CC BY
15
УДК 577.15.08+606.61
Шевченко А.Т., Ванюшенкова А.А., Панюкова Н.С., Пузанова Н. Д., Белов А.А.
ДЕЙСТВИЕ НА КОЛЛАГЕН РАЗЛИЧНЫХ ТЕРАПЕВТИЧЕСКИХ АГЕНТОВ. ЛИДОКАИН
Ванюшенкова Анна Алексеевна - магистр 2-го года обучения факультета биотехнологии и промышленной экологии;
Шевченко Алла Тарасовна - бакалавр 2-го года обучения факультета биотехнологии и промышленной экологии; Панюкова Наталья Сергеевна - инженер подразделения Центр коллективного пользования им. Д.И. Менделеева; Пузанова Надежда Даниловна - инженер подразделения Центр коллективного пользования им. Д.И. Менделеева; Белов Алексей Алексеевич - д.т.н., профессор кафедры биотехнологии, ABelov2004@ yandex.ru Российский химико-технологический университет им. Д.И. Менделеева, Москва, Россия 125480, Москва, ул. Героев Панфиловцев, д. 20
Изучено влияние лидокаина на коллаген, как на модель кожи человека, в условиях, моделирующих гнойную рану. Было установлено, что помещение нативного коллагена в модельную среду не оказывает существенного влияния на его третичную структуру. Кроме того, было показано, что введение лидокаина также не способствует процессам деструкции коллагенового волокна.
Ключевые слова: лидокаин, коллаген, инактивация фермента, препараты для ранозаживления
VARIOUS THERAPEUTIC AGENTS' ACTION ON COLLAGEN. LIDOCAINE
Shevchenko A.T., Vaniushenkova A.A., Panyukova N.S., Puzanova N.D., Belov A.A.* D.I. Mendeleev University of Chemical Technology of Russia, Moscow, Russia. *e-mail: ABelov2004@ yandex.ru
The effect of lidocaine on collagen, as a model of human skin, was studied under conditions simulating a purulent wound. It was found that the placement of native collagen in a model medium does not significantly affect its tertiary structure. In addition, it was shown that the addition of lidocaine also does not come up with the destruction of collagen fibers.
Keywords: lidocaine, collagen, inactivation of the enzyme, wound healing dressings.
Введение.
Применение энзиматического метода при лечении ран, т.е. удаление девитализированных тканей с помощью ферментов и полиферментных препаратов, является наиболее эффективным и при этом наименее болезненным для пациентов. Протеолитические ферменты, которые являются наиболее лабильной составляющей комплексных препаратов, сегодня используют для очищения девитализированных тканей [1]. Большая часть известных протеаз (трипсин, химотрипсин и пр.) не обладает высокой специфичностью к нативному (не денатурированному) коллагену. Нативный коллаген не гидролизуется обычными пептидгидролазами. Основной фермент его катаболизма - коллагеназа, которая расщепляет пептидные связи в определённых участках спирализованных областей коллагена. Коллагеназа относится к числу немногих протеолитических ферментов со специфическим действием на коллагеновые волокна. Коллагеназа обладает высокой специфичностью, она перерезает тройную спираль коллагена в определённом месте, примерно на 1/4 расстояния от С-конца, между остатками глицина и лейцина (или изолейцина). Образующиеся фрагменты коллагена растворимы в воде, при температуре тела они спонтанно денатурируются и становятся доступными для действия других протеолитических ферментов. Коллаген составляет около 25% от общей массы всех белков организма и является основным белком соединительных тканей [2]. Так же коллаген, является основным фибриллярным белком межклеточного матрикса. Молекула нативного (не
денатурированного) коллагена представляет собой три полипептидных цепи закрученных в тройную суперспираль. Коллаген - это очень стабильный белок в нормальных здоровых условиях. Деградация коллагена может протекать по-разному, но в целом считается, что существуют две возможности: внутриклеточная и внеклеточная. При денатурации коллагена происходит разрушение волокон и раскручивание тройных спиралей макромолекул с образованием случайных клубков полипептидных цепей (желатина). Разрушение упорядоченной структуры коллагена сопровождается его усадкой, потерей двойного лучепреломления и коллаген становится подвержен действию различных протеолитических ферментов [2,3]. Структура коллагена очень стабильна из-за внутримолекулярных водородных связей между глицином в соседних цепях. В литературе было показано [2,3], что многие электролиты нарушают нативную структуру коллагена, за счет предотвращения образования водородных связей и (или) из-за изменения структуры воды в непосредственной близости от этих участков. Обратимая денатурация - ренатурация или ренактивация - это процесс, при котором денатурированный белок, после удаления денатурирующих веществ вновь самоорганизуется в исходную структуру с восстановлением биологической активности.
