CC BY
33
УДК 616.15-07
ДИАГНОСТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ БИОЛОГИЧЕСКИХ МАРКЕРОВ ПРИ ПЕРВИЧНЫХ СИСТЕМНЫХ НЕКРОТИЗИРУЮЩИХ ВАСКУЛИТАХ
В.И.Мазуров, С.ВДолгих Санкт-Петербургская медицинская академия последипломного образования Росздрава, Россия
THE SIGNIFICANCE OF THE BIOLOGIC MARKERS IN PRIMARY NECROTIZING VASCULITIS DIAGNOSIS
V.I.Mazurov, S.V.Dolgikh St.-Petersburg Medical Academy of Postgraduate Studies, Russia
© В.И.Мазуров, С.В.Долгих, 2010
В статье представлены результаты изучения диагностической значимости цитокинового и хемокинового звеньев иммунной системы, а также ростовых факторов при первичных системных некротизирующих васку-литах. Показаны различия в нарушении механизмов иммунорегуляции при этих заболеваниях. Установлена решающая роль хемокинов в инициации и поддержании иммуновоспалительного процесса при микроскопическом полиангиите, синдроме Черджа — Стросс, гранулематозе Вегенера и узелковым полиартериите.
Ключевые слова: первичные системные некротизирующие васкулиты, микроскопический полиангиит, синдром Черджа — Стросс, гранулематоз Вегенера, узелковый полиартериит, цитокины, хемокины, хемокино-вые рецепторы, ростовые факторы.
Article is devoted studying of the diagnostic importance of cytokines and chemokines, grows factors in primary necrotizing vasculitis. The main role chemokines in initiation and maintenance of inflammation process is established at microscopic polyangiitis, Churge-Strauss syndrome, Wegener’s granulomatosis and polyarteritis nodosa.
Key words: primary necrotizing vasculitis, microscopic polyangiitis, Churge-Strauss syndrome, Wegener’s granulomatosis, polyarteritis nodosa, cytokines, chemokines, growth factors.
Введение. В основе первичных системных васку-литов лежит развитие иммуновоспалительного процесса в сосудистой стенке, что сопровождается ишемией и некрозом органов и тканей, кровоснабжаемых соответствующими сосудами. Среди системных вас-кулитов особый интерес представляет группа первичных системных некротизирующих васкулитов (гра-нулематоз Вегенера, микроскопический полиангиит, синдром Черджа — Стросс и узелковый полиартериит), протекающих с поражением сосудов среднего и мелкого калибра и имеющих во многом сходную клиническую картину, что затрудняет их диагностику.
Достижение в понимании патогенеза системных васкулитов с поражением сосудов мелкого калибра относится к 80-м годам XX века, когда ^ Savige et а1. сообщили о выявлении антител, реагирующих с человеческими нейтрофилами (антинейтрофильные цитоплазматические антитела, АНЦА) у больных с нек-ротизирующими гломерулонефритами [1-3]. Методом непрямой иммунофлюоресценции при исследовании фиксированных спиртом человеческих нейтро-филов были выявлены три типа свечения: цитоплазматический (цАНЦА), перинуклеарный (пАНЦА) и гомогенный (аАНЦА). Первые антитела оказались специфичными в отношении протеиназы-3, вторые — миелопероксидазы. Гомогенное свечение характеризует так называемые атипичные АНЦА, их значение остается неясным до настоящего времени [4, 5].
Существуют две точки зрения на роль АНЦА при васкулитах. Первая основана на том, что АНЦА играют существенную роль в возникновении заболевания.
Это доказано в экспериментальных моделях с индуцированным васкулитом: введение крысам АНЦА, полученных от больных АНЦА-ассоциированными васкулитами, через некоторое время вело к развитию васкулита (в том числе гломерулонефрита) и, что особенно важно, происходило перекрестное реагирование и выработка АНЦА, но уже крысиных. Сторонники второй точки зрения утверждают, что АНЦА являются лишь кофактором, а не причиной развития ва-скулита [6, 7].
Однако около 20% АНЦА-ассоциированных системных васкулитов серонегативны по АНЦА. По мнению ряда авторов, в этих случаях инициация и поддержание иммуновоспалительного процесса происходит за счет цитокинового и хемокинового звеньев иммунной системы. Такие варианты представляют особый интерес в связи с трудностью диагностики, оценки активности заболевания и выбором адекватной тактики лечения.
