CC BY
8the main links in the epizootic process. From May to December, the number of reported cases of calves incidence is 28,73%.
Сведения об авторах:
Шевченко Александр Алексеевич, доктор ветеринарных наук, профессор, заведующий кафедрой микробиологии, эпизоотологии и вирусологии, ФГБОУ ВПО «Кубанский государственный аграрный университет имени И. Т. Трубилина»; дом 13, ул. Калинина, г. Краснодар, Россия, 350044; тел.: +7 (918) 154-94-61; e-mail: Shevchenkoalexsandr@rambler.ru.
Торопыно Анастасия Викторовна, аспирантка кафедры микробиологии, эпизоотологии и вирусологии, ФГБОУ ВПО «Кубанский государственный аграрный университет имени И. Т. Трубилина», дом 43, ул. Котлостроительная, г. Таганрог, Россия, 347910; тел.: +7 (951) 845-06-79; e-mail: toropyno.89@mail.ru
Author affiliation:
Shevchenko Alexander Alexeevich, D. Sc. in Veterinary Medicine, Professor, Head of the Department of Microbiology, Epizootology and Virology, of the Federal State Budgetary Educational Institution (FSBEI) of Higher Professional Education (HPE) «Kuban State Agrarian University named after I. T. Trubilin»; house 13, Kalinin str. Krasnodar city, Russia, 350044; phone: + 7 (918)154-94-61; e-mail: Shevchenkoalexsandr@rombler.ru.
Toropyno Anastasia Viktorovna, postgraduate student of the Department of Microbiology, Epizootology and Virology of the Federal State Budgetary Educational Institution (FSBEI) of Higher Professional Education (HPE) «Kuban State Agrarian University named after I. T. Trubilin» house 43, Kоtlostroitelnaya str., Taganrog city, Russia, 347910; phone: + 7 (951) 845-0679; e-mail: toropyno.89@mail.ru
УДК 579.253
Воробьев А. Л., Гордиенко Л. Н.
ДИАГНОСТИЧЕСКАЯ ЭФФЕКТИВНОСТЬ БРУЦЕЛЛЕЗНОГО АНТИГЕНА, СОДЕРЖАЩЕГО СПЕЦИФИЧЕСКИЙ ФАГ
Ключевые слова: бруцеллез, бактериофаги, лизогения, изменчивость, диссоциация, Ь-трансформация, диагностика
Резюме: Как свидетельствуют данные наших экспериментов, лизогения и диссоциация бруцелл взаимосвязаны - вначале происходит индукция бактериофагов под влиянием каких-либо внешних или внутренних факторов биотического или абиотического характера на микробную клетку (лизогенизация) и лишь затем наблюдается процесс диссоциации или трансформации, то есть переход бруцелл из 8- в Я- или Ь-форму, так как ранее установили, что Ь-формы и диссоциированные под влиянием фага бруцеллы имеют тождественные биологические признаки. Также обнаружили, что свежевыделенные культуры бруцелл не отличаются от старых лабораторных или вакцинных штаммов ни по культуральным, ни по биохимическим свойствам, но отличаются одной важной особенностью — старые лабораторные или вакцинные штаммы не ли-зогенны и не способны продуцировать фаг. Следовательно, наличие у животных, в том числе иммунизированных противобруцеллезными вакцинами, антифаговых антител или нативного фага свидетельствует об инфицированности их эпизоотическими культурами бруцелл. Включение специфического фага в состав диагностикумов позволит выявлять нетипичные бруцел-
лы - диссоцианты и Ь-формы. Это связано с тем, что 8-Я переход проявляется лизогенизацией бактерий, в процессе Ь-трансформации также происходит лизогенизация бруцелл. Продуцируемый лизогенными бактериями в окружающую среду (макроорганизм) фаг вызывает выработку специфических антифаговых антител и, так как различные бруцеллезные фаги имеют идентичные антигенные детерминанты, обнаружение антител к бруцеллезным фагам позволит распознать инфекцию, вызываемую нетипичными вариантами бруцелл. Таким образом, использование бруцеллезного антигена, содержащего специфический фаг, позволит усовершенствовать диагностику данной инфекции, в частности, будет способствовать более полному выявлению животных, больных латентной формой бруцеллеза или инфицированных нетипичными вариантами возбудителя.
