). Антиген CD117 присутствовал на бластных клетках в 33,3% случаев. Частой явилась экспрессия Т-клеточно-ассоциированного антигена CD7 (46,2%). Оценка МОБ проведена в процессе лечения (чаще - после индукционного курса) на основе маркеров мегакариоцитарной линии (CD61, CD41, CD42a, CD42b), слабой экспрессии CD45, а также особенностей иммунофенотипа при первичной диагностике. Уровни МОБ колебались от полностью отрицательных (0%; 0,006%) до явных (1,05%).
Заключение. Выявление остаточных опухолевых мегакариобластов при ОМЛ М7 с помощью проточной цитометрии является перспективным методом оценки эффекта терапии. Адекватное измерение уровня МОБ требует подробного иммунофенотипирования при диагностике для установления аберрантности мегакариобластов.
Ключевые слова: острый мегакариобластный лейкоз, М7, минимальная остаточная болезнь
Для цитирования: Палладина А.Д., Попа А.В., Валиев Т.Т., Никитаев В.Г., Чернышева О.А., Купрышина Н.А., Серебрякова И.Н., Шведова Т.В., Кондратчик К.Л., Тупицын Н.Н. Диагностика и мониторинг минимальной остаточной болезни при остром мегакариобластном лейкозе у детей. Современная онкология. 2021; 23 (1): 148-155. DOI: 10.26442/18151434.2021.1.200762
Информация об авторах / Information about the authors
мПалладина Александра Дмитриевна - врач клинической лабораторной диагностики
лаб. иммунологии гемопоэза ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина».
E-mail: palladinaa@gmail.com; ORCID: 0000-0002-9400-7347
Попа Александр Валентинович - проф. РАН, д-р мед. наук, проф. каф. пропедевтики
детских болезней педиатрического фак-та ФГАОУ ВО «РНИМУ им. Н.И. Пирогова».
E-mail: apopa@list.ru; ORCID: 0000-0001-5318-8033
Валиев Тимур Теймуразович - д-р мед. наук, зав. отд-нием химиотерапии гемобластозов НИИ детской онкологии и гематологии ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина». E-mail: timurvaliev@mail.ru; ORCID: 0000-0002-1469-2365 Никитаев Валентин Григорьевич - д-р техн. наук, проф., зав. каф. компьютерных медицинских систем ФГАОУ ВО НИЯУ МИФИ. E-mail: kaf46@mail.ru; ORCID: 0000-0002-4349-3023 Чернышева Ольга Алексеевна - канд. мед. наук, ст. науч. сотр. лаб. иммунологии гемопоэза ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина». E-mail: beznos.olga@gmail.com; ORCID: 0000-0002-9630-5591
Купрышина Наталья Александровна - канд. мед. наук, ст. науч. сотр. лаб. иммунологии гемопоэза ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина». E-mail: natalya-2511@yandex.ru; ORCID: 0000-0001-8509-0954
Серебрякова Ирина Николаевна - канд. мед. наук, врач клинико-диагностической лаб. ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина». ORCID: 0000-0002-8389-4737 Шведова Тамара Викторовна - биолог клинико-диагностической лаб. ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина»
HAlexandra D. Palladina - doctor, Blokhin National Medical Research Center of Oncology. E-mail: palladinaa@gmail.com; ORCID: 0000-0002-9400-7347
Aleksandr V. Popa - D. Sci. (Med.), Prof. RAS, Pirogov Russian National Research Medical University. E-mail: apopa@list.ru; ORCID: 0000-0001-5318-8033
Timur T. Valiev- D. Sci. (Med.), Blokhin National Medical Research Center of Oncology. E-mail: timurvaliev@mail.ru; ORCID: 0000-0002-1469-2365
Valentin G. Nikitaev- D. Sci. (Techn.), National Research Nuclear University MEPhl. E-mail: kaf46@mail.ru; ORCID: 0000-0002-4349-3023
Olga A. Chernysheva - Cand. Sci. (Med.), Blokhin National Medical Research Center of Oncology. E-mail: beznos.olga@gmail.com; ORCID: 0000-0002-9630-5591
Natalia A. Kupryshina - Cand. Sci. (Med.), Blokhin National Medical Research Center of Oncology. E-mail: natalya-2511@yandex.ru; ORCID: 0000-0001-8509-0954
Irina N. Serebryakova - Cand. Sci. (Med.), Blokhin National Medical Research Center of Oncology. ORCID: 0000-0002-8389-4737
Tamara V. Shvedova - biologist, Blokhin National Medical Research Center of Oncology
Detection and monitoring of minimal residual disease in acute megakaryoblastic leukemia in children
Alexandra D. Palladina1, Aleksandr V. Popa2, Timur T. Valiev1, Valentin G. Nikitaev3, Olga A. Chernysheva1, Natalia A. Kupryshina1, Irina N. Serebryakova1, Tamara V. Shvedova1, Konstantin L. Kondratchik2,4, Nikolai N. Tupitsyn1
1Blokhin National Medical Research Center of Oncology, Moscow, Russia; 2Pirogov Russian National Research Medical University, Moscow, Russia; 3National Research Nuclear University MEPhI, Moscow, Russia; 4Morozov Children's Clinical Hospital, Moscow, Russia;
Abstract
Acute megakaryoblastic leukemia (AMKL) is a rare subtype of acute myeloid leukemia (AML), which is associated with poor prognosis for all patients except children with t(1;22) or Down syndrome. The frequency of complete remission in case of AMKL is comparable to the frequency of complete remission in other variants of AML, and the median survival is much lower. This determines the necessity to update criteria for assessment of the effect of treatment using flow cytometry definition of the level of minimal residual disease (MRD). Nowadays, there are no unified and standardized approaches for the measurement of MRD in case of myeloid leukemia, including AMKL, which prohibits adequate assessment of the therapy effect and in some cases - determination of the indications for allogeneic hematopoietic stem cells transplantation. The article identifies diagnostic features and describes approaches for the measurement of the level of MRD in case of AMKL.
