CC BY
102
Н. Б. МЕЛЬНИКОВА, И. В. ГУЛЯЕВ, А. А. ВОЛКОВ, С. А. ГАВРИЛОВА
ДЕЙСТВИЕ ВОДНОГО РАСТВОРА КОМПЛЕКСОВ ДИМЕФОСФОНА С СОЕДИНЕНИЯМИ ЛИТИЯ НА КОГНИТИВНО-МНЕСТИЧЕСКИЕ ФУНКЦИИ КРЫС
Кафедра фармацевтической химии и фармакогнозии Нижегородской государственной медицинской академии,
Россия, 603005, г. Нижний Новгород, ул. Минина и Пожарского, 10/1.
E-mail: [email protected], [email protected]
Было изучено образование комплексов димефосфона с соединениями лития в водных растворах. Оценка ноотропного действия проводилась в экспериментах на белых крысах линии Wistar. Исследовано дозозависимое влияние препарата на выработку рефлексов пассивного и активного избегания для характеристики когнитивно-мнестических функций, поведенческой активности и эмоционального состояния. Ноотропное действие разработанного препарата сравнимо с положительным эффектом пирацетама.
Ключевые слова: димефосфон, комплексы димефосфона с лития цитратом, ноотропный эффект, эксперимент на крысах.
N. B. MELNIKOVA, I. V. GULYAEV, A. A. VOLKOV, S. A. GAVRILOVA
THE TREATMENT BY AQUEOUS SOLUTION OF DIMEPHOSPHONE WITH LITHIUM COMPOUNDS AND THEIR INFLUENCE ON COGNITIVE-MENTAL FACILITY OF RATS
Department of Pharmaceutical Chemistry and Pharmacognosii of the Nizhniy Novgorod State Medical Academy, Russia, 603005, Nizhniy Novgorod, sguare Minina and Pozharsky, 10/1. Е-mail: [email protected]
The formation of complexes of dimephosphone with lithium compounds in aqueous solution was studied. Examination of the nootropic action carries out in the experiments by Wistar lines white rats. The influence of medicinal on an acquisition of conditional reflexes (passive and active) depends on the dose by characterization of, behavior activity and emotional condition. It has been estimated the analogous nootropic effect as pyracetam.
Key words: dimephosphone, complexes of dimephosphone with lithium citrate, nootropic effect, experiment by rats.
Представляет интерес отечественный препарат димефосфон, позволяющий осуществить коррекцию интеллек-туально-мнестических функций головного мозга. В экспериментах на мышах установлено, что димефосфон улучшает обучение животных условному рефлексу пассивного избегания. Сравнение с пирацетамом выявило преимущество димефосфона: меньшая доза, улучшение памяти (фиксация, консолидация и воспроизведение) [2, 6].
Для лечения неврологических заболеваний могут применяться также ноотропные препараты лития, нормализующие клеточную мембрану, выполняющие роль посредников нервной и гормональной регуляции, участвующие в иммунных, гомеостатических и адаптационных реакциях [5].
Представляет интерес фармацевтическая композиция на основе димефосфона и соединений лития [4], обуславливающая синергизм действия компонентов, которая разработана на кафедре фармацевтической химии и фармакогнозии Нижегородской государственной медицинской академии и ООО «ИНТЕЛФАРМ».
Настоящая работа посвящена доклиническим исследованиям действия фармацевтической композиции на основе комплексов димефосфона с соединениями лития на когнитивно-мнестические функции крыс.
Методика исследования
Субстанция «димефосфон» ^терМоврИопит), производимая ООО «ТЕХНОФОС». Содержание димефосфона - не менее 99% (ФС42-2993-99).
СН3 0СН3
н3с—С— СН2СР=о
II I \
о СН3 ОСНз
Димефосфон (диметиловый эфир 1,1-диметил-3-оксобутилфосфоновой кислоты)
Физико-химические исследования. Электронные спектры записаны в области 200-700 нм в кварцевых кюветах на UV-Vis спектрофотометре «Specord 100-S bio». ИК-спектры получены на ИК-спектрометре «Shimadzu LC-10Avp» в области 4000-500 см’1 в виде смесей с бромистым калием при концентрации изучаемых веществ в смеси 0,1-0,3%. Высокоэффективную жидкостную хроматографию проводили на хроматографе марки «Shimadzu LC-10», колонка С18, подвижная фаза - ацетонитрил - вода, температура колонки 40°С в градиентном режиме.