Введение
В последнее время важное значение приобретают патогены необычной природы, в частности, трансмиссивные генетические детерминанты патогенности (ТГДП), к которым относятся плазмиды, транспо-зоны и фаги. ТГДП ведут себя как генетические симбиоты и даже паразиты, сами обусловливают инфекционный процесс при заражении бактериальных клеток, как хозяев первого порядка. Являясь носителями собственной, то есть чужеродной для реципиентов генетической информации, транспозоны, плазмиды и фаги сообщают последним многие дополнительные свойства. Благодаря этому бактерии-реципиенты приобретают способность реализовы-вать многочисленные полезные функции, дающие им разнообразные защитные, метаболические и в целом селективные преимущества. Бактерии-хозяева ТГДП являются лишь экологическими носителями и векторами последних с факультативной транзиторной патогенностью, обеспечивая двухуровневый эпидемический процесс. Иными словами, эпидемический процесс возможен как вторичный, при заносе в популяцию бактерий-возбудителей той или иной ТГДП и развитие первичного эпидемического процесса (возникновение, распространение) на основе межпопу-ляционных взаимодействий ТГДП и их хозяев по аналогии с саморегулирующимися паразитарными системами [1].
С эволюционной точки зрения бактериофаги можно рассматривать как особый класс плазмид, накопивших наследственную информацию, необходимую для синтеза белковой головки фага, в которую заключается генетический материал. Таким образом, эволюция фаговой ДНК привела к образованию инфекционных плазмид, которые в одеянии фаговых частиц способны существовать вне протоплазмы и в таком виде переходить от одного хозяина к другому [2].
Для микробов, постоянно сосуществу-
ющих в организме в условиях паразитоце-ноза, дополнительные приспособительные механизмы, которые реализуются с помощью эписом, имеют первостепенное значение. Умеренные фаги, как эписомные элементы, и бактерии выступают как единая генетическая система (при лизогении и конверсии фаговый геном составляет часть бактериального генома, а при транс-дукции фрагмент бактериального генома входит в геном фага). И в этой паразитарной системе постоянно происходит генетический обмен как внутривидовой, так и между различными видами экологически и филогенетически связанными между собой [3].
О значительном распространении ли-зогении у бруцелл свидетельствуют данные И. А. Косилова [4], который в своих работах показал, что лизогенные штаммы среди первых генераций эпизоотических культур бруцелл достигают 70-80%.
Изменение свойств бактерий, в том числе способности к передаче генов, тесно связано с фаговой конверсией. При этом типе взаимодействия свой фенотип изменяют инфицированные фагом бактерии. Многие свойства конвертирующих фагов, связанные с их влиянием на изменчивость бактерий, стали понятны после открытия мигрирующих и встраивающихся элементов. В составе фагов обнаружены транспо-зоны, определяющие устойчивость к различным антибиотикам, способность утилизировать углеводы, синтезировать термостабильный эндотоксин и др. Сам фаг в ли-зогенном состоянии может индуцировать изменение поверхностных структур бактериальных клеток, что предотвращает адсорбцию и инфекцию другими фагами [5].
Фаговая конверсия изменяет антигенные свойства не только лизогенизирован-ных, но и чувствительных к фагу бактерий, которые в дальнейшем лизируются. Это говорит о том, что информация, касающаяся синтеза антигена, не обязательно локализована в пределах обычной поли-
нуклеотидной информации бактерий. Информацию, необходимую для образования (или активизации) фермента, контролирующего синтез компонентов клеточной поверхности, очевидно, несет ДНК некоторых фагов, даже в том случае, если она не интегрирована полностью с бактериальной ДНК. Сам процесс конверсии протекает очень быстро: новый антиген синтезируется спустя несколько минут после заражения клетки фагом и не исчезает до тех пор, пока клетка находится в лизогенном состоянии или, если это вирулентный фаг, вплоть до наступления лизиса [6].
Предполагают, что L-формы происходят из типичных бактериальных форм, когда те находятся в условиях, неподходящих для нормального развития. Эти условия включают воздействие антибиотиков, таких как пенициллин, защитные механизмы хозяина, такие как антитела и система комплемента, температура, неадекватные среды и воздействие бактериофага. Бактериофаг, возможно, является наиболее важным условием в развитии L-форм. Многие ситуации, подходящие для развития L-форм (аутолизирующие культуры, антагонизм штаммов, присутствие определенных ингредиентов и т.п.), служат условиями, обычно наблюдаемыми в результате или, как необходимость проявления действия фага. Обнаружено еще одно доказательство в поддержку «фаговой гипотезы» относительно развития L-форм. Оно заключается в том, что на газоне сплошного роста L-форм бруцелл наблюдается образование негативных колоний. Развитие негативных колоний замедляется или полностью прекращается при внесении в среду акрифлавина (ингибитора фага). Если негативные колонии внести в бульон с культурами В. abortus, suis, melitensis, то после инкубации (37 °С) и фильтрации в фильтрате регистрировали наличие фага в высоких титрах против одного или нескольких штаммов обогащения [7].
