CC BY
46
Биология
Вестник Нижегородского университета им. Н.И. Лобачевского, 2007, № 6, с. 124-128
УДК 615.835.3
ВЛИЯНИЕ БУФОТИНА И ГУТИМИНА НА ВЫРАБОТКУ И СОХРАННОСТЬ УСЛОВНОГО РЕФЛЕКСА АКТИВНОГО ИЗБЕГАНИЯ
У КРЫС ЛИНИИ WISTAR
© 2007 г. А.А. Миронов, В.Н. Крылов, И.В. Мухина, О.П. Тихобразова
Нижегородский госуниверситет им. Н.И. Лобачевского vest_nngu@mail.ru
Поступила в редакцию 23.11.2007
Проведено изучение влияния кардиотропного препарата буфотин и антигипоксанта гутимин на выработку условного рефлекса активного избегания у крыс линии Wistar. Показана эффективность действия буфотина на такие интегративные функции головного мозга нормальных по обучаемости крыс, как обучение и память. Препарат жабьего яда - буфотин оказывал сходное по эффективности действие на выработку и прочность (закрепление) УРАИ у крыс с препаратом класса ноотропов пирацетам. Гутимин в проведенных экспериментах не оказывал влияния на обучение и память крыс линии Wistar в условиях выработки УРАИ. Можно заключить, что антигипоксические и ноотропные свойства исследуемых препаратов не взаимосвязаны, а ноотропный эффект буфотина связан с присутствием в его составе буфотенинов и буфадиенолидов.
Необходимость поиска новых эффективных средств для профилактики и лечения заболеваний человека определяется побочными эффектами, нередко наблюдаемыми при терапии синтетическими препаратами. Поэтому все более актуальным становится исследование физиологической активности и внедрение в практику природных соединений. Их практическая значимость так же несомненна, как и огромное преимущество перед синтетическими препаратами [1].
Одним из таких средств является разработанный в ННГУ [2] и разрешенный ФК МЗ РФ для клинического изучения кардиотонический препарат на основе яда жаб - буфотин (от латинского родового названия жаб - «буфо» и окончания «ин», определяющего, согласно рекомендациям ФК МЗ РФ, принадлежность к кардиотоническим средствам). Он представляет собой инъекционный 0.1% водно-спиртовой раствор экстракта кожных желез (жабьего яда) жабы зеленой (Bufo vmdis Laur). По данным доклинического изучения, проведенного в ННГУ и НГМА, препарат имеет преимущество перед катехоламинами по продолжительности кардиостимулирующего и вазотонических действий, по отсутствию выраженного хронотроп-ного действия, а перед сердечными гликозида-ми - по быстроте наступления указанных эффектов. Ранее проведенные исследования выявили у буфотина не только кардиотропные, но и антиоксидантные свойства [3, 4]. Имеются данные, что буфотин обладает нейротропным действием, положительно влияя на такие выс-
шие интегративные функции головного мозга крыс, как обучение и память в условиях выработки условного рефлекса пассивного избегания (УРПИ) [5, 6]. Также получены экспериментальные данные о повышении резистентности организма животных к острой гипобариче-ской гипоксии с помощью буфотина. Применение препарата предупреждает гипоксическое нарушение таких функций высших отделов ЦНС, как обучение и память [5, 7].
Гутимин - К-диаминометилдитиомочевина, малотоксичное соединение, обладающее анти-гипоксическими и антиоксидантными свойствами [8]. Свое защитное действие он реализует как на клеточном, так и на системном уровне [3]. Препарат обладает свойством повышать резистентность организма к острому дефициту кислорода. Показано, что гутимин наиболее активен в предупреждении гипоксических осложнений таких состояний, как послеоперационная и посттрансфузионная гипоксия, острое падение сердечной деятельности на фоне инфаркта миокарда и после операций на «открытом сердце», септический шок. Обладая антиок-сидантным действием, благодаря энергостабилизирующим и антиацидотическим свойствам, гутимин препятствует избыточному образованию свободных радикалов и угнетению эндогенных антиоксидантных систем.
Учитывая, с одной стороны, что оба изучаемых препарата оказывают выраженный антиги-поксический эффект, что является одним из свойств ноотропов, а с другой - проблему угасания когнитивных и мнестических функций у
стареющего населения страны, мы предположили возможность применения буфотина и гути-мина и в этой области практической медицины.
В связи с выше изложенным, целью работы явилось изучение влияния буфотина и гутимина на выработку условного рефлекса активного избегания у крыс линии *^81аг. В качестве сравнения в опытах использовали препарат из класса ноотропов пирацетам.
Решались следующие задачи:
1. Оценка степени обучаемости условному рефлексу активного избегания (УРАИ) каждого из экспериментальных животных во взятой выборке.
