CC BY
83
УДК 619:616.981.42:616-07:591.111
ЭФФЕКТИВНАЯ СХЕМА ПОЛУЧЕНИЯ S-БРУЦЕЛЛЕЗНОЙ ДИАГНОСТИЧЕСКОЙ СЫВОРОТКИ
П.К. АРАКЕЛЯН1, доктор ветеринарных наук, зав. лабораторией
Г.В. РАЗНИЦЫНА1, научный сотрудник Н.Ф. ГАУСТ1, соискатель
С.К. ДИМОВ2, доктор ветеринарных наук, зав. лабораторией
К.С. ДИМОВ2, кандидат ветеринарных наук, научный сотрудник
1ВНИИБТЖ Россельхозакадемии, Россия, г. Омск, ул. Лермонтова, 93,
2ИЭВСиДВ Россельхозакадемии, Россия, Новосибирская область, п. Краснообск, а/я 8
Резюме. Исследования проводили с целью поиска эффективной схемы производства S-бруцеллезной диагностической сыворотки. Изучены 4 схемы гипериммунизации здоровых быков, предварительно исследованных на бруцеллез с отрицательными результатами (по 3 гол. в каждой группе), которых гипериммунизировали живой культурой бруцелл шт. 19 п/к в дозах 75, 120 и 150 млрд м.к. с интервалом 10 дн.; живой культурой бруцелл шт. 19 п/квдозах50, 100 и 100 млрд м.к. с интервалом 10 дн; убитой культурой бруцелл шт. 19 п/к 50 млрд м.к. однократно в сочетании с адъювантом (5 мл); убитой культурой бруцелл шт. 19 п/к 100 млрд м.к однократно в сочетании с адъювантом (5 мл). Наиболее эффективной оказалась схема получения S-бруцеллезной диагностической сыворотки, основанная на предварительной однократной подкожной гипериммунизации животных-продуцентов убитой культурой вакцинного штамма B. abortus 19 в дозе 100 млрд. м.к. в сочетании с адъювантом MONTANIDE ISA 61 VG (5 мл) с последующим двукратным взятием крови в течение 30 дн. после гипериммунизации. Она практически не уступает известной схеме, предусматривающей трехкратное введение живой культуры вакцинного штамма бруцелл, в достижении высоких диагностических титров препарата (средние титры РА и РСК после 6мес. хранения 1166,7и 1:80соответственно), но обладает преимуществами, связанными с эпидемической безопасностью, а также с возможностью производства (благодаря адъюванту, обеспечивающему высокий титры антител даже при однократной гипериммунизации) за аналогичный период времени в два раза больших объемов сыворотки.
Ключевые слова: бруцеллез, серологическая и бактериологическая диагностика, S-бруцеллезная диагностическая сыворотка, способы получения, животные-продуценты, схемы гипериммунизации, антигены, виды бруцелл, антигенное родство, вирулентные и вакцинные штаммы, адъюванты, титры диагностических сывороток.
При массовой диагностике бруцеллеза у разных видов животных используют различные серологические реакции с антигенами, полученными из типичных бруцелл, находящихся в Б-форме. Позитивная Б-бруцеллезная сыворотка необходима для массовой серологической диагностики, в качестве контрольной, при исследовании сывороток крови с целью выявления антител к типичным бруцеллам, находящимся в Б- форме. Кроме того, ее используют в бактериологической диагностике бруцеллеза при идентификации и дифференциации выделенных культур бруцелл в пластинчатой реакции агглютинации. Принцип получения Б-бруцеллезной сыворотки основан на гипериммунизации животных-доноров (кролики, крупный рогатый скот и др.) по определенной схеме. Максимально высокий уровень антител достигается путем многократной гипериммунизации животных-продуцентов живыми или убитыми культурами бруцелл [1].
В частности, известен способ изготовления диагностической бруцеллезной агглютинирующей сыворотки путем
многократной гипериммунизации кроликов-продуцентов живыми культурами вирулентных штаммов бруцелл видов abortus и melitensis (смеси в равных количествах культур с равным объемом полного адъюванта Фрейнда). Антиген вводят животным трехкратно с недельным интервалом подкожно (0,5, 0,75 и 1,0 мл) в четыре точки спины вдоль позвоночника, через две недели после завершающей инъекции смесь культур в 0,85%-ном растворе натрия хлорида вводят четвертый раз подкожно в область внутренней верхней трети поверхности бедра 1,0 мл. Через 14 дн. после окончания иммунизации кроликов тотально обескровливают, получают сыворотку, инактивируют ее нагреванием и консервируют [2]. Известен также способ производства поливалентной диагностической бруцеллезной сыворотки, заключающийся в гипериммунизации быков-продуцентов взвесью культур вирулентных штаммов B.abortus, B.melitensis и B.suis, инактивированной нагреванием в сочетании с карболовой кислотой. При его реализации вначале проводят грунд-иммунизацию животных путем однократного введения 10 мл бруцеллезного антигена подкожно, а через 1 мес. за 2.. .4 цикла с интервалами 20.30 сут. осуществляют реммунизацию. В течение одного цикла проводят 5 ежедневных инъекций антигена по 10, 15, 20, 30, 40 мл [3].