По мнению Е. Nelson, M. Pickett [7], в крови человека только тогда появляются условия для развития L-форм, когда в ней одновременно присутствуют и бруцеллы, и бруцеллезный бактериофаг. Случаи, когда у лиц, инфицированных бруцеллами, отсутствует клиника заболевания, авторы объясняют подавлением вирулентной формы возбудителя присутствием бруцеллезного бактериофага, который обусловливает появление авирулентных вариантов бру-целл, в том числе L-форм, как остаточных форм возбудителя в организме. При этом
они предполагают, что указанные варианты при соответствующих условиях могут дать начало гладким вирулентным бру-целлам, а, следовательно, и генерализации инфекции. Лизис клеток, кроме появления фага, сопровождается образованием и фильтрующихся форм, о чем свидетельствовали положительные результаты опытов по выделению из фильтратов индуцированных культур, кроме фага, штаммов вторичных культур, которые устойчивы к фагу и, быть может, являлись L-формами [8].
В результате влияния фага на бруцел-лы происходят морфологические изменения клеток бактерий - появляются крупные зернистые формы и цепочки [9]. Подобные морфологические изменения присущи и L-формам бруцелл [10].
При воздействии фага ТБ на бруцеллы получены формы, по морфологии колоний и клеток сходные с L-формами бактерий. Эти варианты оказались нестойкими (после одного пассажа через организм морских свинок) и реверсировали в нормальные высоковирулентные культуры [11]. Персистенцию измененных L-форм бру-целл и процессы, вызываемые ими, невозможно выявить при помощи стандартных S-диагностикумов, так как каждая форма имеет специфические детерминанты и не дает перекрестных реакций с гетерологич-ными бруцеллезными антигенами и антисыворотками [12].
Примером реализации молекулярно-генетических механизмов изменчивости популяций патогенных микроорганизмов может служить диссоциация. При диссоциации могут одновременно изменяться два важнейших признака - антигенная структура и вирулентность. Кроме того, меняются и другие свойства, в том числе устойчивость во внешней среде, биохимическая активность, способность воспринимать поток генов, протекающих через микробную популяцию, и некоторые другие. К настоящему времени накопилось большое количество данных, которые позволяют рассматривать диссоциацию как один из общих и универсальных механизмов, присущих популяциям микроорганизмов и обеспечивающий поддержку их соответствия меняющимся условиям внешней среды. Полученные данные свидетельствуют об участии в процессе диссоциации внехро-мосомных факторов наследственности, а именно: бактериофагов, плазмид и, вероятно, мигрирующих генетических элементов, обусловливающих высокую частоту
диссоциативного процесса. Таким образом, R-форма и фаг - естественная эколого-па-разитарная система, проявляющаяся в организме под влиянием неблагоприятных факторов, возникающая в процессе диссоциации [5].
Как свидетельствуют данные наших экспериментов, лизогения и диссоциация бруцелл взаимосвязаны. Вначале происходит индукция бактериофагов под влиянием каких-либо внешних или внутренних факторов биотического или абиотического характера на микробную клетку (лизогенизация) и лишь затем наблюдается процесс диссоциации или трансформации, то есть переход бруцелл из S- в R- или L-форму, так как ранее установили, что L-формы и диссоциированные под влиянием фага бруцеллы имеют тождественные биологические признаки [13].
Кроме того, обнаружили, что свежевы-деленные культуры бруцелл не отличаются от старых лабораторных или вакцинных штаммов ни по культуральным, ни по биохимическим свойствам, но отличаются одной важной особенностью — старые лабораторные или вакцинные штаммы не ли-зогенны и не способны продуцировать фаг. Следовательно, для дифференциации инфицированных бруцеллами животных от иммунизированных противобруцеллезны-ми вакцинами необходимо проводить серологическую диагностику, направленную на выявление антифаговых антител или нативного фага [14].
Таким образом, вышеизложенное позволяет сделать вывод о том, что наличие у животных, в том числе иммунизированных противобруцеллезными вакцинами, антифаговых антител или нативного фага свидетельствует об инфицированности их эпизоотическими культурами бруцелл.
Включение специфического фага в состав диагностикумов позволит выявлять нетипичные бруцеллы - диссоцианты и L-формы. Это связано с тем, что S-R переход проявляется лизогенизацией бактерий, в процессе L-трансформации также происходит лизогенизация бруцелл. Продуцируемый лизогенными бактериями в окружающую среду (макроорганизм) фаг вызывает выработку специфических антифаговых антител и, так как различные бруцеллезные фаги имеют идентичные антигенные детерминанты, обнаружение антител к бруцеллезным фагам позволит распознать инфекцию, вызываемую нетипичными вариантами бруцелл [5, 7, 14, 15].
В настоящее время для массовых се-
рологических исследований на бруцеллез пользуются единым бруцеллезным антигеном для РА, РСК и РДСК, приготовленным из бруцелл вакцинного штамма B. abortus 19. Применение данного антигена не позволяет выявить всех больных бруцеллезом, в особенности с латентной формой инфекции или являющихся носителями нетипичных вариантов возбудителя.
С целью повышения диагностической ценности бруцеллезного антигена нами сконструирован комбинированный антиген, включающий антигенные детерминанты бактериального возбудителя и специфического бруцеллезного фага [16].