Экспериментальная часть.
Быстрое и успешное проникновение терапевтических агентов (ТА) в кровоток, а в дальнейшем-в различные ткани, органы человека возможно благодаря использованию в разработанных препаратах различных
вспомогательных веществ, биополимеров. Некоторые ТА могут вызывать временную (обратимую) денатурацию природного коллагена, в частности-коллагена кожного покрова. В результате, может наблюдаться «разъедание» кожи, что связано с влиянием неспецифических ферментов на денатурированную форму коллагена (на мертвые фрагменты белка).
В нашем исследовании для определения изменений, происходящих в препаратах коллагена под воздействием температурного фактора, воздействия среды, моделирующей гнойную рану (37оС, фосфатный буферный раствор (ФБ) рН 6,2), а также при введении терапевтических агентов (ТА) были получены данные УФ-Вид спектрофотометрии.
Измерения выполнялись с помощью регистрирующего спектрофотометра фирмы Shimadzu UV-2600 (Япония). На рис.1 представлены данные о взаимодействии лидокаина и коллагена в 1/15М ФБ 6,2 при 37°С при различном времени выдержки (до 72 часов). Из полученных данных видно, что химическое взаимодействие между молекулой коллагена и лидокаином отсутствует. А именно, отмечается отсуствие сдвигов и полная аддитивность спектров. Для более подробного изучения видоизменения структуры коллагена при описанных выше условиях был проведен ряд исследований методом ИК-спектроскопии. ИК-спектры были получены с помощью ИК-Фурье спектрометра Nicolet 380 с приставкой НПВО (Thermo Scientific, США) в диапазоне 550 - 4000 см-1, где в качестве оптического материала использовался кристалл из селенида цинка. Исследования по методу ИК-спектроскопии выполнялись на оборудовании Центра коллективного пользования РХТУ им. Д.И.Менделеева. Данные, полученные в ходе ИК-спектроскопии представлены на рисунках 2-3.
Анализ данных ИК-спектроскопии проводился по основным, характеристическим пикам коллагена, а именно по амиду A (3434-3293 см-1), амиду В (29502919 см-1), амиду I (1718-1641 см-1), амиду II (15401549 см-1) и амиду III (1250-1240 см-1) [6]. Из литературы известно [6], что глобальные изменения в третичной структуре коллагенового волокна детектируются при соотнесении величин поглощения амида III и характеристической полосы на 1456 см-1. В
нормальных условиях данное соотношение равно 1,0/колеблется в пределах погрешности измерительного прибора; при деструктивных процессах, затрагивающих третичную структуру микрофибриллы, данное значение стремится к 0.
1,500г
1,000
0,500
-0,010 190,00
0,400
0,300
0,200
0,100
300,00 320,00
\ 1 1 1 лидокаин
лидокаин+коллаген "
время выдержки
2ч
24ч
72ч
коллаген
-0,010-1-1-
245,00 250,00 260,00
270,00 нм.
280,00
290,00
Рис.1. УФ-вид спектры коллагена и лидокаина в 1/15М ФБ 6,2 при 37°С. Данное явление объясняется тем, что пик амида III является комбинацией пиков С^-валентных колебаний и К-Ы-деформации амидных связей, а также поглощения, возникающего из вращательных колебаний СН2-группы глицинового скелета и боковых цепей пролина, в то время как волновое число 1456 см-1 определяет наличие вращательного колебания С-Ы-групп.