Использование обоих способов связано с эпидемической опасностью, возникающей при производстве вирулентных культур бруцелл различных видов, а также с высокой себестоимостью конечного продукта из-за длительности и трудоемкости технологического процесса.
При этом благодаря антигенному родству всех видов бруцелл существует принципиальная возможность изготовления эффективной S-бруцеллезной сыворотки для диагностики болезни, вызываемой любыми видами бруцелл в такой форме [1]. Например, диагностическую S-бруцеллезную сыворотку можно получить на основе гипериммунизации животных-продуцентов живой культурой вакцинного штамма В. abortus 19 подкожно в области средней трети шеи по следующей схеме: 1-й дн. - 75 млрд м.к., 10-й дн. - 120 млрд м.к., 20-21-й дн. - 150 млрд м.к. На 30-31-й дн. после начала гипериммунизации титр сыворотки в РА находится на уровне не ниже 1:1000, а в РСК - не ниже 1:20 [4]. Такой способ значительно проще и менее опасен в эпидемическом отношении, чем ранее упомянутые, однако и в этом случае остается необходимость для однократного получения диагностически активной сыворотки трехкратного в течение 30 дн. (с интервалом в 10 дн.) введения антигена, представляющего собой хоть и вакцинную, но живую культуру бруцелл.
С учетом изложенного, очевидно, что перспективы дальнейшего совершенствования способа производства диагностически активной S-бруцеллезной сыворотки по
Таблица 1. Средние титры антител у быков-продуцентов в разные сроки после их гипериммунизации по разным схемам
Группа Срок после первого введения антигена
через 10 дн. через 20 дн. через 30 дн.
РА |РСК РА | РСК РА | РСК
I II III IV 333,3 МЕ 1:26,6 1600 МЕ 1:80 1600 МЕ 1:160 333,3 МЕ 1:26,6 1600 МЕ 1:80 1000 МЕ 1:160 200 МЕ 1:26,61600 МЕ 1:33,3 1333 МЕ 1:66,6 266,6 МЕ 1:26,6 1600 МЕ 1:40 1600 МЕ 1:80
пути его упрощения и повышения гарантий противоэпидемической безопасности заключаются в использовании для гипериммунизации животных продуцентов убитой культуры вакцинного штамма B. abortus 19 в сочетании с адъювантом, позволяющим стимулировать получение высоких титров антител при однократной гипериммунизации.
Таким оказался французский препарат MONTANIDE ISA 61 VG [5] фирмы Seppic - адъювант на основе минерального масла. Он сдержит особое обогащенное светлое минеральное масло и высокоочищенное ПАВ, полученное из маннитола и очищенной олеиновой кислоты растительного происхождения.
Цель наших исследований - поиск наиболее эффективной схемы получения S-бруцеллезной диагностической сыворотки.
Условия, материалы и методы. Для проведения экспериментов здоровых животных, предварительно исследованных на бруцеллез с отрицательными результатами, гипериммунизировали (по 3 гол. в каждой группе) с использованием различных схем:
I группа - живой культурой бруцелл шт. 19 п/к в дозах 75, 120 и 150 млрд м.к. с интервалом 10 дн.;
II группа - живой культурой бруцелл шт. 19 п/к в дозах 50, 100 и 100 млрд м.к. с интервалом 10 дн.;
III группа - убитой культурой бруцелл шт. 19 п/к 50 млрд м.к. однократно в сочетании с адъювантом (5 мл);
IV группа - убитой культурой бруцелл шт.19 п/к 100 млрд м.к. однократно в сочетании с адъювантом (5 мл).
В сыворотках крови, полученных от быков-продуцентов, гипериммунизированных по разным схемам, определяли средние титры антител через 6 мес. хранения, в сравнении со средними титрами антител через 30 дн. после первого введения антигена.
Результаты и обсуждение. Оптимальной схемой гипериммунизации признана та, которую использовали в группе IV. В случае ее применения титры антител практически не уступали таковым в группе I, как на 20-ый, так и на 30-ый день после первого введения антигена
Таблица 2. Средние титры антител в сыворотках крови быков-продуцентов, гипериммунизированных по разным схемам, через 30 дн. после первого введения антигена и через 6 мес. после их хранения
Сроки взятия крови
Группа через 30 дн. после первого введения антигена через 6 мес. хранения сыворотки
РА 1 РСК РА I РСК
I II III IV ш ш ш ш 2 2 2 2 о о со о о о со о со о со со 1:160 1:160 1:66,6 1:80 666,6 МЕ 933,3 МЕ 1166,7 МЕ 1166,7 МЕ 1:80 1:80 1:60 1:80
(табл. 1). Однако последняя схема предусматривает трехкратное использование больших доз живой культуры бруцелл (пусть и вакцинной), а в группе IV - лишь однократное введение убитой вакцинной культуры бруцелл в сочетании с адъювантом.