Теоретической предпосылкой для создания антигена, содержащего фаг, послужили данные, полученные рядом исследователей, которые установили наличие бактериофага в организме больных бруцеллезом. При этом титр фага и антифаговых антител зависел от продолжительности болезни, чем длительнее период от начала заболевания, тем выше титр бактериофага и антифаговых антител [7, 17].
Из вышеизложенного следует: антифаговые антитела циркулируют в организме больных бруцеллезом, причем присутствие антифаговых антител в сыворотке крови свидетельствует о том, что в макроорганизме находятся жизнеспособные бру-целлы, так как репродукция фага возможна только в живых бактериях. Кроме того, антиген, содержащий специфический фаг, способен вступать в реакцию как с антибруцеллезными, так и антифаговыми антителами, что повышает его чувствительность и специфичность.
Материалы и методы исследований
Компонентами для приготовления комплексного антигена служил вакцинный штамм B. abortus 19, на который адсорбировали специфический бактериофаг ТБ.
Бактериальную массу для получения антигена выращивали на рекомендуемых для бруцелл плотных питательных средах. Размножение фага ТБ проводили в бактериальных клетках штамма 19 в обычной для бруцелл жидкой питательной среде.
Бруцеллезный фаг адсорбировали на бруцеллах из расчета 10-100 ф.к. на 1 м.к. в течение 22-24 часов при температуре 2-4 оС. Затем взвесь бактерий с адсорбированным фагом центрифугировали (5000-6000 об/мин) 30 мин, надосадочную жидкость удаляли. Из суспензии бруцелл, находящихся в осадке, готовили 100 млрд взвесь
на 0,5% фенолизированном физрастворе. Данную взвесь подвергали титрации для установления рабочих титров в реакции агглютинации, связывания комплемента или других серологических реакций, в том числе для Роз-бенгал пробы в соответствующих диагностических тестах по общепринятым методикам.
Роз-бенгал антиген готовили путем окрашивания 100 млрд суспензии бруцелл с адсорбированным фагом краской Роз-бенгал. Окрашенную суспензию бруцелл разводили лимонно-фосфатной буферной смесью (рН 3,6), изготовленной на 5% растворе хлористого натрия.
Приготовленные по данному способу опытные антигены испытывали на активность и чувствительность в сравнении с биофабричными бруцеллезными антигенами.
Результаты и обсуждение
Изучение активности проводили путем титрации опытного и биофабричного (контроль) антигенов в РА и РДСК с бруцеллезной биофабричной сывороткой. При этом установили, что в РА в разведении сыворотки 1:50, предельный титр комбинированного антигена составил 1:80, стандартного 1:160. В разведении сыворотки 1:100, предельный титр комбинированного был 1:20, биофабричного 1:80. В РДСК, в разведении сыворотки 1:10, предельный титр опытного и стандартного антигенов наблюдали в разведениях 1:640 и 1:1280 соответственно.
Определение чувствительности комбинированного антигена, в сравнении с биофабричным, осуществляли в РА, РДСК и РБП с иммунными сыворотками, полученными на различные виды и формы бру-целл.
Как видно из данных табл. 1., с S-, SR-и R-бруцеллезными сыворотками зарегистрированы идентичные результаты с обоими антигенами. С L-иммунной сывороткой биофабричный антиген в РА давал негативные показания, в то время как комбинированный вступал в реакцию. Овис-ная биофабричная сыворотка давала положительные результаты с опытным антигеном, в контроле наблюдали отрицательные реакции.
Изучение специфичности комбинированного антигена в РБП, РА и РДСК провели на 1216 сыворотках крупного рогатого скота из благополучных по инфекционным заболеваниям хозяйств. Во всех случаях с испытуемым и коммерческим анти-
генами в этих реакциях получили отрицательные результаты, что является показателем их высокой специфичности.
Чувствительность антигена, содержащего фаг, определяли в РБП, РА и РДСК на 26 сыворотках крупного рогатого скота, экспериментально зараженного штаммом B. abortus 54 и больных животных из неблагополучных по бруцеллезу стад (табл. 2.).
Комбинированный антиген использовали в рабочем разведении, установленном при титрации. Контролем служил биофабричный бруцеллезный антиген.
Как видно из табл. 2, чувствительность антигена, содержащего фаг в РБП и РА, практически не отличалась от чувствительности биофабричных антигенов, а в РДСК превосходила последние.
В последующем провели исследование 1446 сывороток крупного рогатого скота из неблагополучных по бруцеллезу хозяйств и установили (табл. 3.), что с опытным антигеном в РА+РДСК+РБП вступило в реакцию 127 сывороток. С биофабричным антигеном получили 86 положительных результатов.
Совпадающие результаты в различных реакциях между антигеном, содержащим фаг, и биофабричным наблюдали во всех случаях, где отмечены позитивные показания с последним. Наибольшее число реагирующих животных выявлено комбинированным антигеном: в РБП - 96 и в РДСК
- 63, тогда как с биофабричным антигеном, в соответствующих реакциях, обнаружено соответственно 69 и 49.