Медико-биологические исследования проведены в соответствии с «Руководством по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ, 2005», Приказом Минздрава России от 19.06.03 № 267 «Об утверждении правил лабораторной практики в РФ» [8].
Кубанский научный медицинский вестник № 3 (108) 2009 УДК 615.2.001.57:541.1(021)
Кубанский научный медицинский вестник № 3 (108) 2009
а
б
Рис. 1, а, б. ВЭЖ хроматограммы субстанции димефосфона (а) и стандарт лекарственного вещества димефосфона (Ткипения 135-137° С при 80 мм рт. ст., п=1,448) (б). Детектирование при Л=285 нм. Элюент - ацетонитрил
В экспериментах были использованы 90 половозрелых (6 месяцев) белых крыс линии Wistar, полученных из питомника «Столбовая» ГУ НЦ БМТ РАМН. Основные правила содержания и ухода за животными соответствовали нормативам, данным в руководстве Guide for care and use of laboratory animals. ILAR publication, 1996, NationalAcademy Press.
Сравнительное изучение влияния препаратов на когнитивно-мнестические функции и поведение крыс было проведено при одноразовом и курсовом внутри-желудочном введении в весеннее время года (2005 г.).
Оценку когнитивно-мнестических особенностей проводили в установке для выработки условного рефлекса пассивного избегания (УРПИ) «челночная камера». Установка для выработки УРПИ состоит из вытянутой пластмассовой камеры длиной 50 см, шириной 10 см и высотой 10 см, с электрифицированным решетчатым полом. Стены, потолок одной половины камеры выкрашены в черный цвет, а в другой половине они прозрачны. Потолок состоит из двух крыш на шарнире в середине установки, поэтому имеется доступ в обе половины камеры.
Обычная экспериментальная ситуация состоит из трех этапов:
1. Ознакомление. Крысу помещали в освещенную камеру спиной к темному отсеку (стартовое положение), после чего крышку закрывали. Вскоре животное поворачивалось, находило вход в темный отсек и перемещалось в него. Через 10 сек. крысу убирали из темного отсека в жилую клетку. Процедуру повторяли 3 раза с 30-минутными интервалами. Латентный период перехода в темноту измеряли с момента помещения животного в камеру с помощью секундомера.
2. Обучение. При последней попытке ознакомления, как только крыса вступала в темный отсек, подавали удар тока (50 Гц, 1,5 мА, в течение 1 сек.). Затем крысу сразу же переводили в жилую клетку. Препарат вводили внутрижелудочно, с помощью зонда, за 30 минут до начала обучения.
3. Воспроизведение. Через 24 ч животное вновь помещали в освещенную половину и устанавливали латентный период входа в темноту. Тест заканчивался,
когда животное вступает в темный отсек или если животное не делает этого в течение 3 мин.
Животные были разделены на 5 групп, каждая из которых включала по 10 животных: препарат объемом 0,7 мл; препарат объемом 1,4 мл; препарат объемом 2,8 мл; пирацетам объемом 1,5 мл; контроль - дистиллированная вода объемом 1,5 мл.
Тестирование общей двигательной активности, ориентировочно-исследовательской активности, эмоционального состояния животных проводили в установке «открытое поле» [1, 8]. Установка представляет собой круглую камеру диаметром 120 см с металлическими стенками высотой 28 см. Пол изготовлен из белого пластика, на нем черной краской нанесена решетка, делящая его на 25 равных квадратов со стороной 20 см. Лампы накаливания (6 ламп по 60 Вт) располагались по кругу диаметром 60 см на высоте 80 см от поверхности поля. Освещенность площадки во время опыта составляла 200 Лк. Животное помещали в центральный квадрат, и за ним проводилось наблюдение. Подсчитывали количество отдельных поведенческих актов в течение 5 минут тестирования. Препарат вводили внутрижелудочно, с помощью зонда, за 30 минут до начала тестирования. Регистрировались следующие поведенческие показатели крыс: вертикальная двигательная активность (ВДА), отражающая ориентировочно-исследовательское поведение животных; горизонтальная двигательная активность (ГДА), отражающая общую двигательную активность крыс.