Aim. The aim is to demonstrate the algorithms for diagnosing and measuring MRD in case of AML-M7 in children. Materials and methods. The article analyzes the clinical and immunological profile of 10 boys and 4 girls with the initial diagnosis of AMKL between the ages of 3 months - 12 years old, 13 of them have received treatment in the FSBI "N.N. Blokhin National Medical Research Center of Oncology" and one - in the GBUZ "Morozovsky DGKB" between 1995 and 2020, The measurement of MRD was carried out in 6 patients. The measurement of MRD was carried out using both morphocytochemical method and multiparameter flow cytometry with megakaryocyte markers (CD61, CD42, CD41) in combination with other myeloid markers (CD13, CD33), CD34, CD117 and aberrant markers (mainly CD7).
Results. We showed that adequate measurement of the level of MRD had required detailed immunophenotyping during diagnosis to determine the aberration of megakaryoblasts. CD9 marker (100%), CD33 myeloid marker (69.2%), stem cell antigen CD34 (46.2%), CD13 (38.2%) in addition to megakaryocyte markers (100%) were most often expressed on blast cells in case of AMKL. The CD117 antigen was present on the blasts in 33.3% of cases. The expression of the T-cell-associated CD7 antigen (46.2%) was frequent. The measurement of MRD was carried out during the treatment (usually after an induction course) on the basis of the markers of megakaryocytic cell line (CD61, CD41, CD42a, CD42b), weak CD45 expression, as well as the immunophe-notype characteristics during initial diagnosis. The level of MRD ranged from completely negative (0%; 0.006%) to evident (1.05%).
Conclusion. The detection of residual tumor megakaryoblasts in case of AML-M7 using flow cytometry is a promising method to evaluate the effect of therapy. The adequate measurement of the level of MRD requires detailed immunophenotyping during the diagnosis to determine the aberration of megakaryoblasts.
Keywords: acute megakaryoblastic leukemia, M7, minimal residual disease
For citation: Palladina AD, Popa AV, Valiev TT, Nikitaev VG, Chernysheva OA, Kupryshina NA, Serebryakova IN, Shvedova TV, Kondratchik KL, Tupitsyn NN. Detection and monitoring of minimal residual disease in acute megakaryoblastic leukemia in children. Journal of Modern Oncology. 2021; 23 (1): 148-155. DOI: 10.26442/18151434.2021.1.200762
Введение
Острый мегакариобластный лейкоз (ОМегЛ) является биологически неоднородным морфологическим вариантом острого миелоидного лейкоза (ОМЛ) и развивается из мегакариоци-тарных предшественников. ОМегЛ впервые описан в 1931 г. J. von Boros [1, 2], однако в последующие годы сообщения о данном типе лейкоза редки в связи с отсутствием достоверных диагностических критериев. В 1978 г. J. Breton-Gorius и соавт. [3] впервые применили технологию ультраструктурной идентификации с использованием тромбоцитарной пероксида-зы, которая позволила выявить малые мегакариоциты и увеличить точность диагностики ОМегЛ. Далее в 1985 г. диагноз ОМегЛ с уточненными диагностическими критериями внесен во Франко-Американо-Британскую классификацию [4].
ОМегЛ является сложным для установления диагнозом. Его морфологические признаки недостаточно специфичны, так как бластные клетки морфологически могут быть как неотличимы от лимфобластов, так и характеризоваться вы-
Кондратчик Константин Леонидович - канд. мед. наук, доц. каф. онкологии и гематологии ФГАОУ ВО «РНИМУ им. Н.И. Пирогова, зав. отд-нием онкологии и гематологии ГБУЗ «Морозовская ДГКБ». E-mail: morozov-14@yandex.ru; ORCID: 0000-0002-5195-4539 Тупицын Николай Николаевич - д-р мед. наук, проф., зав. лаб. иммунологии гемопоэза ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина». E-mail: nntca@yahoo.com; ORCID: 0000-0003-3966-128Х
раженной базофилией и отростчатостью цитоплазмы [5]. Цитохимически в бластных клетках при этом заболевании отсутствует миелопероксидаза, а гликоген располагается в цитоплазме в форме гранул, что также является цитохимическими признаками лимфобластного лейкоза [5, 6]. Наиболее специфичным цитохимическим признаком ОМегЛ считается тромбоцитарная пероксидаза: для ее выявления необходима электронная микроскопия в сочетании с ультрацитохимическим исследованием, которые позволяют выявить положительную реакцию с тромбоцитарной перок-сидазой в оболочке ядра и эндоплазматическом ретикулуме опухолевых мегакариобластов [7]. Достоверное установление диагноза ОМегЛ возможно только при полноценном им-мунофенотипировании с использованием Т- и В-лимфоид-ных, мегакариоцитарных, эритроидных и пан-миелоидных маркеров. В педиатрической практике ОМегЛ наиболее часто встречается у детей до 1-3 лет, а также у детей с синдромом Дауна [2].
Konstantin L. Kondratchik - Cand. Sci. (Med.), Pirogov Russian National Research Medical University, Morozov Children's Clinical Hospital. E-mail: morozov-14@yandex.ru; ORCID: 0000-0002-5195-4539
Nikolai N. Tupitsyn - D. Sci. (Med.), Blokhin National Medical Research Center of Oncology. E-mail: nntca@yahoo.com; ORCID: 0000-0003-3966-128X
Таблица 1. Основная панель моноклональных антител, использованных в работе Table 1. The main panel of monoclonal antibodies used in the study
Флуорохромы № пробы V450 V500 F PE PE-cy5 PEcy7 APC APCH7
1 HLA-DR CD45 CD16* CD13 CD34 CD117 CD11b CD10
2 HLA-DR CD45 CD35 CD64 CD34 CD117 CD300e CD14
3 HLA-DR CD45 CD36 CD105 CD34 CD117 CD33 CD71
4 HLA-DR CD45 nuTdT CD56 CD34 CD117 CD7 CD19
5 HLA-DR CD45 CD15 NG2 CD34 CD117 CD22 CD38
6 HLA-DR CD45 CD42a/CD61 CD203c CD34 CD117 CD123 CD4
7 HLA-DR CD45 CD41 CD25 CD34 CD117 CD42b CD9
*Антитела, специфичные к указанным кластерам дифференцировки. *Antibodies specific to the specified differentiation clusters.