Материалы и методы. В исследование были включены 53 больных с первичными системными некроти-зирующими васкулитами, разделенные на две группы. В первую группу вошел 31 больной с АНЦА-ассоции-рованными системными васкулитами (микроскопический полиангиит, синдром Черджа — Стросс и грану-лематоз Вегенера), у них медиана возраста была равна 53 годам, а медиана длительности заболевания — 18 месяцам. Вторую группу составили 22 больных с узелковым полиартериитом, серонегативные по АНЦА, у которых медианы возраста и длительности заболевания равнялись соответственно 51 году и 24 месяцам.
В I группе наблюдалось поражение кожи в 67% случаев, верхних дыхательных путей — в 27%, почек — в 49%. Во II группе вовлечение в иммунопатологический процесс сердечно-сосудистой системы отмечено у 81% больных, центральной нервной системы — у 44%, периферической нервной системы — у 51%.
Больные I и II групп получали лечение метотрексатом в дозе 10-15 мг в неделю, по показаниям назначали преднизолон в дозе 5-10 мг/сут. При высокой активности васкулита интенсифицировали лечение (пульс-терапия) с применением циклофосфана 1000 мг внутривенно однократно и метилпреднизоло-на в дозе 1000 мг три дня подряд.
Иммунологическое исследование включало определение содержания С-реактивного белка, иммуноглобулинов A, M, G, ревматоидного фактора, циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК), антинейтро-фильных цитоплазматических антител (АНЦА) к ми-елопероксидазе и протеиназе-3.
Методом проточной флюориметрии изучено содержание следующих цитокинов в периферической крови: фактор некроза опухоли-альфа (TNF-a), интерферон-гамма (IFN-y), антагонист рецептора интерлейкина-1 (IL-1ra), IL-1p, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-9, IL-10, IL-12, IL-13, iL-15, IL-17), а также уровни хемоки-нов IL-8, эотаксина (Eotaxin), интерферон-индуциру-емого протеина (IP-10), моноцитарного хемоаттрак-тантного белка-1 (MCP-1), макрофагального воспалительного протеина-1а (MIP-1a), макрофагального воспалительного протеина-1р (MIP-1P), Regulated on Activation, Normal T-cell Expressed and Secreted (RANTES) и факторов роста — фактора роста фиброб-ластов (FGF), гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (G-CSF), гранулоцитарно-макрофа-гального колониестимулирующего фактора (GM-CSF), тромбоцитарного фактора роста (PDGF-BB), васкулоэндотелиального фактора роста (VEGF).
Содержание матричной РНК хемокинов (Eotaxin, Eotaxin-2, IL-8, MIP-1a, MIP-1P, RANTES) и хемоки-новых рецепторов (CCR1, CCR3, CCR5, CXCR1, CXCR2) в периферической крови определяли методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). Полученные результаты экспрессии матричной РНК хемоки-нов и хемокиновых рецепторов были оценены относительно р-актина (полуколичественная оценка ПЦР).
Для оценки активности системного васкулита использованы Бирмингемская шкала активности васкулита (BVAS) и индекс повреждения васкулита (VDI), которые исходно в группах не различались. Так в I группе шкала BVAS составила 12 [9; 21] баллов, индекс VDI — 5 [3; 7] баллов, а во II группе, соответственно — 11 [8; 16] баллов и 5 [3; 9] баллов, что характеризовало наличие у больных низкой и средней степени активности иммуновоспалительного процесса.
Контрольную группу составили 20 человек без аутоиммунной патологии, медиана их возраста была сопоставима с группами обследованных больных — 50,5 лет.
Полученные данные обработаны программной системой STATISTICA (версия 8.0) при помощи непара-
метрических методов (критерии Манна — Уитни, Вилкоксона, %2-Пирсона, Мак-Намара, ANOVA Крас-келла — Уоллиса). За критерий статистической достоверности принимали р<0,05.
Результаты исследования и их обсуждение. При изучении провоспалительных цитокинов выявлен более высокий уровень И.-6 у пациентов I и II групп (6,2 пг/мл и 4,3 пг/мл соответственно) по сравнению с контрольной группой (1,8 пг/мл). Уровень 1Ь-1Р у больных АНЦА-ассоциированными системными ва-скулитами, в отличие от больных II группы, был достоверно выше (0,47 пг/мл), чем в группе контроля (0,02 пг/мл). Содержание фактора некроза опухоли-а в крови у пациентов I, II группы и контрольной группы лиц статистически значимо не различалось (рис. 1).