2. Сравнительное изучение действия буфо-тина и гутимина на процессы обучения и памяти методом УРАИ у нормальных по обучаемости крыс.
Материалы и методы
Опыты выполнены на 45 самцах белых крыс линии '^81аг, массой 220-250 г. Животных подвергали предварительному тестированию по выявлению их способности к обучению. Выявление крыс с низкой способностью к обучению проводили с помощью тестирования в челночной камере, состоящей из двух одинаковых отсеков с электродным полом, разделенных перегородкой с отверстием, методом выработки условного рефлекса активного избегания [9]. Безусловное электрокожное авер-зивное раздражение подавалось на лапы животного после предварительного изолированного действия УС, в качестве которого использовали звук длительностью 4 с. Параметры раздражающего тока: 50 Гц, 0.4-0.8 мА (в зависимости от индивидуальной чувствительности, определяемой по выраженности ответа). Интервалы между предъявлением УС и элек-трокожным раздражением составляли 2 с; максимальная продолжительность каждого элек-трокожного раздражения - 4 с; интервал между предъявлениями УС - 20 с. Условный рефлекс считался выполненным, если животное переходило в смежный отсек камеры в течение 6 с после включения УС. УРАИ вырабатывали в течение 5 дней по 30 сочетаний раздражителей ежедневно. 20% крыс от общего количества экспериментальных животных, которые в конце пятого дня тестирующего обучения имели более 15 невыполненных реакций, классифицировались нами как плохо обучаемые (животные с пониженным уровнем обучаемости) и в дальнейшем эксперименте участия не принимали.
Остальные животные были разделены на
4 группы, каждая из которых включала по 9 животных:
1. Опытная - с введением буфотина;
2. Опытная - с введением гутимина;
3. Опытная - с введением пирацетама;
4. Контрольная - с введением 0,9%-го раствора №С1.
Обучение этих животных возобновляли через 15 дней после тестирования на обучаемость, на фоне введения буфотина, пирацетама и вели контроль в течение последующих 4 дней. Буфо-тин в дозе 0.1 мг/кг, гутимин (25 мг/кг) и пирацетам в дозе 400 мг/кг, 0.9%-ный раствор №С1 вводили внутрибрюшинно. Динамику формирования УРАИ тестировали ежедневно через 15 минут после введения препаратов.
Определение сохранности навыка проводили через 5 дней после последнего сеанса обучения УРАИ.
При оценке результатов исследований динамики выработки УРАИ нормальных по обучаемости крыс регистрировали основные поведенческие показатели, характеризующие процессы обучения и памяти животных: число избеганий и коротколатентных реакций избавления от электрокожного раздражения (менее 1 с), число «невыполненных» реакций и число межсиг-нальных реакций, а также латентный период избавления.
Результаты исследования обрабатывали общепринятыми статистическими методами с использованием ^-критерия Стьюдента, учитывая поправку Бонферрони для множественных сравнений. Различия считали достоверными при уровне значимостир < 0.05.
Результаты и обсуждение
Предварительное тестирование крыс методом условного рефлекса активного избегания позволило удалить из дальнейшего эксперимента животных с исходно низким уровнем обучаемости.
В 1-й день обучения крыс УРАИ мы наблюдали, что количество условно-рефлекторных избеганий у крыс в группе с введением гутими-на было достоверно ниже соответствующего исходного показателя и показателей групп с введением буфотина и пирацетама (рис. 1), но не отличалось на протяжении всего периода обучения от контрольного значения. В группе животных с введением буфотина данный показатель не отличался от исходного, а также на протяжении всего периода обучения не было значимых различий по этому показателю между
исх 1 сут 2 сут 3 сут 4 сут
Исх □ Гут □ Буф □ Пир □ Контр
Рис. 1. Влияние исследуемых препаратов на динамику количества условнорефлекторных реакций избегания у крыс: * - достоверное отличие от исходного уровня, р<0.05; ** - достоверное отличие от предыдущего периода, р<0.05; *** - достоверное отличие от буфотина, р<0.05; # - достоверное отличие от пирацетама, р<0.05
150 ^ *
исх 1 сут 2 сут 3 сут 4 сут
Исх ШГут ШБуф ШПир □ Контр
Рис. 2. Влияние исследуемых препаратов на динамику латентного времени избегания при выработке условного рефлекса активного избегания у крыс: * - достоверное отличие от исходного уровня, р<0.05; ** - достоверное отличие от буфотина, р<0.05; # - достоверное отличие от предыдущего периода, р<0.05
группами животных с введением буфотина и пирацетама.