Таблица 2. Иммунофенотипы пациентов, включенных в исследование Table 2. Immunophenotypes of patients included in the study
Маркер Пациент Сводное количество (+/всего) Процент
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 позитивных
МРО - - - - - 0/5 0
CD34 + + - + - - - - - + + - + 6/13 46,2
CD117 - + - - - - - + + 3/9 33,3
CD13 + + - - + - - - - + + - - 5/13 38,5
CD33 + + - - + + + - + + + + - 9/13 69,2
CD64 - - - - - - - - 0/8 0
CD4 - - - - - - 0/7 0
CD7 + - - + + + + - - + - - - 6/13 46,2
HLA-DR + - - - - - - + - - + + - 4/13 30,8
CD9 + + + + + + 6/6 100
CD56 - - - - - + 1/6 16,7
CD38 + - - - - + + + 4/8 50
GPA - - - - - - 0/6 0
CD36 - - + - 1/4 25
CD105 - - - 0/3 0
CD(61+42a)/CD61 + + + + + + + + + + + + + 13/13 100
CD41 + + + + 4/4 100
CD42b + + - + + + 5/6 83,3
CD71 + - - 1/3 33,3
CD22 - - - - - - - 0/7 0
TdT - - - - 0/4 0
CD11b + - - - - - 1/6 16,7
CD123 - + - - - - 1/6 16,7
Пролиферирующие мегакариобласты синтезируют тромбо-цитарный фактор роста PDGF-ВВ, а также некоторые другие факторы роста фибробластов, что приводит к выраженным реактивным фибротическим изменениям стромы костного мозга. Эти изменения препятствуют адекватной аспирации костного мозга при пункции, полученные пунктаты зачастую имеют недостаточный объем и клеточность, а пропорция в них бластных клеток может быть занижена. Фиброз костного мозга вкупе с особенностями кроветворения детей 1-2-го года жизни обусловливает сравнительно низкий процент опухолевых бластных клеток в костном мозге и трудности диагностики при ОМегЛ [8-10].
Цитогенетические особенности М7-варианта ОМЛ
До недавнего времени для этого варианта ОМЛ выделяли только одну специфическую цитогенетическую аномалию: наличие 1(1;22)(р13^13) в бластных клетках, в результате которой образуется химерный ген ЯВМ15-МКЫ, чаще всего эта транслокация обнаруживается у пациентов в возрасте до 2 лет. Наличие этой аномалии рядом исследователей признается как благоприятный прогностический признак [9, 11, 12].
Однако в последние годы с появлением метода полногеномного секвенирования обнаружены другие цитогенетические поломки, характерные для ОМегЛ: это inv(16)(p13.3q24.3), t(11;15)(p15;q35), реаранжировки гена KMT2A и др. Эти аномалии имеют различные частоту выявления и прогностическое значение [8]. Также в опухолевых клетках при ОМегЛ могут встречаться и другие цитогенетические поломки, неспецифичные для этого заболевания, например, моносомия хромосомы 5, 7, 9, гипердиплоидный, сложный кариотип. Наличие таких хромосомных аномалий является дополнительным фактором плохого прогноза.
Следовательно, с учетом морфологических, цитохимических, иммунологических и цитогенетических особенностей ОМегЛ нельзя рассматривать как мономорфную нозологическую единицу, что нашло отражение в классификации опухолей кроветворной и лимфоидной тканей Всемирной организации здравоохранения (2016 г.). В соответствии с данной классификацией к ОМегЛ относятся: ОМЛ (мегакариобластный) с транслокацией t(1;22)(p13.3;q13.1);RBM15-MKL1, с инверсией inv(3)(q21.3;q26.2), c транслокацией t(3;3)(q21.3;q26.2), с транслокацией t(9;11)(p21.3;q23.3);KMT2A-MLLT3 [5, 13].
Рис. 1. Коэкспрессия CD7 на бластной популяции при ОМегЛ.
Fig. 1. CD7 coexpression on the blast cell population in case of acute megakaryoblastic
leukemia (AMKL).
1024
1024
10" 10' 102 103 CD45V500-A
104 10" 101 102 10* 10« ■ Властные клетки CD7APC-A I Not in gate
Рис. 2. Коэкспрессия антигена CD56 на бластной популяции при ОМегЛ. Fig. 2. CD56 antigen coexpression on the blast cell population in case of AMKL.
1024
768
Ы 512
256
0,00% 0,00%
22.88% 77,12%
100 101 I Бластные клетки
102 CD56 PE-A
103
104
По оценке исследовательских групп, частота достижения полной ремиссии (ПР) при ОМегЛ у детей составляет 70-80%, что сравнимо с другими вариантами ОМЛ; однако медиана общей выживаемости значительно ниже, чем при других вариантах ОМЛ [9, 14, 15]. Это диктует необходимость более эффективной, чем клинико-морфологическая, оценки глубины ремиссии при ОМегЛ, в том числе с применением проточно-цитометрической оценки минимальной остаточной болезни (МОБ). Для введения этого метода в практику необходимы установление алгоритма определения МОБ, критериев позитивности МОБ и оценка влияния полученных количеств остаточных опухолевых клеток на прогноз заболевания. Также такой низкий уровень общей выживаемости означает необходимость повышения эффективности существующей терапии консолидации ремиссии с возможным применением метода аллогенной трансплантации гемопоэти-ческих стволовых клеток. Измерение МОБ необходимо при оценке статуса заболевания перед аллогенной трансплантацией костного мозга (аллоТКМ), а также в установленные сроки после ее выполнения (30, 60, 100, 180, 360-й дни), однако единые стандартизованные подходы к измерению МОБ при ОМЛ, в том числе при ОМегЛ, отсутствуют, что препятствует адекватной оценке эффективности лечения.
В настоящей статье на основании характеристики 14 случаев ОМегЛ описаны критерии диагностики и оценки МОБ при ОМегЛ.
Материалы и методы
В нашей работе проанализированы данные 14 детей с впервые выявленным ОМегЛ: 10 мальчиков и 4 девочки в возрасте от 3 мес до 12 лет (6 пациентов младше 1 года), 13 из них получали лечение в ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина» и 1 - в ГБУЗ «Морозовская ДГКБ» с период с 1995 по 2020 г.