Пг/мл
151
10-
5-
0
□ АНЦА-системный васкулиты ]] Узелковый полиартериит Контроль * * — р<0,05
TNF-a
IL-6
IL-lb
Рис. 1. Уровни провоспалительных цитокинов в сыворотке крови у обследованных больных
Можно полагать, что при АНЦА-ассоциированных системных васкулитах и узелковом полиартериите в развитии и поддержании иммуновоспалительного процесса важная роль принадлежит И.-6 и И,-1р.
Уровни противовоспалительных цитокинов ^Ь-10 и антагонист рецептора к И.-1) оказались выше у больных I группы по сравнению с контрольной группой лиц и составили соответственно 1,15 пг/мл и 224 пг/мл. Достоверных различий между содержанием И.-10 и антагониста рецептора к И.-1 у обследованных I и II групп выявить не удалось (рис. 2).
Приведенные данные дают основание считать, что повышение продукции И.-10 и антагониста рецептора к И.-1 у больных АНЦА-ассоциированными системными васкулитами является закономерной реакцией иммунной системы в ответ на повышенное содержание провоспалительных цитокинов (!Ь-1р и И.-6).
У больных АНЦА-ассоциированными системными васкулитами, в отличие от больных с узелковым полиартериитом, выявлен достоверно более высокий уровень И.-2 и интерферона-гамма (4,7 пг/мл и 26,9 пг/мл), по сравнению с группой контроля, что свидетельствует об активации ТЫ-клеток (Т-хелпе-ров 1 типа).
Установлен также значимо более высокий уровень стимулятора пролиферации и дифференцировки В-лимфоцитов — И.-13 — у обследованных I и II групп (4,9 пг/мл и 3,9 пг/мл, соответственно), чем в группе контроля (0,3 пг/мл). На основании полученных данных можно полагать, что АНЦА-ассоциированные системные васкулиты имеют общие механизмы нарушения иммунорегуляции, характеризующиеся активацией ^2-клеток (Т-хелперов 2-го типа).
Пг/мл
200-
100-
Пг/мл 1,00,5-
I АНЦА -системный васкулиты ^ Узелковый полиартериит Контроль
* - р<0,05
IL-lra
IL-10
Рис. 2. Уровни противовоспалительных цитокинов в сыворотке крови у обследованных больных
Уровни IL-4 и IL-5 оказались значимо выше у больных AНЦA-ассоциированными системными васкули-тами по сравнению с контрольной группой. При этом более высокий уровень IL-5 наблюдался у пациентов I группы (1,9 пг/мл), по сравнению с больными узелковым полиартериитом (0,9 пг/мл).
Обращал на себя внимание и тот факт, что достоверно более высокий уровень IL-17 также отмечался у больных AНЦA-ассоциированными системными васкулитами (15,9 пг/мл), по сравнению с контрольной группой лиц (7,1 пг/мл). Известно, что IL-17, продуцируемому Th 17, отводится большое значение в развитии аутоиммунной патологии в связи с его способностью активировать продукцию провоспали-тельных цитокинов.
Содержание IL-12, основного регулятора Т-клеточ-ного звена иммунной системы, было значимо выше
лейкинов (И.-2, И.-5, И.-4, ^-7, ^-9, ^-13, ^-15 и И.-17) у обследованных I группы, скорее всего, имеют прямую связь с формированием антинейтрофиль-ных цитоплазматических антител.
Таким образом, на основании полученных нами результатов можно полагать, что у больных с первичными системными некротизирующими васкулитами нарушения иммунорегуляции имеют общие закономерности, но у больных с АНЦА-ассоциированными системными васкулитами повышены уровни цитокинов ТЫ, Th2, Th17 клеток, а у пациентов с узелковым полиартериитом — уровни !Ь-6, !Ь-9 и !Ь-13.
Уровни гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (GM-CSF) и васкулоэн-дотелиального фактора роста (VEGF) у обследованных I и II групп были статистически выше, чем у лиц контрольной группы (табл. 1).