Для оценки эмоционального состояния крыс использовали следующие показатели: продолжительность реакции замирания, сек.; длительность реакции груминга, сек.; длительность реакции принюхивания, сек.
Установка «челночная камера» для выработки условного рефлекса активного избегания (УРАИ) аналогична описанной выше установке исследования УРПИ. Электрокожное аверзивное раздражение подавалось на лапы животного после предварительного изолированного действия условного сигнала, в качестве которого использовали звук длительностью 4 сек. Параметры раздражающего тока: 50 Гц, 0,4-0,8 мА. Интервалы между предъявлением условного сигнала и электро-
Таблица 1
Влияние разработанного препарата на выработку УРПИ у крыс
Группы Этапы эксперимента Увеличение времени перехода в темный отсек при обучении и воспроизведении (*о-0 /Тв- (%)
Обучение Воспроизведение
Латентный период перехода в темный отсек, т„ с, M±0 Латентный период перехода в темный отсек, т с, M±0 в 7
Препарат 0,7 мл 58,б7±18,3б 12б,5±34,02 54
Препарат 1,4 мл 35,75±12,79 130,8б±24,94*# 73
Препарат 2,8 мл 29,00±б,18 140,88±25,83* 79
Пирацетам 44,75±9,41 180,0±15,22* 76
Контроль 15,75±8,35 11б,б3±27,б7*# 86
Примечание: * - достоверное отличие латентного периода перехода при воспроизведении от латентного периода перехода в темный отсек при обучении, р<0,05;
# - достоверное отличие латентного периода перехода в темный отсек при воспроизведении от латентного периода перехода в темный отсек животных с введением пирацетама, р<0,05.
Таблица 2
Изменение ориентировочно-исследовательской, общей двигательной активности и эмоционального состояния животных
Вертикальная Горизонтальная Длительность Длительность Длительность
Группы двигательная двигательная реакции груминга, сек. реакции
активность активность замирания, сек. принюхивания, сек.
M±m M±m M±m M±m M±m
Препарат 0,7 мл 4,б3±1,85 54,38±14,91 141,8б±25,82 10,б3±5,19 40,б3±2б,24
Препарат 1,4 мл 3,38±1,49* б7,0±14,б4 103,88±21,0б 14,75±4,92 37,38±12,31
Препарат 2,8 мл 1,50±0,80* 38,13±1б,88* 189,50±30,12*# б,б3±3,41* 2б,50±11,39
Пирацетам 3,13±2,02* 34,37±17,б5* 1б1,25±45,50* 13,б3±б,94* 27,88±8,б8
Контроль 9,19±1,б9 77,5б±9,14 52,0±18,0б 44,81±б,89 4б,94±9,80
Примечание: * - достоверное отличие от контроля, p<0,05;
# - достоверное отличие от объема 1,4 мл, p<0,05.
кожным раздражением составляли 2 сек.; максимальная продолжительность каждого электрокожного раздражения - 4 сек.; интервал между предъявлениями условных сигналов - 20 сек. Условный рефлекс активного избегания - переход в смежный отсек камеры в течение 6 сек. после включения условного сигнала.
Условный рефлекс активного избегания вырабатывали в течение 5 дней по 30 сочетаний раздражителей ежедневно. Крысы, которые в конце четвертого дня тестирующего обучения имели более 15 неадекватных или невыполненных реакций, классифицировались как плохо обучаемые (животные с пониженным уровнем обучаемости). Остальные животные были разделены на 4 группы, каждая из которых включала по 10 животных.
Обучение животных возобновляли через 15 дней после курсового введения препаратов в течение 7 дней. Обучение осуществляли в течение 4 дней. Определение сохранности навыка проводили через 5 дней после последнего сеанса обучения.
При оценке динамики выработки условного рефлекса активного избегания регистрировали основные
поведенческие показатели: число реакций избегания (РИ); число коротколатентных реакций избавления от электрокожного раздражения (менее 1 сек.) (КЛИ); число «невыполненных» реакций (неизбеганий); число межсигнальных реакций (МСР); латентное время избегания (ЛВИ).
Методы статистической обработки данных. Полученные результаты были обработаны на IBM PC/AT с помощью пакетов прикладных программ Statistica 6.0. Вероятность различий показателей средних в группах определяли с использованием t-критерия Стьюдента. Различия считали достоверными при уровне значимости р<0,05.