Уровень лейкоцитов крови находился в пределах 2,5-53,0х109/л, бластные клетки в костном мозге 20,2 - 90%.
Цитогенетическое исследование проводилось 10 пациентам. У 2 пациентов выявлена транслокация t(1;22). У 3 пациентов определялись различные варианты химерного гена MLL: 46XY?, t(10;11)(p11q23)[14]/46XY[6], t(10:11) MLL/MLLT10 и t(9;11)(p22;q23) MLL-AF9. У 4 пациентов определялся сложный кариотип: 45XY,-7, t(3;3)(q21q26), 48XY,+21,+21, der(17), 53XX,t(1;7)(q21;p15),der(1),+2,+6,+7,+7,der(7)t(1;7),+8,+ 10, + 19[8]/46,XX[10] и 50,XX,+6,+7,+8, +13, der(11), add(p15), del(17)(q24.). У 1 пациента цитогенетические аномалии не выявлены: 46XY.
Следовательно, в соответствии с классификацией опухолей кроветворной и лимфоидной тканей Всемирной организации здравоохранения (2016 г.) у 2 больных диагностирован ОМЛ (мегакариобластный) с транслокацией t(1;22)(p13.3;q13.1); у 2 - ОМЛ с транслокацией t(10;11); у 1 - ОМЛ с транслокацией t(9;11); у 4 - ОМЛ с комплексным (сложным) кариоти-пом и у 1 больного - ОМЛ с нормальным кариотипом.
При проведении диагностики всем больным осуществляли подробное иммунофенотипирование бластных клеток. В основе подхода лежит концепция EuroFlow [16], которая включает оценку линейности лейкоза по ориентационной пробе ALOT с последующим анализом бластных клеток согласно их линейной принадлежности (табл. 1).
Большинство пациентов (8 из 14) получали лечение по протоколу НИИ ДОГ ОМЛ 2012; 3 - по AML-BFM 87 и 3 -по AML-BFM 2004. Протоколы НИИ ДОГ ОМЛ 2012 и AML-BFM 2004 состояли из 4-5 курсов химиотерапии (ХТ). У пациентов, включенных в группы промежуточного и высокого рисков, ХТ включала 5 курсов: AIE (Ara-C, IDA, этопозид), НАМ (Ara-C 3000 мг/м2 №6, митоксантрон), AI (Ara-C 500 мг/м2 1-5-й дни и IDA), hAM (Ara-C 1000 мг/м2 и митоксантрон) и НАЕ (Ara-C 3000 мг/м2 №6 и этопозид). Поддерживающая терапия состояла из постоянного приема 6-меркап-топурина, четырехдневных курсов Ara-C 1 раз в 28 дней и длилась до 73-й недели от начала индуктивного курса. В отличие от протокола AML-BFM 2004 в протоколе НИИ ДОГ ОМЛ 2012 наряду с ХТ применялось эпигенетическое лечение (де-цитабин, вальпроевая и полностью транс-ретиноевая кислота - ATRA).
Протокол AML-BFM 87 состоял из: индукции ремиссии длительностью 8 дней, включавшей Ara-C 100 мг/м2 в сутки внутривенно капельно 24 ч в 1-2-й дни, 100 мг/м2 внутривенно капельно в течение 1 ч каждые 12 ч в 3-8-й дни, даунорубицин 60 мг/м2 в сутки внутривенно капельно 1 ч в 3-5-й дни и вепе-зид (VP-16) 150 мг/м2 в сутки внутривенно капельно 2 ч в 6-8-й дни; консолидации ремиссии - Ara-C 75 мг/м2 в сутки внутривенно струйно в 3-6-й, 10-13-й, 17-20-й и 24-27-й дни, даунорубицин 30 мг/м2 в сутки внутривенно капельно в течение 2 ч в 1, 8, 15 и 22-й дни, 6-МП 60 мг/м2 в сутки внутрь ежедневно в 1-27-й дни; и 2 курсов ранней интенсификации -
0
Таблица 3. Панель моноклональных антител, использованная при диагностике МОБ у пациентки 3 Table 3. The panel of monoclonal antibodies used in the diagnosis of minimal residual disease (MRD) in women 3
Флуорохромы № пробы V450 FITC PE APC APC-H7
1 SYTO-41 CD41 CD19 | CD42b
2 CD45 CD41a+CD61 CD7
3 CD45 CD7 CD10
Таблица 4. Маркеры, использованные при диагностике МОБ у пациента 4 Table 4. Markers used in the diagnosis of MRD in patient 4
Флуорохромы № пробы V500 V450 FITC PE PerCP Cy-5 PE-Cy-7 APC
1 CD45 CD9 CD61+42a CD33 CD34 CD13 CD117
Табл. 5. Маркеры, использованные при диагностике МОБ у пациентки 5 Table. 5. Markers used in the diagnosis of MRD in women 5
Флуорохромы № пробы V500 V450 FITC PE Cy-5 APC APC-H7
1 CD45 SYTO 41 CD58 CD19 CD34 CD10 CD38
2 CD45 CD61+CD42a CD19 CD33
Таблица 6. Маркеры оценки МОБ у больного 7 Table 6. Markers used in the diagnosis of MRD in patient 7
Флуорохромы № пробы V450 V500 FITC PE PE-Cy5 PE-Cy7 APC APC-H7
1 HLA-DR CD45 CD61+CD42a CD25 CD34 CD117 CD42b CD9
2 CD45 SYTO-16 CD34 CD42b
Ara-C 1000 мг/м2 внутривенно капельно каждые 12 ч в
1-3-й дни и VP-16 125 мг/м2 в сутки внутривенно капельно в
2-5-й дни.
С целью консолидации полученной ремиссии 2 пациентам проведена аллоТКМ.
Результаты
Диагноз ОМегЛ во всех случаях установлен на основании детального морфологического, цитохимического и иммуно-фенотипического обследования.