Для подтверждения чувствительности и специфичности антигена, содержащего специфический фаг, провели убой 4 коров, реагирующих только на опытный диагно-стикум, с последующим бактериологическим исследованием. В результате от двух животных изолировали эпизоотические культуры бруцелл. Выделенные бруцеллы оказались лизогенными и из них выделили специфические фаги, аналогичные по ли-тическому спектру фагу ТБ.
При исследовании 550 сывороток крови овец из отары, где произошли массовые аборты овцематок (из абортированных плодов выделили 3 культуры B. meli-tensis) антигеном, содержащим специфический фаг, выявлено в РБП - 222 положительно реагирующих, в РА - 52 и в РДСК
- 154. С биофабричным антигеном, в соответствующих реакциях, положительные реакции зарегистрированы с сыворотками от 162, 35 и 108 животных. Совпадающие
Таблица 1. Результаты РА, РДСК и РБП с биофабричным бруцеллезным и содержащим специфический фаг
антигенами
Антигены Наименование реакции Иммунные сыворотки, полученные на штаммы бруцелл Бруцеллезная биофабричная Овисная биофабричная
В. abortus В. melitensis
19S 82 SR 16/4 R 54 L 16MS H-12R
Бруцеллезный РА 1600 3200 25 - 800 25 1600 -
биофабричный РДСК 320 640 10 20 320 5 320 -
РБП + + ± - + ± + -
Комбинированный РА 1600 3200 50 25 800 25 1600 50
РДСК 320 640 10 40 320 10 640 10
РБП + + + ± + + + +
Примечания:
1. Здесь и далее указаны предельные титры сывороток (в обратных величинах), где отмечены положительные
результаты на ++ и более;
2. В РБП: + положительный результат; ± сомнительный, - отрицательный.
-о
0
01 s
О
"О
■<
О
О >
о
Таблица 3. Результаты исследования сывороток крови на бруцеллез
Таблица 2. Результаты сравнительного изучения чувствительности бруцеллезных антигенов в различных серологических реакциях
Количество проб сывороток Реагировало с антигеном
Биофабричным Комбинированным
РБП РА РДСК РБП РА РДСК
Экспериментально зараженные
1 2 3 4 5 6 7
4 + 100 5 + 100 5
2 + 200 5 + 200 5
1 + 100 - + 100 5
1 + 100 10 + 100 5
1 + 200 10 + 400 10
1 + 200 5 + 200 5
1 + 100 - + 100 -
1 + 400 10 + 400 10
Больные бруцеллезом
1 - - 10 - - 10
- - 10 - - 10
1 + 400 - + 400 -
1 + 100 - + 200 5
+ 100 - + 100 -
1 + 400 - + 400 -
1 + 100 - + 100 -
- - 10 - - 10
1 - - 5 - - 10
1 + 200 10 + 200 20
1 + - 5 + - 10
Количество проб сывороток Реагировало с антигенами
Биофабричный антиген Антиген, содержащий фаг
РА РДСК РБП РА РДСК РБП
17 - + - - + -
14 - - - - + -
28 + + + + + +
16 + - + + - +
11 - - - + - +
4 - + + + + +
21 - - + - - +
16 - - - - - +
1339 - - - - -
П р и м е ч а н и е + положительные результаты, - отрицательные.
результаты между антигеном, содержащими специфический фаг, и биофабричным установлены во всех случаях, где наблюдались положительные реакции с последним. При убое 3 овцематок, реагирующих только с антигеном, содержащим специфический фаг, с последующим бактериологиче-
ским исследованием патологического материала от них, изолировали две эпизоотические лизогенные культуры В. melitensis, из которых также выделили бруцеллезные фаги, аналогичные по свойствам фагу ТБ.
Комплексный антиген для диагностики бруцеллеза также апробировали в клини-
ко-морфологической лаборатории областной клинической больницы г. Семипалатинска и в иммунологической лаборатории кафедры инфекционных болезней Семипалатинского государственного медицинского института. С помощью комплексного антигена оценивали иммунные показатели, необходимые для диагностики бруцеллеза у больных, находившихся на лечении в клинике института и у лиц, работающих на предприятиях по переработке животноводческого сырья и имеющих постоянный профессиональный контакт с больными бруцеллезом животными.