Уровни факторов роста в крови у больных I и II групп, Me [LQ; HQJ
Таблица 1
Показатель, пг/мл Группа контроля (п=20) I группа (п=49) II группа (п=36) Р2-3 Р2-4 Рз-4
1 2 3 4 5 6 7
G-CSF 15,1 17,2 13,8 >0,05 >0,05 >0,05
[13,8; 7,1] [11,4; 24,3] [10,9; 19,0]
GM-CSF 4,3 9,9 7,4 0,0009 0,05 >0,05
[3,7; 7,0] [5,7; 16,3] [4,8; 12,3]
FGF basic 14,4 27,3 16,9 >0,05 >0,05 >0,05
[9,6; 17,1] [14,3; 35,8] [ЗД; 30,8]
PDGF-BB 892 1046 1255 >0,05 >0,05 >0,05
[508; 1017] [877; 2273] [485; 2036]
VEGF 4,1 10,2 6,9 0,009 0,05 >0,05
[2,7; 8,7] [6,5; 12,8] [4,4; 18,4]
у больных I и II групп (4,3 пг/мл и 3,1 пг/мл), чем в контрольной группе (1,9 пг/мл). Важно отметить, что у пациентов с АНЦА-ассоциированными системными васкулитами его концентрация оказалась выше, чем у больных с узелковым полиартериитом (р<0,05). Уровни стимуляторов гемопоэза и предшественников костномозговых лимфоцитов (И.-7 и !Ь-9), а также I,-15 были значимо выше в I группе по сравнению с группой контроля (р<0,05). У пациентов с узелковым полиартериитом содержание этих цитокинов в сыворотке крови существенно не отличалось от нормы.
Известно, что АНЦА-ассоциированные системные васкулиты и узелковый полиартериит относятся к ги-поиммунным, поэтому более высокие уровни интер-
Таким образом, полученные данные подтверждают важную роль GM-CSF в стимуляции макрофагально-го звена иммунной системы и VEGF в неоангиогене-зе при иммуновоспалительном процессе, который лежит в основе диффузных заболеваний соединительной ткани, в том числе первичных системных некро-тизирующих васкулитов.
При оценке хемокиновой регуляции удалось установить, что у больных I и II групп наблюдалось статистически значимое повышение уровней таких хемоки-нов, как эотаксин (CCL11/Eotaxin), интерферон-инду-цируемый протеин (CXCL10/IP-10), макрофагальный воспалительный протеин-ф (CCL4/MIP-1ß) и интерлейкин-8 (CXCL8/IL-8) по сравнению с группой конт-
роля. Статистически значимых различий в содержании исследуемых хемокинов между обследованными группами больных выявить не удалось (табл. 2).
Повышение уровня указанных хемокинов ведет к усилению хемотаксиса Т-лимфоцитов, макрофагов и гранулоцитов в очаг воспаления. Можно полагать, что
вие обусловлено нарушением этапов синтеза и продукции указанных хемокинов у больных АНЦА-ассо-циированными системными васкулитами и узелковым полиартериитом.
Таким образом, на основании полученных данных можно полагать, что первичные системные некроти-
Уровни хемокинов в крови у больных I и II групп, Me [LQ; HQ]
Таблица 2
Показатель, пг/мл Группа контроля (п=20) I группа (п=49) II группа (п=36) Р2-3 Р2-4 Рз-4
1 2 3 4 5 6 7
CCL2/MCP-1 0,12 [0,09; 0,15] 0,17 [0,14; 0,22] 0,14 [0,11; 0,22] 0,002 >0,05 >0,05
CCL3/MIP-16 3,2 [3,0; 3,6] 4,1 [3,3; 5,2] 3,4 [2,7; 4,4] 0,07 >0,05 >0,05
CCL4/MIP-1B 11,0 [8,2; 13,3] 19,1 [16,6; 26,1] 15,6 [13,3; 19,9] 0,00008 0,005 >0,05
CCL5/RANTES 144,1 [142,5; 149,1] 150,3 [146,5; 153,5] 146,1 [144,1; 150,9] 0,008 >0,05 0,06
CCL11 /Eotaxin 7,7 [6,7; 10,0] 19,7 [15,6;25,3] 17,9 [12,3; 26,8] 0,00002 0,0001 >0,05
ltCXCL8/IL-8 0,7 [0,5; 1,4] 1,9 [1,5;2,8] 1,5 [1,2; 2,9] 0,00003 0,002 >0,05
CXCLIO/IP-IO 45,6 [32,4; 53,2] 130,7 [102,4; 274,9] 1159 [73,5; 201,4] 0,00001 0,00003 >0,05
их роль возрастает по мере увеличения активности им-муновоспалительного процесса. Данное положение явилось основанием для изучения экспрессии матричной РНК хемокинов и хемокиновых рецепторов методом ПЦР. Оказалось, что у больных I и II групп экспрессия мРНК эотаксина-2 (ССЬ24/Ео1ахт-2), интерлейкина-8 (СХСЬ8/1Ь-8), макрофагального воспалительного протеина-1 в (ССЫ/М1Р-1Р) и CCL5/RANTES была достоверно ниже, чем в контрольной группе. При этом уровень экспрессии мРНК эотаксина (С^11/Ео1ахт) и макрофагального воспалительного протеина-1а (ССО/М1Р-1а) у пациентов с узелковым полиартериитом, в отличие от пациентов I группы, был существенно ниже, чем в группе контроля (р<0,05).