Костный мозг чаще средне- или гипоклеточный. По данным морфоцитохимического исследования выявлялось более 20% бластных клеток (от 20,2 до 90%, среднее количество составило 48). В большинстве случаев бластные клетки имели неправильные очертания и отростчатую цитоплазму, умеренное и высокое ядерно-цитоплазматиче-ское соотношение, округлые ядра; цитоплазма характеризовалась базофилией и отсутствием зернистости. Однако в нескольких случаях бластные клетки не имели специфических морфологических признаков дифференцировки при морфологическом исследовании.
Для верификации диагноза ОМегЛ использовали антитела к мегакариоцитарным антигенам: CD61 (практически всегда в сочетании с CD42a), CD41a, CD42b. Следует отметить, что реакция с антителами к CD42b отрицательная лишь в 1 из 6 случаев, в этом случае положительная реакция отмечена с антителами к CD61+CD42a и CD41. В 1 случае антитела к CD61 не использовали, при этом отмечена положительная реакция с CD42b - 30%.
Как видно из данных, представленных в табл. 2, экспрессия мегакариоцитарных антигенов на бластных клетках наиболее часто сочеталась с экспрессией общемиелоидных антигенов (CD33 - 9/13, CD 13 - 5/13), маркера стволовых клеток (CD34 - 6/13), CD9 - 6/6. Необходимо отметить, что в 6 из 13 изученных случаев на бластных клетках присутствовал Т-клеточно-ассоциированный антиген CD7. Маркер CD117 обнаружен в 1/3 случаев - 3/9.
Совокупность иммунофенотипов у больных ОМегЛ представлена в табл. 2.
Наиболее интересные иммунофенотипы с признаками абер-рантности, позволяющими мониторировать МОБ у больных, представлены на рис. 1-3.
Следует отметить, что у отдельных больных наряду с мега-кариобластами присутствовала достаточно выраженная пропорция В-линейных предшественников. Эти клетки ни в одном из случаев не имели признаков аберрантности и расценены как нормальные В-линейные предшественники.
Лечение больных осуществлялось по протоколам, представленным в разделе «Материалы и методы». Ремиссия достигнута у 10 (71,4%) из 14 больных.
Уровни МОБ оценивали у 6 больных в различные сроки, в 1 случае - дважды: на 15 и 34-й дни, 26, 42, 50-й дни, 8 мес.
Приводим некоторые примеры определения МОБ у детей с ОМЛ М7 (ОМегЛ).
Больная С. (№3 в табл. 2). Оценка МОБ у данной пациентки впервые проведена после индукционного цикла AIE с Дакоге-ном на 42-й день от установления диагноза. Морфологически бластные клетки в костном мозге составили 3,8%, пунктат клеточный, уменьшено количество лимфоцитов - 7,6%. Грануло-цитарный росток снижен - 20,2%, отмечена задержка созревания нейтрофилов на уровне миелоцитов. Эритроидный росток значительно раздражен (62,6%), умеренно выражены явления дизэритропоэза. Мегакариоциты в достаточном количестве.
Примененная панель антител при определении МОБ представлена в табл. 3.
Клетки с коэкспрессией мегакариоцитарных антигенов CD42b и CD41 составили 2,16% среди миелокариоцитов. Клетки с экспрессией CD41a/CD61 - 3,63%, с учетом слабой экспрессии CD45 содержание этих клеток среди миелокарио-цитов составило 1,05%.
Уровень остаточных лейкозных клеток на 42-й день лечения ОМегЛ у данной пациентки ниже, чем число морфологически выявляемых бластов (3,8%), и составил 1,05%. Это соответствует МОБ-позитивному статусу. Таким образом, у ребенка 7 мес с диагнозом ОМегЛ на 42-й день лечения оставались бластные клетки мегакариоцитарного ряда. Следует отметить, что при диагностике лейкоза нами не установлено иммунофе-нотипических особенностей злокачественных мегакариобла-
Рис. 4. Клетки с иммунофенотипом CD61+42a+CD117+CD34+CD9+CD33-CD13-составляют 0,01% от всех зарегистрированных событий. Fig. 4. Cells with the CD61 + 42a + CD117 + CD34 + CD9 + CD33-CD13-immunophenotype make up 0.01% of all registered events.
1024
768
512
256
0 100
102
CD45 V500-A
■ Debris
■ CD61+42a -CD117+
■ CD34+ ■5
-CD9+ •7
■ CD33-CD13-
- CD41a+CD61+CD117+CD34+CD9+CD33-CD13-
стов, поэтому оценка МОБ проводилась на основании определения бластных клеток с мегакариоцитарными антигенами. Единственной иммунофенотипической особенностью можно было бы считать экспрессию на бластных клетках антигена CD9, однако для использования данного антигена в оценке МОБ требуется дальнейшее накопление материала. У пациентки отсутствовала t(1;22), хотя кариотип характеризовался рядом особенностей: 50,XX,+6,+7,+8:der(11)add(p15), +13,del(17)(q24).
Пример определения МОБ у ребенка 1 года и 8 мес (№4 в табл. 2) на 30-й день от постановки диагноза ОМегЛ. Морфологически пунктат костного мозга среднеклеточный, полиморфный. Бластные клетки составляют 2,4%, лимфоциты - 22,4%. В гранулоцитарном ростке отмечается незначительное ускорение созревания нейтрофилов. Выражена моноцитарная реакция (13,6%). Эритроидный росток редуцирован (2,8%). Количество мегакариоцитов снижено.
При определении МОБ использовались следующие маркеры (табл. 4).
При определении МОБ I этапом объединены клетки с коэкспрессией антигенов CD61+42a, CD117, CD34, CD9. Из полученной популяции исключены клетки с экспрессией CD13 и CD33. Итоговое содержание клеток, соответствующих иммунофенотипу таковых при диагностике, составило 0,01%; рис. 4.
Пример определения МОБ у ребенка 5 мес, №5 в табл. 2. Определение МОБ у данной больной проведено через 50 дней от момента диагностики по окончании индукционного курса AIE с Дакогеном. Морфологически пунктат костного мозга гипоклеточный. Бластные клетки составляют 2,8%, лимфоциты - 24,4%. Гранулоцитарный росток сужен (32,4%). Увеличено количество моноцитов (8,8%). Эритроидный росток раздражен (31,6%), есть явления дизэритропоэза. Мегакарио-циты в достаточном количестве.
Окрашены 2 пробы, набор маркеров представлен в табл. 5.