Всего было обследовано 76 больных. Применение указанного антигена позволило значительно улучшить диагностику бруцеллеза у людей. Введение в состав диагностикума антигенов специфического бактериофага способствовало повышению качества диагностики у людей со стертой клиникой болезни на 11,8% - при остром бруцеллезе; на 10,6% - при подо-стром; на 14,5% - при хроническом суб-компенсированном; на 23,3% - при хроническом декомпенсированном в сравнении с биофабричным бруцеллезным антигеном. Установлено также, что по мере увеличения длительности острого бруцеллеза фаговая антигенемия возрастает. В ходе исследований определили, что при использовании предложенного антигена диагностика бруцеллеза улучшается на 11,6% при постановке реакции прямой гемагглю-тинации; на 14,7% при постановке реакции агглютинации Райта и на 19,3% при постановке реакции агглютинации Хеддельсона. Следовательно, весьма положительной является такая особенность предложенного комплексного антигена, как максимальное повышение надежности наиболее простых в техническом отношении тестов [18].
Выводы и заключение
Комбинированный антиген вступает в реакцию со всеми сыворотками крови, дающими положительные результаты с биофабричным бруцеллезным антигеном. Способен дополнительно, в сравнении с биофабричным, обнаруживать адекватные антитела (антибруцеллезные и антифаговые) в сыворотке крови.
Диагностикум, содержащий специфический фаг, имеет достаточную информативность, что подтверждается положительными результатами бактериологических исследований патологического материала от животных, реагирующих только на данный антиген.
Сыворотки крови животных, негативно реагирующие с биофабричным бруцеллезным антигеном в РА и РБП и позитивно в РСК/РДСК, дают положительные показания с антигеном, содержащим фаг, как в РА и РБП, так и РСК/РДСК. Причем результаты РА и РБП с опытным антигеном совпадают с показаниями РСК/РДСК, в которых применяли биофабричный антиген.
Так как бактериофаг способен размножаться лишь в живых микробных клетках, сыворотки крови животных, реагирующих положительно с антигеном, содержащим фаг, и отрицательно с антигеном, в состав которого он не входит, свидетельствуют о том, что животное, от которого получена данная сыворотка, является бруцеллоноси-телем.
Использование антигена, содержащего специфический фаг, позволит усовершенствовать диагностику инфекционных заболеваний, в частности, будет способствовать более полному выявлению животных, больных латентной формой бруцеллеза или являющихся носителями нетипичных вариантов возбудителя, у которых могут отсутствовать или содержаться в незначительном количестве антибруцеллезные антитела. В то же время антифаговые антитела обязательно присутствуют у латентных больных или инфицированных нетипичными формами возбудителя, которые и будут взаимодействовать с комплексным антигеном.
Нами установлено, что свежевыде-ленные культуры бруцелл не отличаются от старых лабораторных или вакцинных штаммов ни по культуральным, ни по биохимическим свойствам, но отличаются одной важной особенностью — старые лабораторные или вакцинные штаммы не лизо-генны и не способны продуцировать фаг. Следовательно, для дифференциации инфицированных бруцеллами животных от иммунизированных противобруцеллезны-ми вакцинами необходимо проводить серологическую диагностику, направленную на выявление антифаговых антител или на-тивного фага.
Применение диагностикума, содержащего специфический фаг, позволит уменьшить количество серологических тестов (постановка РА или РБП с антигеном, приготовленным по предложенному способу, может заменить комплексное исследование в РБП+РА+РСК/РДСК с биофабричным).
Комплексный антиген способен существенно повысить надежность серологиче-
ских реакций, применяемых для диагностики бруцеллеза и, кроме того, позволяет получить дополнительную важную для иммунолога информацию.
Способ серологической диагностики бруцеллеза с использование комплексного антигена прост и может применяться в клинической лаборатории.
Библиографический список:
1. Макаров В. В. Трансмиссивные детерминанты патогенности / В. В. Макаров, А. А. Гусев и др. // Ветеринария. - 2000. - № 3. - С. 16-21.
2. Стент Г. Молекулярная генетика / Г. Стент, Р Кэ-
линдар; пер. с англ. - М.: Мир, 1981. - 646 с.
3. Бакулина Э. В. Теория паразитоценозов и генети-
ческий обмен у бактерий / Э. В. Бакулина, И. И. Олейник // - М.: Медицина, 1970. - 216 с.
4. Косилов И. А. Изменчивость бруцелл и ее значе-
ние в проблеме бруцеллеза сельскохозяйственных животных: автореф. дис. ... д-ра вет. наук / И. А. Косилов. - Омск, 1975. - 40 с.
5. Беляков В. Д.. Саморегуляция паразитарных систем / В. Д. Беляков, Д. Б. Голубев, Г. Д. Ка-линский и др. // - М.: Медицина, 1987. - 240 с.
6. Браун В. Генетика бактерий / В. Браун; пер. с англ.
- М.: Наука, 1968. - 446 с.
7. Nelson E. The recovery of L-formes of Brucella and
their relation to Brucella phage / E. Nelson, M. Pickett // J. Int. Dis. - 1951. - V 89. - P. 1-4.
8. Пехов А. П. Об изменчивости микробов под влия-
нием фага / А. П. Пехов // Изменчивость микробов и бактериофагия. - М.: Медгиз, 1960. - С. 360-363.