Результаты исследования
Кислая среда в водном препарате «димефосфон» (рН от 2,7 до 4,0) обусловлена взаимодействием ди-мефосфона (ДМФ) с водой с образованием продуктов гидролиза по фосфорильной группе фосфоновой кислоты - производного гидроксифосфоновой кислоты. Этот факт доказан ИК-спектральными исследованиями:
Кубанский научный медицинский вестник № 3 (108) 2009
Кубанский научный медицинский вестник № 3 (108) 2009
Таблица 3
Влияние исследуемого препарата на формирование УРАИ у крыс
Регистрируемые показатели Вещество Дни наблюдения
1 2 3 4
Количество реакций избегания Пирацетам 20,88±2,80 21,38±2,18# 23,50±2,3б# 25,38±2,09#
Контроль 8,38±2,б3 9,25±2,29* 12,88±2,бб* 15,38±2,б7*#
Препарат 1,4 9,71±3,53 11,43±3,51* 13,14±4,32* 11,71±5,09*
Препарат 2,8 13,0±3,20 17,0±3,33 18,33±3,37# 20,83±3,44#
Количество коротколатентных реакций избавления Пирацетам 3,13±1,25 2,8б±1,13 2,13±1,11# 0,88±0,74#
Контроль б,25±1,81 5,50±1,3б б,88±1,5б* 5,75±1,71*
Препарат 1,4 б,57±1,97 б,43±1,73** 4,29±0,92 3,14±1,18
Препарат 2,8 5,50±1,98 3,17±0,95 3,б7±1,49 5,33±2,4б
Количество неизбеганий Пирацетам б,0±1,81# 5,75±1,38# 4,38±1,73# 3,75±1,б1#
Контроль 15,38±2,13* 15,25±2,18* 10,25±1,б3* 8,88±1,48*#
Препарат 1,4 13,71±3,1б 12,14±3,17** 12,57±4,15 15,14±4,49*
Препарат 2,8 11,50±3,13 9,83±2,57 8,0±2,б1 3,83±1,40**,#
Количество межсигнальных реакций Пирацетам 5,0±2,15# 4,5±2,1б# 5,50±2,9б б,13±2,47#
Контроль 1,88±1,33 1,б3±0,73 2,25±0,9б 3,0±1,б3
Препарат 1,4 0,57±0,20 0,57±0,20* 0,29±0,18* 0,71±0,29*
Препарат 2,8 1,33±0,99 2,0±0,8б 2,33±1,09 3,б7±1,33**
Латентное время избегания, сек. Пирацетам 127,87±1б,0б# 125,25±14,98# 118,75±17,95# 113,0±1б,22#
Контроль 205,0±13,99* 202,88±13,35* 170,75±13,52* 1б5,25±9,82*#
Препарат 1,4 19б,0±21,05* 183,29±21,75* 183,29±28,32 194,8б±31,17*
Препарат 2,8 179,0±19,37* 171,83±14,90 142,17±20,б1# 125,50±19,81#
Примечание: * - достоверное отличие от контроля, р<0,05;
** - достоверное отличие от пирацетама, р<0,05;
# - достоверное отличие от препарата объема 1,4 мл, р<0,05.
полоса фосфорильной связи изменяет свою форму и трансформируется из узкой полосы 1244 см'1 в двойную широкую полосу 1224 см’1 и 1207 см’1 [4].
В УФ-спектре раствора ДМФ полосы поглощения карбонильной и фосфорильной групп в области 235 и 285 нм широкие и размытые и, вероятно, обусловлены вкладом продуктов гидролиза димефосфона, что подтверждается данными высокоэффективной (обращен-но-фазовой) жидкостной хроматографии (рис. 1, а, б).