Ядросодержащие клетки в анализируемом образце костного мозга составили 96% (SYTO-41+). Отчетливой популяции (CD42a+CD61)-клеток не определялось, соответственно, нет подобных клеток с экспрессией CD33 (маркер присутствовал на мегакариобластах при диагностике). По-видимому, это можно рассматривать как эффективность проведенного лечения и МОБ-негативный статус.
Пример определения МОБ у пациента 7 лет, №6 в табл. 2.
Использованная при диагностике панель моноклональных антител указывала на мегакариобластный вариант острого
Рис. 5. Ядросодержащие клетки с экспрессией мегакариоцитарных антигенов CD61+42a+ в осях CD7/CD33.
Fig. 5. Nucleated cells with expression of megacariocytic antigen CD61+42a+ of CD7/CD33.
D
и
104
103
102
101
100
73,88% W .- ■'-'. ■..ï " ï'" s " '•• 3,92%
21,65% 0,55%
100
• Gate 2
• Gate 5
101 102 103
CD33 PerCP-Cy5-5-A
Gate 3 1
• CD42a+CD61 +
104
лейкоза с коэкспрессией антигена СБ7: СВ33+СБ13-CD7+CD(42a+61)+CD41+CD9+CD71+MPO-HLA-DR-CD117-СБ42Ъ-.
На 15-й день лечения произведено определение МОБ.
При морфологическом исследовании пунктат костного мозга крайне беден клеточными элементами. Подсчет произведен на 100 клеток. Бластные клетки не найдены; преобладают лимфоциты (94,0%). Умеренно выражена плазмоклеточная реакция (4,0%). Эритроидный росток отсутствует. Мегака-риоциты не найдены (уровень лейкоцитов крови - 0,59х109/л; тромбоциты - 8х109/л; гемоглобин - 9,8 г/дл).
При определении МОБ I этапом выделены ядросодержащие синглетные клетки, и в их пределах взяты в гейт клетки с экспрессией мегакариоцитарных антигенов (СD42a+CD61)^— 0,21% от миелокариоцитов.
Полученный гейт размещен в осях CD7/CD33. На рис. 5 видно, что коэкспрессия CD7 присутствует на 73,8% мегакариоцитарных клеток, в то время как CD33 практически отсутствует. Объединенный гейт (CD42a/CD61)+ CD7+ характеризуется слабой экспрессией CD45 (клетки-предшественники). Эти клетки составили 0,15% от миелокариоцитов. Данный процент клеток мог быть расценен как МОБ у данного пациента.
Повторное определение МОБ проведено на 34-й день лечения. По данным морфологического исследования пунктат костного мозга гипоклеточный. Бластные клетки не найдены, лимфоциты составляют 18,0%. В гранулоцитарном ростке (63,0%) отмечается преобладание зрелых форм (53,2%). Умеренно выражена моноцитарная реакция (13,8%). Содержание клеток эритроидного ростка снижено до 5,2%. Мегакариоциты единичные в препарате. На момент исследования уровень лейкоцитов крови составил 2,57х109/л, тромбоцитов - 72х109/л.
При проточно-цитометрическом определении МОБ в пределах гейта ядросодержащих клеток, исключающего дуплеты, выделены клетки с экспрессией CD42a, их количество составило 0,67%. Четкого кластера CD7+ событий в пределах клеток с экспрессией CD42a не наблюдалось, а в целом коэкспрессия CD7 на этих клетках составила 7,74%. Таким образом, клетки с иммунофенотипом, соответствующим таковому при диагностике лейкоза, - CD42a+CD33+CD13-CD7+ составили 0,02%, что близко к МОБ-негативному статусу.
Еще один пример. Мальчик, 1 год 7 мес, №7 в табл. 2. При диагностике определяется экспрессия миелоидного антигена CD33 при отсутствии CD117 и CD13, а также яркая экспрессия мегакариоцитарных антигенов CD42a, CD61, CD42b, CD41.
Поскольку в этом случае мегакариоцитарные маркеры мо-номорфно экспрессированы на бластах, оценка МОБ проводилась как при ОМегЛ и включала 2 пробы (табл. 6).
При оценке МОБ последовательно выделены клетки, экс-прессировавшие мегакариоцитарные антигены, в пределах
Таблица 7. Возрастные особенности состава клеток костного мозга Table 7. Age-related characteristics of the bone marrow cells
Популяции клеток костного мозга Процентное содержание клеточных популяций костного мозга в зависимости от возраста
дети до 1 года дети от 1 до 7 лет дети старше 7 лет взрослые до 70 лет
CD34+ миелобласты составляют в среднем 1,4% (от 1 до 2%) 0,9% (0,6-1,6%) 0,6% (0,2-1,1%) 0,7% (0,3 1,3%)
Нейтрофилы 10,7% (6,2-15,0%) 16,7% (6,9-26,4%) 21,4% (12,8-29,4%) 22,8% (12,9-30,8%)
Эритробласты 8,4-10,3% 12,5-15,1%
В-линейные предшественники 15,5% (2,2-32,9%) 9,0% (1,3-22,8%) 2,0% (0,2-4,9%) 0,9% (0,0-2,6%)
Зрелые В-лимфоциты 1,4 2,8
клеток-предшественников CD45low с низкими уровнями бокового рассеяния (SSC). При оценке коэкспрессии на этих клетках CD117 и CD34 уровень МОБ составил 0,006%, что по всем международным критериям соответствует МОБ-нега-тивному статусу.
Представленные примеры наглядно иллюстрируют возможности иммунодиагностики и определения уровней МОБ при ОМегЛ у детей.
Обсуждение
Нами приведены примеры диагностики и оценки МОБ при ОМегЛ у детей.
Интересно отметить, что у 3 пациенток младше 1 года в костном мозге присутствовало 2 популяции бластов: одна представлена нормальными В-линейными предшественниками, другая - опухолевыми мегакариобластами. В связи с этим необходимо остановиться подробно на особенностях кроветворения детей младшего возраста. Популяционный состав клеток костного мозга новорожденных и детей в возрасте менее 1 года значительно отличается от костного мозга детей более старшего возраста и взрослых [10]. В табл. 7 представлены возрастные особенности состава клеток костного мозга.