На 2-е сутки формирования УРАИ число условно-рефлекторных избеганий в группе животных с введением гутимина и контрольной группе животных достигло исходного уровня и достоверно отличалось от первых суток обучения, но начиная с 3-го дня обучения в этой группе животных мы не наблюдали изменений в динамике формирования условного рефлекса. На 3-и сутки мы продолжали наблюдать достоверное отличие данного показателя в группе с введением пирацетама от исходного. Динамика действия буфотина развивалась схожим образом, так как количество условно-рефлекторных избеганий в 1.2 раза (р<0.05) превышало исходное значение, а на четвертый день обучения в 1.3 раза превысило контрольное значение, на основании чего можно сделать вывод о возможном ноотропном действии буфотина.
Аналогичную картину наблюдали при измерении латентного времени избегания, так как данный показатель в группе с введением гутимина и контроле в 1-й день обучения был достоверно выше исходного; в группе с введением буфотина не отличался от исходного, а также не отличался на протяжении всего периода обучения от времени избавления группы животных с введением пирацетама (рис. 2). На 3-й день исследования влияния препаратов на динамику формирования УР мы наблюдали достоверное уменьшение латентного времени избегания в группе с введением буфотина, по сравнению с предшествующим периодом обучения и с исходным уровнем, а также данный показатель был в 1.46 раза (р<0.05) меньше, чем в группе с введением гутимина, и достоверно ниже контрольного значения на 4-й день обучения УРАИ, по-прежнему не отличаясь от времени группы с введением пирацетама, что свидетель-
30
25
20
15
10
5
0
* *
□ Гут ШБуф ШПир □ Контр
Рис. 3 Влияние исследуемых препаратов на воспроизведение условного рефлекса активного избегания у крыс:
* - достоверное отличие от контроля, р< 0.05
140
120
100
80
60
40
20
0
с
*
□ Гут ШБуф Пир □ Контр
Рис. 4. Влияние исследуемых препаратов на латентное
* - достоверное различие с контролем, р< 0.05
ствует о схожем положительном влиянии препаратов на процесс обучения.
В первые два дня формирования УРАИ в динамике количества коротколатентных реакций избавления, показывающих, что животное ориентируется в челночной камере, и свидетельствующих об активации готовности животных к выполнению реакции активного избегания, достоверных различий не наблюдали; ни в одной из групп животных количество коротколатентных реакций избавления не отличалось от исходного значения. На третий день обучения в группе животных с введением пирацетама число коротколатентных реакций избегания стало достоверно меньше исходного уровня, что подтверждает ноотропное действие препарата. На протяжении всего периода обучения УР значимых различий данного показателя между экспериментальными группами животных не наблюдали.
Количество межсигнальных реакций, отражающих степень эмоционального напряжения животных, затрудняющего процесс выработки условно-рефлекторной реакции на аверзивное воздействие, в 1 -й день формирования УРАИ в контрольной группе животных превышало исходное значение, но уже на 2-й день обучения УРАИ значимых различий по этому показателю не было. Выявив положительное влияние буфо-тина на обучение крыс и неэффективность гу-тимина, далее мы изучили влияние препаратов на память экспериментальных животных, протестировав сохранность во времени выработанного УРАИ. Результаты проверки сохранности
время избегания при воспроизведении УРАИ у крыс:
навыка активного избегания, проведенной через
5 дней после последнего сеанса обучения, представлены на рисунке 3.
Анализ результатов сохранения у крыс выработанного навыка показал достоверно высокий уровень воспроизведения УРАИ в группе с введением буфотина: количество реакций избегания не отличалось от группы с введением пирацетама, в обеих группах животных было достоверно выше, чем в контроле. Количество реакций избегания и латентное время избегания (рис. 4) в группе с введением гутимина достоверно не отличались ни от одной из экспериментальных групп животных.
Таким образом, в проведенных экспериментах гутимин не оказывал влияния на обучение и память крыс в условиях выработки УРАИ. Бу-фотин оказывал ноотропное действие, аналогичное действию пирацетама, показано его оптимизирующее действие на выработку и прочность (закрепление) УРАИ.
В целом характер действия буфотина на показатели выработки УРАИ сопоставим с действием типичного ноотропа - пирацетама, на основании чего можно сделать вывод о сходном ноотропном действии буфотина. Однако есть особенность: наибольшая эффективность буфо-тина, при его введении нормальным по обучаемости крысам, проявлялась на третий день обучения, то есть на стадии начавшейся и формирующейся консолидации, что подтверждается данными литературы [5, 6]. Пирацетам начинал оказывать положительное действие на форми-
рование условного рефлекса активного избегания на более ранних этапах обучения, но его эффективность уменьшалась к аналогичному периоду времени максимума эффективности буфотина. Проведенные исследования показали, что буфотин, в отличие от гутимина, обладает не только кардиотропным, но и нейро-тропным действием, положительно влияя на такие интегративные функции головного мозга крыс, как обучение и память в условиях выработки УРАИ.