Добавление соединений лития (лития цитрата, лития хлорида, лития карбоната) в водный раствор ДМФ приводит к образованию донорно-акцепторных комплексов, что подтверждается повышением рН и ИК-спектрами. ИК-спектр смеси ДМФ с лития хлоридом в присутствии 1% воды подобен спектру исходного ДМФ, содержащего 1% воды. Наблюдается более сильный сдвиг в области валентных колебаний фосфорильной группы с 1244 до 1207 см-1. В случае хлорида лития эта полоса более широкая и интенсивная по сравнению с полосой валентных колебаний карбонильной С=О группы и имеет плечо в области 1680 см_1. Аналогичный вид имеют спектры комплексов ДМФ с другими соединениями лития в присутствии воды. О комплексообразовании димефосфона с ионами лития также свидетельствует УФ-спектр продукта взаимодействия ДМФ с хлоридом лития, в котором оптическая плотность А в области
’ г отн
190-210 нм уменьшается в 3 раза по сравнению с исходным раствором ДМФ этой же концентрации, а Аотн, характерная для карбонильной группы при ^=285 нм, остается постоянным.
Замена хлорида лития на другие соли, в том числе цитрат лития, либо получение цитрата лития in situ при добавлении безводного карбоната лития в водный раствор лимонной кислоты также обеспечивает образование донорно-акцепторных комплексов ДМФ или продуктов его гидролиза с ионами лития (данные ИК-, УФ-спектров).
Специфическое фармакологическое действие препарата изучено при оценке когнитивно-мнестических особенностей, поведенческой активности и эмоционального состояния крыс при введении водного раствора состава (в масс.%): димефосфон - 30,0; карбонат лития - 0,7; лимонная кислота - 3,7; вода деионизованная - до 100 (65,6).
Данные по выработке условного рефлекса пассивного избегания (УРПИ) приведены в таблице 1.
Достоверное отличие латентного периода перехода в темный отсек при воспроизведении от латентного периода перехода в темный отсек животных с введением пирацетама при воспроизведении (p<0,05) наблюдалось в контрольной и «препарат 1,4 мл» группах животных, что может свидетельствовать о дозозависимом эффекте препарата. В группе «препарат 2,8 мл» латентный период перехода в темный отсек при воспроизведении достоверно сопоставим с латентным периодом перехода в темный отсек животных с введением пирацетама.
Результаты, приведенные в таблице 2, получены при тестировании в установке «открытое поле» [1].
Длительность реакции груминга определяется беспокойным состоянием животного [7]. Уменьшение про-
должительности реакции груминга свидетельствует о выраженном анксиолитическом эффекте препарата и наиболее всего проявляется в группах «пирацетам» и «препарат 2,8 мл». Дозозависимый эффект действия препарата подтверждается и схожей длительностью реакции принюхивания в контрольной и «препарат 0,7 мл» группах и ее снижением при увеличении концентрации препарата.
Из данных таблицы 2 видно, что наибольшие достоверность и сравнимость результатов показателей двигательной активности в условиях «открытого поля» наблюдаются для групп «пирацетам» и «препарат 2,8 мл».
Для детального изучения влияния препарата на когнитивные и мнестические функции проводили моделирование условного рефлекса активного избегания (УРАИ), позволяющего оценить степень обучаемости каждого отдельного животного, стадию выработки условного рефлекса.
Влияние препаратов на когнитивные функции ЦНС крыс отражено в таблице 3.
В первый день обучения крыс УРАИ в группах с введением препарата количество условно-рефлекторных реакций избегания меньше, чем в группе с введением пирацетама (табл. 3). Латентное время избегания не отличалось (р<0,05) от контрольного и исходного значений.
В группе «препарат 1,4 мл» количество условнорефлекторных избеганий на протяжении всего периода обучения крыс УРАИ было достоверно меньше, чем в группе с введением пирацетама, и достоверно не отличалось (р<0,05) от исходного значения и соответствующего показателя контрольной группы (табл. 3).
Со второго дня количество реакций избегания в группе «препарат 2,8 мл» не отличалось от значения группы с введением пирацетама. Количество коротколатентных реакций избавления (КЛИ) в группе «препарат 1,4 мл» было достоверно больше (р<0,05), чем в группе с введением препарата объемом 2,8 мл (табл. 3). Возможно, данная динамика связана с наблюдавшейся во 2-й и 3-й дни обучения тенденцией к снижению КЛИ и увеличению условно-рефлекторных избеганий в этой группе, что может свидетельствовать о положительном влиянии «препарат 2,8 мл» на обучение крыс УРАИ. На третий день обучения количество реакций избегания (РИ) и ЛВИ в группе «препарат 2,8 мл» превысило исходный уровень (р<0,05). Изучение динамики изменения показателей УРАИ при введении препарата показало дозозависимый эффект (табл. 3).