Средние титры антител в сыворотках крови, полученных от быков-продуцентов IV группы, через 6 мес. хранения не изменились и остались на высоком уровне (РА - 1600 МЕ и РСК - 1:80). В остальных группах они снизились (табл. 2).
Выводы. Таким образом, однократное подкожное введение быкам-продуцентам убитой культуры вакцинного штамма B. abortus 19 в дозе 100 млрд м.к. в сочетании с адъювантом MONTANIDE ISA 61 VG (5 мл) обеспечивает получение в S-бруцеллезной диагностической сыворотки с титром в РА 1600 МЕ и в РСК 1:80 с максимальным соблюдением эпидемической безопасности и двукратным взятием крови для получения сыворотки через 20 и 30 дн. после гипериммунизации. Использование такой схемы позволяет сократить число гипериммунизаций с трех до одной и получать при этом высоко активную S-бруцеллезную диагностическую сыворотку (средние титры РА и РСК после 6 мес. хранения 1166,7 и 1:80 соответственно) в 2 раза большем количестве за равный период времени.
Литература.
1. Косилов И.А, Аракелян П.К., Димов С.К. и др. Бруцеллез сельскохозяйственных животных / под ред. И.А. Косилова. Новосибирск, 1999. 344 с.
2. Штамм бактерий Brucella melitensis биовара I, используемый для получения поливалентной гипериммунной сыворотки кбруцеллам: патентRU 2005781 С1, 15.01.1994/И.В. Лаукнер, О.Д. Захлевная.
3. Сыворотка диагностическая бруцеллезная агглютинирующая. ТУ-316-82 от 01.06.1982, утв. ГУ по производству бактерийных и вирусных препаратов МЗ СССР.
4. «Способ получения бруцеллёзного антигена из штамма Brucella abortus 19 изготовления единого бруцеллёзного антигена для РА, РСК и РДСК, бруцеллёзного антигена для роз-бенгал пробы (РБП) и бруцеллёзного антигена для кольцевой реакции (КР) с молоком, способ изготовления бруцеллёзной диагностической сыворотки и диагностические наборы: патент RU № 2361610 C1, 20.07.2009/ В.В. Соболев, Н.В. Мельник, О.Д.Скляров и др.
5. MONTANIDE ISA 61 VG. Технический бюллетень, 2010.
THE AIM OF RESEARCH WAS TO FIND EFFECTIVE SCHEME OF OBTAINING S-BRUCELLOSIS DIAGNOSTIC SERUM P.K. Arakelyan1, G.V. Raznicina1, N.F. Gaust1, S.K. Dimov2, K.S. Dimov2
1VNIIBTG RAAS, Russia, Omsk, st. Lermontova, 93
2IEVSSaFE RAAS, Russia, Novosibirsk region, Krasnoobsk, P.O. box 8
Summary. There were studied 4 schemes hyperimmunization healthy bulls, pre- tested for brucellosis with negative results, which hyperimmune (3 each head in each group): the alive culture of Brucella strain 19 n/a in doses of 75, 120 and 150 billion microbial cells with an interval of 10 days; alive culture of Brucella strain 19 n/a in doses of 50, 100 and 100 billion microbial cells with an interval of 10 days; killed Brucella culture strain19 n/a 50 billion microbial cells once combined with an adjuvant (5 ml); killed culture of Brucella strain 19 n/a 100 billion microbial cells once combined with an adjuvant (5 ml). The most effective was the scheme of the S-brucellosis diagnostic serum based on preliminary single subcutaneous hyperimmunization animals-producing killed culture vaccine strain of B. abortus 19 at a dose of 100 billion microbial cells in combination with the adjuvant MONTANIDE ISA 61 VG (5 ml), followed by two blood samples of 30 days after hyperimmunization. It is almost as good as the well-known scheme, which provides three-dose live vaccine strain of Brucella culture in achieving high diagnostic titers of the drug (average titers of RA and CFT after 6 months of storage 1166,7 and 1:80, respectively), but has the advantages associated with the epidemic safety as well as the possibility of obtaining (by adjuvant allowing to foster the production of high titers of antibodies even at single hyperimmunization) for the same period in twice the volume of serum.
Keywords: brucellosis, serological and bacteriological diagnosis, S-brucellosis diagnostic serum, methods of preparation, animals-producers, schemes hyperimmunization, antigens, Brucella species, antigenic relationship, virulent and vaccine strains, adjuvants, titers of diagnostic sera.