Таким образом, в костном мозге детей 1-2-го года жизни присутствуют популяции нормальных бластных клеток, относящихся к В-линейным и миелоидным предшественникам, и популяция В-линейных предшественников широко варьирует от 2,2 до 32,9%. Для точной морфоцитохимической и про-точно-цитометрической диагностики острого лейкоза необходимо тщательное разделение бластной популяции на нормальные В-линейные, миелоидные и опухолевые бласты.
Иммунологически опухолевые клетки представлены мега-кариобластами, на которых может присутствовать аберрантная коэкспрессия лимфоидных маркеров - чаще всего CD7, могут отсутствовать пан-миелоидные маркеры CD33 и CD13, а также отсутствовать некоторые из мегакариоцитарных маркеров, что также будет являться аберрантностью. Длительное время считалось, что мегакариоциты продуцируются общим бипотентным мегакариоцитарно-эритроидным предшественником (биМЭП). Иммунологически такая клетка в различных исследованиях охарактеризована как Lin-Sca1-cKit+ CD34-FcyRII/IIIlow/- или Lin-Sca1-cKit+CD41-CD150+ Endoglin-FcyRII/III-. Однако существовала гипотеза о том, что мегакариоцитопоэз протекает в обход биМЭП. В недавних исследованиях показано существование отдельной популяции гемопоэтических стволовых клеток, которые являются предшественниками клеток, продуцирующих тромбоциты. В крупных экспериментальных работах по трансплантации единственной клетки-предшественника также показано существование таких мегакариоцитарных предшественников, способных восстановить популяцию мегакариоцитов [17, 18]. Таким образом, в экспериментах получены данные о том, что клетка-предшественник мегакариоцитопоэза находится на более высоком уровне в иерархии гемопоэза, чем считалось прежде. Однако стадии мегакариоцитопоэза от такого предшественника до тромбоцитов все еще охарактеризованы недостаточно.
Для изучения мегакариоцитопоэза необходимо выделение ме-гакариоцитарных предшественников. Ранее для выделения из компартмента Lin-Sca1-cKit+ предшественников унипотентных мегакариоцитарных предшественников (уМКП) использовались такие маркеры, как CD9, CD41, CD150 в различных комбинациях. Однако ни один из этих маркеров не линейно-специфичный для мегакариоцитарной линии дифференцировки [18-20].
В исследовании H. Nishikii и соавт. [18] показано, что CD42b (гликопротеин Iba), который считается специфичным мембранным антигеном зрелых мегакариоцитов и тромбоцитов, экспрессируется уМКП внутри компартмента Lin-Sca1-cKit+. Также показано, что CD42b может использоваться для выделения уМКП: от 6 до 7% миелоидных предшественников с иммунофенотипом Lin-Sca1-cKit+CD34+FcyRII/RIIIlow/- в норме экспрессируют CD42b. В то же время CD42b отсутствует на Lin-Sca1+cKit+ (LSK) клетках, на гранулоцитарно-моноцитарных предшественниках (Lin-Sca1-cKit+CD34+ FcyRII/RIII+) и биМЭП. уМКП также имели мембранную экспрессию CD150, CD41high и CD9high, CD42c, CD42d и CD42a. При окраске по Романовскому-Гимзе уМКП имели морфологию одноядерных бластных клеток с базофильной цитоплазмой; морфологически сходство с мегакариоцитами отсутствовало. Через 5 дней культивации уМКП в жидких питательных средах в присутствии стволовоклеточного фактора роста и тромбопоэтина наблюдался рост однородной колонии крупных многоядерных клеток, морфологически сходных со зрелыми мегакариоцитами, позитивных по CD42b. При введении этих клеток мышам, получившим сублетальную дозу облучения, через 4 дня наблюдалось появление тромбоцитов в периферической крови. Также на этих клетках в отсутствие линейно-специфичных маркеров и Sca1 экспрессировались CD9 (ярко), CD150, CD41. Таким образом, сочетание CD42b и CD34 может использоваться для выделения уМКП.
Такой метод может применяться для установления уровня МОБ, так как количество клеток с иммунофенотипом Lin-cKit+(CD117+)CD34+CD42b+ в костном мозге здорового донора не превышает 0,1% [21-23]. В то же время остается необходимость в подсчете клеток с таким иммунофенотипом в регенерирующем после цитостатического воздействия костном мозге, так как данные о таком подсчете в мировой литературе единичны. Кроме того, при выделении клеток с иммуно-фенотипом Lin-cKit+(CD117+)CD34+CD42b+ при определении МОБ важно дополнительно определять клетки с аберрантным иммунофенотипом, соответствующим таковому при диагностике, например, клетки CD117+CD34+ CD42b+CD7+, CD117+CD34+CD42b+CD41- и CD117-CD34-CD42b+CD9+.
Таким образом, выявление остаточных опухолевых клеток в ремиссии ОМегЛ принципиально отличается от выявления МОБ при других вариантах ОМЛ благодаря специфичному иммунофенотипу и низкому содержанию мегакариобластов в здоровом костном мозге. В целом можно отметить, что ОМегЛ является морфологически гетерогенным заболеванием, и оценка ряда новых подходов, в частности компьютерного моделирования с использованием экспертных систем искусственного интеллекта, основанных на морфологических и иммунологических признаках клеток, может способствовать дальнейшему уточнению критериев диагностики МОБ.
Заключение
При определении МОБ между курсами ХТ необходимо учитывать аберрантность опухолевых клеток при первичной диагностике, так как количество клеток с экспрессией мегака-риоцитарных антигенов и мегакариоцитарных предшественников может быть увеличено по сравнению с нормой в связи с постцитостатической регенерацией костного мозга. Требуется использование нуклеотропных красителей для достоверного отделения ядросодержащих клеток с экспрессией мега-кариоцитарных антигенов от тромбоцитов. Также необходима широкая панель антигенов как при диагностике - для выявле-
ния опухолеассоциированного аберрантного иммунофеноти-па, так и при определении МОБ - для выделения клеток с истинной экспрессией мегакариоцитарных антигенов от миело-идных предшественников с агрегацией на них тромбоцитов. Построение унифицированных алгоритмов определения МОБ при ОМегЛ требует дальнейшего набора материала ввиду редкости заболевания и является перспективным, учитывая низкий процент мегакариобластов в норме.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Conflict of interests. The authors declare no conflict of interest.