Обсуждая полученные результаты, следует заключить, что ноотропные эффекты препарата могут быть обусловлены непосредственным влиянием его компонентов на нейрональную активность. В частности, один из механизмов ноотропного действия препарата в проведенных экспериментах может быть обусловлен свойствами фракции биогенных аминов, входящих в состав буфотина, - производными 5-гидрокси-триптамина - группой буфотенинов, влияющих на активацию эндогенной опиоидной системы головного мозга. В последние годы было получено большое количество данных о влиянии эндогенных опиоидных пептидов на обучение и память [10, 11]. Участие эндогенной опиоидной системы в реализации различных эффектов бу-фотина выглядит вполне обоснованным, так как ее активация была при введении животным яда жаб установлена экспериментально [12].
Список литературы
1. Крылов В.Н. Исследование кардиотоническо-
го действия яда зеленой жабы Ви&> // Журн.
эвол. биохимии и физиологии. 2002. Т. 38, № 2. С. 173-176.
2. Крылов В.Н., Вальцева И.А., Давыдов В.Ф., Ошевенский Л.В., Петерсоне Э.Ю., Лаздынь А.А., Бояринов Г.А., Синицын Л.Н. Средство, обладающее
кардиостимулирующим действием. Патент № 20б8б97 на изобретение // Бюлл. № З1. 10.11.1996.
3. Конторщикова К.Н., Крылов В.Н., Мухина Й.В. Сравнительное изучение действия гутимина и буфотина на нерекисное окисление липидов и сократительную функцию изолированного сердца крысы // Экснер. и клин. мед. 1990. № З. С. 271-274.
4. Contorshicova C. Antioxidant activity of Bufotin. In: Regulation of Inter. Conference on free radical tractions. Abstract. Varna; 1989. Р. 83-84.
5. Миронов А.А. Влияние буфотина на устойчивость ЦНС крыс к острой гипобарической гипоксии: Дисс... канд. биол. наук. Н. Новгород, 2002.
6. Миронов А.А., Башмаков П.А. Влияние препарата на основе жабьего яда буфотин на изменение условно-рефлекторных реакций б норме и нри гипоксии // Седьмая нижегородская сессия молодых ученых. Тезисы докладов. Н. Новгород, 2002. С. 230-232.
7. Миронов А.А., Мухина Й.В., Крылов В.Н. и др. Влияние превентивного введения буфотина на устойчивость центральной нервной системы крыс к острой гипобарической гипоксии // Нижегородский медицинский журнал. 200З. № 1. С. 26-33.
8. Долгих В.Т. Предупреждение постреанимаци-онных нарушений энергетического обмена миокарда гаммаоксибарбитуратом, иононом и гутимином // Вопросы мед. химии. 1988. Т. З4, № 1. С. ЗЗ-38.
9. Козловский Й.Й., Данчев Н.Д. Оптимизирующее действие синтетического пептида селанка на условный рефлекс активного избегания у крыс // Журн. высш. нервн. деят. 2002. Т. 52, № 5. С. 579-580.
10. Голанов Е.Б. Современное состояние проблемы эндогенных морфиноподобных веществ. М.: Наука, 1986. 91 с.
11. Зайцев С.В., Ярыгин К.Н., Варфоломеев С.Д. Наркомания. Нейропептид-морфиновые рецепторы. М.: Йзд-во МГУ, 199З. 256 с.
12. Парин С.Б. Роль эндогенной опиоидной системы б физиологических и повреждающих эффектах зоотоксинов: Дисс... канд. биол. наук. Горький, 1985. 218 с.
13. Захаров В.В. Нарушения памяти // Русский медицинский журнал. 2000. Т. 8, № 10. С. 402-40б.
THE IMPACT OF BUFOTIN AND GUTIMIN ON THE DEVELOPMENT AND PRESERVING THE CONDITIONED REFLEX OF ACTIVE AVOIDANCE IN WISTAR LINE RATS
A.A. Mironov, V.N. Krylov, I. V. Mukhina, O.P. Tikhobrazova
The effect of the cardiotropic drug bufotin and antihypoxant gutimin on the development of the conditioned reflex of active avoidance (CRAA) by Wistar line rats has been studied. The bufotin action has been shown to be effective on such brain integrative functions of normally-taught rats as training and memory. The effect of the toad venom drug bufotin on the development and preserving CRAA by rats was similar to that of the nootropic drug pyracetam. In our experiments, gutimin did not affect the training and memory of Wistar line rats under conditions of the CRAA development. It may be concluded that antihypoxic and nootropic features of the drugs under study are not interrelated and that bufotin’s nootropic action is due to the presence of bufotenins and bufadienolides it contains.