Ноотропное действие препарата также подтверждено его влиянием на мнестические функции ЦНС крыс. Влияние препаратов на показатели мнести-ческих функций ЦНС при воспроизведении УРАИ у крыс показало, что количество реакций избегания в контроле увеличивается с 15,38±2,67 (четвертый день обучения) до 17,88±7,75 (через четырнадцать дней после обучения), тогда как под действием «препарата 2,8 мл» изменения составили с 20,83±3,44 (четвертый день обучения) до 21,00±3,75 (через четырнадцать дней после обучения). Показатели УРАИ для пирацетама аналогичны изучаемому «препарату 2,8 мл»: с 25,38±2,09 до 26,00±1,39. Латентное время избегания для пирацетама и «препарата 2,8 мл» остается неизменным, но в обоих случаях эта величина намного меньше, чем для контроля.
Обсуждение результатов
Результаты проверки сохранения у крыс выработанного условного рефлекса, проведенной через пять дней после последнего сеанса обучения, показали высокий уровень воспроизведения условного рефлекса в группах животных с введением пирацетама и «препарата 2,8 мл».
Полученные нами результаты по ноотропному действию водных растворов комплексов димефосфо-на с соединениями лития подтверждают известные литературные данные исследований когнитивно-мнес-тических функций 15%-ного водного раствора диме-фосфона [6]. Авторами установлено, что димефосфон в дозах, двукратно превышающих используемые нами в эксперименте, облегчает этап консолидации памятного следа. Доказательством этого эффекта являются достоверное повышение числа обученных УРПИ животных, удлинение латентного периода их захода в темный отсек камеры на 61-85% [6], что сопоставимо с результатами, полученными нами, - 73-79% (табл. 1). Можно предположить, что двукратное сокращение дозы действующего вещества (димефосфона), вероятно, обусловлено присутствием ионов лития в разработанном нами препарате [4].
Таким образом, доклинические исследования на крысах показали дозозависимость действия разработанного препарата, помогли выделить его эффективную дозу («препарат 2,8 мл»), в которой его положительный ноотропный эффект сравним с эффектом пирацетама, как при обучении, так и при воспроизведении УРАИ. Данные исследования позволяют с большой уверенностью допустить разработанные композиции до дальнейших этапов доклинических исследований, клинических испытаний и внедрения на фармацевтический рынок.
ЛИТЕРАТУРА
1. Буреш Я. Методики и основные эксперименты по изучению мозга и поведения / Я. Буреш, О. Бурешова, Д. Хьюстон. - М., 1991. - 385 с.
2. Зиганшина Л. Е, Студенцова И. А, Зиганшин А. У., Валеева И. Х. Механизм действия димефосфона // Эксперим. и клинич. фармакология. - 1992. - № 2. - С. 43-45.
3. ИК-спектральное исследование комплексообразования димефосфона с хлоридом кальция / Я. Я. Шагидуллин, И. И. Вандю-кова, А. О. Визель и др. // Химико-фармацевтический журнал. -2004. - Т. 38, № 10. - С. 48.
4. Лекарственные средства, обладающие ноотропной активностью: Пат. Рос. Федерация: МПК7 / Раснецов Л. Д., Мельникова Н. Б., Гуляев И. В. и др. - № 2006124117; опубл. 20.04.2008. Бюл. № 11.
5. Мельник В. А., Мельник А. И. Достижения в использовании солей лития в клинической педиатрии и дальнейшие перспективы в этой области // Педиатрия. - 1998. - № 12. - С. 76-79.
6. Способ коррекции интеллектуально-мнестических функций у детей с задержкой психического развития: Пат. Рос. Федерация: МПК6 / И. А. Студенцова, Р. Х. Хафизьянова, Д. М. Менделевич и др. - № 2020938; опубл. 15.10.1994. Бюл. № 19.
7. Родина В. И. Новый метод оценки тревожно-фобических состояний у крыс // Патологическая физиология и экспериментальная терапия. - 1992. - № 6. - С. 11-13.
8. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / Под ред. Р. У. Хабри-ева. - М.: Медицина, 2005. - 832 с.
Поступила 25.03.2009
Кубанский научный медицинский вестник № 3 (108) 2009