9. Дрожевкина М. С. Изменчивость бруцеллезных
культур под влиянием бактериофага / М. С. Дрожевкина // Труды Ростов-на-Дону противочумного института. - 1956. - Т. 10. - С. 269-316.
10. Тимаков В. Д. Биология L-форм бактерий / В. Д. Тимаков, Г. Я. Каган // - М.: Медгиз, 1961. - 234 с.
11. Островская Н. Н. Бруцеллезные бактериофаги
и их значения в изменчивости бруцелл: автореф. дис... д-ра мед. наук / Н. Н. Островская. - М., 1969. - 32 с.
12. Ощепков В. Г. Диагностика качества Ь-антигенов бруцелл, применяемых в РА, РСК, РДСК и ИФА / В. Г. Ощепков, Л. Н. Гордиенко, О. И. Верхов-цева // Сборник научных трудов ОГАУ - Омск.
- 1994. - С. 54-61.
13. Воробьев А. Л. Лизогения и диссоциация бруцелл / А. Л. Воробьев // Ветеринарная патология. - 2007. - № 2. - С. 28-37.
14. Воробьев А. Л. Фаги бруцелл и их иммунобиологические свойства: автореф. дис. ... д-ра биол. наук / А. Л. Воробьев. - Алматы, 2006. - 45 с.
15. Ломов Ю. М. Некоторые биологические свойства бруцеллезных фагов / Ю. М. Ломов // ЖМЭИ. - 1963. - № 1. - С. 117-121.
16. Авторское свидетельство 1713592. СССР. Способ получения антигена для серологической диагностики бруцеллеза / А. Л. Воробьев, В. И. Бело-баб и др.; опубл. 22.10.91
17. Дрожевкина М. С. Специфический бактериофаг в организме бруцеллезных больных / М. С. Дро-жевкина, М. Х. Мишнаевский, В. С. Уралева // Труды Ростов-на-Дону противочумного института. - 1957. - Т. 12. - С. 412-417.
18. Галич Б. В. Динамика изменения гуморального антифагового и противобруцеллезного иммунитета у больных бруцеллезом: автореф. дис. канд. мед. наук / Б. В. Галич. - Алма-Ата, 1990.
- 23 с.
References:
1. Makarov V V Transmissivnyie determinantyi patogennosti [Transmissible determinants of patogenicity] / V V Makarov, A. A. Gusev i dr. // Veterinariya. - 2000. - # 3. - S. 16-21.
2. Stent G. Molekulyarnaya genetika [ Molecular genetics] / G. Stent, R. Kelindar; per. s angl. - M.: Mir, 1981. - 646 s.
3. Bakulina E. VTeoriya parazitotsenozov i geneticheskiy
obmen u bakteriy [The theory of parazitotsenoz and genetic exchange at bacteria] / E. V Bakulina, I. I. Oleynik // - M.: Meditsina, 1970. - 216 s.
4. Kosilov I. A. Izmenchivost brutsell i ee znachenie
v probleme brutselleza selskohozyaystvennyih zhivotnyih [Variability of brucellas and its value in a problem of a brucellosis of farm animals]: avtoref. dis. ... d-ra vet. nauk / I. A. Kosilov. - Omsk, 1975. -40 s.
5. Belyakov V D.. Samoregulyatsiya parazitarnyih sistem
[Self-regulation of parasitic systems] / V D. Belyakov, D. B. Golubev, G. D. Kalinskiy i dr. // - M.: Meditsina, 1987. - 240 s.
6. Braun V. Genetika bakteriy [Genetics of bacteria] / V.
Braun; per. s angl. - M.: Nauka, 1968. - 446 s.
7. Vide supra.
8. Pehov A. P Ob izmenchivosti mikrobov pod vliyaniem
faga [About variability of microbes under the influence of a phage] / A. P. Pehov // Izmenchivost mikrobov i bakteriofagiya. - M.: Medgiz, 1960. - S. 360-363.
9. Drozhevkina M. S. Izmenchivost brutselleznyih kultur pod vliyaniem bakteriofaga [Variability of brucellous cultures under the influence of a bacteriophage] / M. S. Drozhevkina // Trudyi Rostov-
na-Donu protivochumnogo instituta. - 1956. - T. 10.
- S. 269-316.
10. Timakov V D. Biologiya L-form bakteriy [Biology of L-forms of bacteria] / V D. Timakov, G. Ya. Kagan // -M.: Medgiz, 1961. - 234 s.
11. Ostrovskaya N. N. Brutselleznyie bakteriofagi i ih znacheniya v izmenchivosti brutsell [Brucellous bacteriophages and their values in variability of brucellas]: avtoref. dis... d-ra med. nauk / N. N. Ostrovskaya. - M., 1969. - 32 s.