При изучении экспрессии мРНК хемокиновых рецепторов удалось установить более высокий уровень мРНК CCR-3 у больных с узелковым полиартериитом (93,7 ед.), по сравнению с контрольной группой (80,6 ед.). Достоверных различий между уровнями экспрессии мРНК других хемокиновых рецепторов у больных с АНЦА-ассоциированными системными васкулитами и узелковым полиартериитом по сравнению с уровнями в контрольной группе не выявлено. Низкая экспрессия мРНК хемокинов в сочетании с их высокими уровнями в крови у больных I и II групп дают основание полагать, что это несоответст-
зирующие васкулиты имеют общие нарушения механизмов иммунорегуляции, в основе которых лежит дисбаланс между провоспалительными, противовоспалительными и регуляторными цитокинами, а также хемокинами.
Выводы
1. Поддержание иммуновоспалительного процесса у больных с первичными системными некротизирую-щими васкулитами осуществляется через провоспали-тельные цитокины интерлейкин-6 и интерлейкин-1а.
2. При микроскопическом полиангиите, грануле-матозе Вегенера, синдроме Черджа — Стросс наблюдается повышение уровней цитокинов, продуцируемых ТЫ, ^2, ТЫ7 клетками, в то время как у больных с узелковым полиартериитом отмечено увеличение продукции лишь ^-6, ^-9 и ^-13.
3. Гранулоцитарно-моноцитарный и васкулоэндо-телиальный факторы роста играют важную роль в стимуляции макрофагального звена иммунной системы и процессах неоангиогенеза при первичных системных некротизирующих васкулитов.
4. У больных с АНЦА-ассоциированными системными васкулитами и узелковым полиартериитом выявлено нарушение соотношения этапов синтеза и продукции различных хемокинов.
Литература
1. Kallenberg C.G. Pathogenesis of PR3-ANCA associated vasculitis // C.G. Kallenberg // J. Autoimmun.— 2008.— Vol. 30, № 1-2.— P. 29-36.
2. Savige J. Antineutrophil cytoplasmic antibodies and associated diseases: a review of the clinical and laboratory features / J. Savige // Kidney Int.— 2000.— Vol. 57.— P. 846-862.
3. Schönermarck U. Prevalence and spectrum of rheumatic diseases associated with proteinase 3-antineutrophil cytoplasmic antibodies (ANCA) and myeloperoxidase-ANCA / U. Schonermarck // Rheumatology (Oxford).— 2001.— Vol. 40, № 2.— P. 178-184.
4. Csernok E. A. critical evaluation of commercial immunoassays for antineutrophil cytoplasmic antibodies directed against proteinase 3 and myeloperoxidase in Wegener’s granulomatosis and microscopic polyangiitis / E. Csernok // Rheumatology (Oxford).— 2002.— Vol. 41, № 11.— P. 1313-1317.
5. Csernok E. Anti-neutrophil cytoplasmic antibodies and pathogenesis of small vessel vasculitides / E. Csernok // Autoimmun. Rev.— 2003.— Vol. 2, № 3.— P. 158-164.
6. D’Agati V. Antineutrophil cytoplasmic antibody and vasculitis: much more than a disease marker / V. D’Agati // J. Clin. Invest.— 2002.— Vol. 110, № 7.— P. 919-921.
7. Harper L. IgG from myeloperoxidase-antineutrophil cytoplasmic antibody-positive patients stimulates greater activation of primed neutrophils than IgG from proteinase 3-antineutrophil cytosplasmic antibody-positive patients / L. Harper // Arthritis Rheum.— 2001.— Vol. 44, № 4.— P. 921-930.