Финансирование. Работа выполнена при финансовой поддержке гранта РФФИ №18-29-09115.
Financing. The work was carried out with the financial support of the RFBR grant No. 18-29-09115.
Литература/References
1. Von Boros J, Korenyi A. Uber einen fall von akuter megakaryocyblasten-leukamie, zugleich einige bemerkungen zum. Problem derakuten leukemie.Z Klin Med 1931; 118:679-718.
2. Hahn AW, et al. Acute megakaryocyticleukemia: What have we learned. Blood Rev 2015. DOI: 10.1016/j.blre.2015.07.005
3. Breton-Gorius J, Reyes F, Duhamel G, et al. Megakaryoblastic acute leukemia: identification by the ultrastructural demonstration of platelet peroxidase. Blood 1978; 51:45-60.
4. Bennett JM, Catovsky D, Daniel MT, et al. Criteria for the diagnosis of acute leukemia of megakaryocyte lineage (M7), a report of the French-American-British Cooperative Group Ann Intern Med 1985; 103:460-2.
5. WHO Classification of Tumours of Haematopoietic and Lymphoid Tissues (Revised 4th edition). Eds. Swerdlow SH, Campo E, Harris NL, et al IARC: Lyon, 2017; p. 163.
6. Луговская С.А., Почтарь М.Е. Гематологический атлас. 4-е изд. М.-Тверь: Триада, 2016 [Lugovskaya SA, Postman ME. Hematological atlas. 4th ed. Moscow-Tver: Triada, 2016 (in Russian)!.
7. Окороков А. Диагностика болезней внутренних органов. Кн. 5-1. М.: Мед. лит-ра, 2019; с. 700 [OkorokovA. Diagnosis of diseases of internal organs. Book. 5-1. Moscow: Med. liter, 2019; p. 700 (in Russian)].
8. Masettia R, Guidia V, Ronchinia L, et al. The changing scenario of non-Down syndrome acute megakaryoblasticleukemia in children. Crit Rev Oncol Hematol 2019; 138:132-8.
9. De Marchi F, Araki M, Komatsu N. Molecular features, prognosis, and novel treatment options for pediatric acute megakaryoblastic leukemia. Expert Rev Hematol 2019. DOI: 10.1080/17474086.2019.1609351
10. Pont J, Souvignet A, Campos L, et al. Accurate Quantification of Fourteen Normal Bone Marrow Cell Subsets in Infants to the Elderly by Flow Cytometry. Cytometry B Clin Cytom 2018; 94 (5): 627-36.
11. Carroll A, Civin C, Schneider N, et al. The t(1;22) (p13;q13) is nonrandom and restricted to infants with acute megakaryoblastic leukemia: a Pediatric Oncology Group Study. Blood 1991; 78 (3): 748-52.
12. Mercher T, Busson-Le Coniat M, Nguyen Khac F, et al. Recurrence of OTT-MAL fusion in t(1;22) of infant AML-M7. Genes Chromosomes Cancer 2002; 33:22-8.
13. Inaba H, Zhou Y Abla O, et al. Heterogeneous cytogenetic subgroups and outcomes in childhood acute megakaryoblastic leukemia: a retrospective international study. Blood 2015; 126 (13): 1575-84.
20.
21.
22.
23.
O'Brien MM, Cao X Pounds S, et al. Prognostic features in acute megakaryoblastic leukemia in children without Down syndrome: a report from the AML02 multicenter trial and the Children's Oncology Croup study POC 9421. Leukemia 2015; 344 (6188): 1173-8.
Ciri S, Pathak R, Prouet P, et al. Acute megakaryocytic leukemia is associated with worse outcomes than other types of acute myeloid leukemia. Blood 2014; 124 (25): 3833-4
van Dongen JJ, Lhermitte L, Böttcher S, et al. EuroFlow antibody panels for standardized n-dimensional flow cytometric immunophenotyping of normal, reactive and malignant leukocytes. Leukemia 2012; 26 (9): 1908-75. DOI: 10.1038/leu.2012.120; PMID: 22552007
Miyawaki K, Iwasaki H, Jiromaru T, et al. Identification of unipotent megakaryocyte progenitors in human hematopoie-
sis. Blood 2017; 129 (25): 3332-43. DOI: 10.1182/blood-2016-09-741611; PMID: 28336526
Nishikii H, Kanazawa Y, Umemoto T, et al. Unipotent Megakaryopoietic Pathway Bridging Hematopoietic Stem Cells and
Mature Megakaryocytes. Stem Cells 2015; 33 (7): 2196-207. DOI: 10.1002/stem.1985
Ferkowicz MJ, Starr M, Xie X, et al. CD41 expression defines the onset of primitive and definitive hematopoiesis in the
murine embryo. Development 2003; 130:4393-403; PubMed: 12900455
Deutsch VR, Tomer A. Advances in megakaryocytopoiesis and thrombopoiesis: From bench to bedside. Br J Haematol 2013; 161:778-93; PubMed: 23594368
Björklund E, Cruber A, Mazur J, et al. CD34+ cell subpopulations detected by 8-colorflow cytometry in bone marrow and in peripheral blood stem cell collections: application for MRD detection in leukemia patients. Int J Hematol 2009; 90 (3): 292-302. DOI: 10.1007/s12185-009-0389-z; PMID: 19728029
Wen Q Coldenson B, Crispino JD. Normal and malignant megakaryopoiesis. Expert Rev Mol Med 2011; 13: e32. DOI: 10.1017/S1462399411002043; PMID: 22018018; PMCID: PMC4869998 Macedo A, Orfao A, Ciudad J, et al. Phenotypic analysis of CD34 subpopulations in normal human bone marrow and its application for the detection of minimal residual disease. Leukemia 1995; 9 (11): 1896-901. PMID: 7475281
Статья поступила в редакцию / The article received: 17.12.2020 Статья принята к печати / The article approved for publication: 03.03.2021
ШШ
omnidoctor.ru