12. Oschepkov V. G. Diagnostika kachestva L-antigenov brutsell, primenyaemyih v RA, RSK, RDSK i IFA [Diagnostics of quality of L-antigens of the brucellas applied in RA, RSK, RDSK and IFA] / V G. Oschepkov, L. N. Gordienko, O. I. Verhovtseva // Sbornik nauchnyih trudov OGAU. - Omsk. - 1994.
- S. 54-61.
13. Vorobev A. L. Lizogeniya i dissotsiatsiya brutsell [Lysogeny and dissociation of brucellas] / A. L. Vorobev // Veterinarnaya patologiya. - 2007. - # 2. -S. 28-37.
14. Vorobev A. L. Fagi brutsell i ih immunobiologicheskie svoystva [Phage of brucellas and their immunobiological properties]: avtoref. dis. ... d-ra biol. nauk / A. L. Vorobev. - Almatyi, 2006. - 45 s.
15. Lomov Yu. M. Nekotoryie biologicheskie svoystva brutselleznyih fagov [Some biological properties of brucellous phages] / Yu. M. Lomov // ZhMEI. - 1963.
- # 1. - S. 117-121.
16. Avtorskoe svidetelstvo 1713592. SSSR. Sposob polucheniya antigena dlya serologicheskoy diagnostiki brutselleza [A way of receiving an antigen for serological diagnosis of a brucellosis] / A.
L. Vorobev, V I. Belobab i dr.; opubl. 22.10.91 17. Drozhevkina M. S. Spetsificheskiy bakteriofag v organizme brutselleznyih bolnyih [A specific bacteriophage in an organism of brucellous patients] / M. S. Drozhevkina, M. H. Mishnaevskiy, V S. Uraleva // Trudyi Rostov-na-Donu protivochumnogo instituta. - 1957. - T. 12. - S. 412-417.
18. Galich B. V Dinamika izmeneniya gumoralnogo antifagovogo i protivobrutselleznogo immuniteta u bolnyih brutsellezom [Dinamika of change of humoral antifagovy and antibrucella immunity at patients with a brucellosis]: avtoref. dis... kand. med. nauk / B. V Galich. - Alma-Ata, 1990. - 23 s.
Vorobiev A. L., Gordienko L. N.
DIAGNOSTIC EFFICIENCY OF BRUCELLAS ANTIGEN CONTAINING SPECIFIC BACTERIOPHAGE
Key Words: brucellosis, bacteriophages, lysogeny, variability, dissociation, L-transformation, diagnostics.
Abstract: According to our data, lysogeny and dissociation of brucella are interrelated. Initially, the induction of phages under the influence on the microbial cell (lysogenization) of any external or internal factors of a biotic or abiotic nature occurs. Only after this is observed the process of dissociation or transformation or the transition of Brucella from S- to R- or L-form. It has also been found that freshly isolated brucella cultures do not differ from old laboratory or vaccine strains by either cultural or biochemical properties, but differ in one important feature: old laboratory or vaccine strains are not lysogenic and are not capable of producing a bacteriophage. Therefore, the presence of antifog antibodies or native phage in animals, including those immunized with anti-brucellosis vaccines, indicates that they are infected with epizootic brucella cultures. Inclusion of a specific phage in the composition of diagnosticums will allow us to identify atypical brucellae - dissociants and L-forms. This is due to the fact that the S-R transition is manifested by the lysogenization of bacteria, and in the process of L-transformation, the brucella lysogenesis also occurs. The phage produced by lysogenic bacteria causes the production of specific anti-phage antibodies. And since different brucellosis phages have identical antigenic determinants, the detection of antibodies to brucellosis phages will allow us to recognize the infection caused by atypical variants of brucella. Thus, the use of a brucellosis antigen containing a specific phage will allow to improve the diagnosis of this infection, in particular, it will promote a more complete identification of animals, patients with a latent form of brucellosis or infected with atypical variants of the pathogen.
Сведения об авторах:
Воробьев Александр Львович, доктор биологических наук, профессор Восточно-Казахстанского государственного технического университета; г. Усть-Каменогорск, Республика Казахстан; e-mail: vorobyovalex@mail.ru
Гордиенко Любовь Николаевна, канд. вет наук, врио директора федерального государственного бюджетного научного учреждения ВНИИ бруцеллеза и туберкулеза животных; г. Омск, Россия; e-mail: vniibtg@rambler.ru
Author affiliation:
Vorob'yov Alexander L'vovich, D. Sc in Biology, Professor of the East Kazakhstan state technical University; Ust-Kamenogorsk city, Republic of Kazakhstan; e-mail: vorobyovalex@ mail.ru
Gordiyenko Lyubov Nikolaevna, Ph. D. in Veterinary Medicine, temporarily acting as Director of the Federal State Budgetery Scientific Institution (FSBSI) «All-Russian Research Institute of a Brucellosis and Tuberculosis of animals»; Omsk city, Russia; e-mail: vniibtg@ rambler.ru