Рис.2. ИК-спектры коллагена и лидокаина с различными концентрациями в 1/15М ФБ 6,2 при 37°С, 72ч, где
Ci=10 мг/мл, С2=25 мг/мл, Со=100 мг/мл.
Рис.3. ИК-спектры коллагена, лидокаина с концентрацией 100 мг/мл в 1/15М ФБ 6,2 при 37°С при различном
времени экспозиции.
области 800 см-1, деструктурированных
К факторам нарушения метаболитических путей коллагенового синтеза медики относят нарушения, связанные с образование нетипичных структур за счет неферментативного гликозилирования и смещение суммарного заряда макромолекулы. При этом нарушается общая третичная структура коллагенового волокна [7]. Наличие протеогликанов и областей неспецифичного гликозилирования соответствует поглощению при 1100-1000 см-1.
Кроме вышеперечисленного, из соотнесения спектральных картин детектируется наличие, увеличение и уменьшение количества желатины. В норме, в спектральной картине нативного коллагенового волокна отсутствует
характеристический пик в наличествующий в спектрах форм [8].
Из полученных данных (рис.2.-рис.3.), видно, что при введении лидокаина в систему не происходит значительных колебаний соотношения величин поглощения амида III и характеристической полосы на 1456 см-1. Это указывает на сохранение третичной структуры коллагеновой спирали. При этом, при вычитании пика на 800 см-1, характерного субстанции лидокаина, из спектральной картины композиции коллаген-лидокаин, отмечается отсутствие увеличения количества желатины.
Также, для уточнения полученных данных был проведен ряд экспериментов с использованием нингидриновой методики. Согласно полученным данным, экспозиция коллагена в модельных условиях, а также в присутствии лидокаина в течение 48 часов не оказывает существенного влияния на его структуру. Заключение
Из полученных данных следует, что помещение нативного коллагена в модельную среду не оказывает существенного влияния на его третичную структуру (37оС, фосфатный буферный раствор (ФБ) рН 6,2). Кроме того, было показано, что введение лидокаина в концентрации, в 10 раз превышающей
использующуюся в медицинских целях, не способствует процессам деструкции микрофибрилл коллагенового волокна, а также не воздействует на его деструктурированную часть - желатину.
Список литературы
[1] Белов А.А. Разработка промышленных технологий получения новых медицинских материалов на основе модифицированных волокнообразующих полимеров, содержащих биологически активные белковые вещества // Дисс. на соис. уч. степ. докт. техн. наук М., РХТУ, 2009. 385 с.
[2] Игнатьев Н.Ю., Аверкиев С.В., Соболь Э.Н., Лунин В.В. Денатурация коллагена II в хрящевой ткани при термическом и лазерном нагреве //Ж. физ.химии, 2005, Т. 79, № 8, С. 1505-1513.
[3] Ruud A. Bank, Marianne Krikken, Bob Beekman A simplified measurement of degraded collagen in tissues application in healthy, fibrillated and osteoarthritic cartilage /|Matrix Biology 1997, Vol.16, pp. 233-243.
[4] Майорова А.В., Сысуев Б.Б., Иванкова Ю.О., Ханалиева И.А. Коллагеназы в медицинской практике: современные средства на основе коллагеназы и перспективы их совершенствования //Фармация и фармакология. 2019;7(5):260-270. DOI: 10.19163/23079266-2019-7-5-260-270
[5] Биохимия: учебник для вузов/ под ред. Е.С.Северина - 5-е изд., - 2009. - 768 с.
[6] Пивненко Т. Н. и др. Влияние ультразвуковой и ферментативной обработки на процесс деполимеризации коллагена //Актуальные проблемы освоения биологических ресурсов Мирового океана. -2018. - С. 91-96.
[7] Shi L. et al. Advanced glycation end productions and tendon stem/progenitor cells in pathogenesis of diabetic tendinopathy //World Journal of Stem Cells. - 2021. - Т. 13. - №. 9. - P. 1338.
[8] Пчелин В.А., Салимов М. А. О взаимодействии желатины с формальдегидом. //Высокомолекулярные соединения. - 1959. - Т. 1. - №. 5. - С. 682-687.
