CC BY
13
УДК 577.15.08+606.61
Ванюшенкова А.А., Ханафина А.А., Савельева Е. Е., Бркич Л.Л., Белов А.А.
СТАБИЛИЗАЦИЯ ТРИПСИНА ИММОБИЛИЗОВАННОГО НА ХИТОЗАНЕ В ПРИСУСТВИИ ТЕРАПЕВТИЧЕСКИХ АГЕНТОВ
Ванюшенкова Анна Алексеевна, студент 2-го курса факультета биотехнологии и промышленной экологии; Ханафина Анна Андреевна, студент 3-го курса факультета биотехнологии и промышленной экологии; Савельева Елизавета Евгеньевна, студент 4-го курса факультета биотехнологии и промышленной экологии; Бркич Лилиана Любановна, аспирант кафедры промышленной фармации, институт трансляционной медицины и биотехнологии федерального государственного автономного образовательного учреждения высшего образования первый московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова (СЕЧЕНОВСКИИ УНИВЕРСИТЕТ), 119991, г. Москва, ул. Трубецкая, д. 8, стр. 2
Белов Алексей Алексеевич, д.т.н., доцент кафедры биотехнологии, E-mail: ABelov2004@ yandex.ru Российский химико-технологический университет им. Д.И. Менделеева, Москва, Россия 125480, Москва, ул. Героев Панфиловцев, д. 20
Изучено действие различных терапевтических агентов (мирамистин, лидокаин, антиоксиданты, глицерин и др.) на панкреатический трипсин (из КРС) в присутствии хитозана. До массового соотношения фермент:терапевтический агент равного 50 в пределах погрешности определения (±10%) исследованные препараты не влияют на ферментативную активность (по казеину) трипсина. При длительной термоинактивации в жидкой среде (до 72 ч, Т +37 °С, рН 6,2) хитозан стабилизирует трипсин.
Ключевые слова: хитозан, трипсин, термоинактивация, стабилизация, УФ-спектры, мирамистин.
STABILIZATION OF TRIPSIN IMMOBILIZED ON CHITOSANE IN THE PRESENCE OF THERAPEUTIC AGENTS
Vaniushenkova A.A., Khanafina A.A., Savelyeva E.E., Brkich L.L., Belov A.A.*
D.I. Mendeleev University of Chemical Technology of Russia, Moscow, Russia. *e-mail: abelov2004@ yandex.ru
The effect of various therapeutic agents (miramistin, lidocaine, glycerin, etc.) on pancreatic trypsin (from cattle) in the presence of chitosan was studied. Before the mass ratio of the enzyme: therapeutic agent equal to 50 within the error of the determination (± 10%), the studied preparations do not affect the enzymatic activity (casein) of trypsin. With prolonged thermal inactivation in liquid medium (up to 72 h, T + 37 ° C, pH 6.2), chitosan stabilizes trypsin.
Keywords: chitosan, trypsin, thermoinactivation, stabilization, UV spectra, miramistin.
Выбор биополимеров для медицинского препарата - сложная проблема, т.к. создаваемая система должна осуществлять направленную доставку лекарственного вещества к поврежденному участку, обеспечивать его высвобождение в нужный момент и в оптимальном количестве, необходимом для лечения. В настоящее время большое внимание уделяется проблеме придания раневым покрытиям дополнительных лечебных свойств путем введения в перевязочный материал ферментов и иных терапевтических агентов. Многолетний опыт применения протеолитических ферментов, вводимых в чистом виде непосредственно в рану, показал, что такой способ лечения себя не оправдывает: активность протеаз в гнойной ране быстро и резко падает, через 15-20 мин они теряют активность вследствие расщепления тканевыми и сывороточными ингибиторами крови.
Преимущества иммобилизованных форм ферментов над нативными известны, наиболее важные из них -повышение стабильности и уменьшение иммунологической и аллергической реакций
организма за счет понижения способности модифицированного фермента стимулировать образование антител и реагировать с ними. Использование хитозана - природного полимера -обусловлено наличием у него ряда уникальных свойств, таких как биосовместимость, способность к биодеградации с образованием безвредных мономеров, нетоксичность и др. [1-3].
Необходимость изучения процессов
взаимодействия хитозана (Хт) с терапевтическими агентами (ТА) (ТА-это вещества или их комбинации, которые применяются с целью лечения заболевания или в качестве превентивных мер) встает не только при разработке технологии получения тех или иных медицинских препаратов, но и для объяснения возможных механизмов действия созданного средства в организме человека. Причем следует иметь в виду, что хитозановые гели могут применяться как сами по себе, в виде лечебных мазей, или гелей, так и в виде аппликационных форм (при их нанесении на нерастворимые носители)
[2,3].
Нами было изучено влияние на трипсин (Тр) как Хт, так и различных ТА: биоцида - мирамистина (Мир), некоторых антиоксидантов, органических растворителей и лидокаина (Лд) в присутствии и без Хт. На рис. 1,2 представлены УФ спектры бинарных и тройных систем (Тр, Мир, Хт). Аналогичные данные получены и для других систем. Как видно из полученных данных, нет сильного химического взаимодействия между компонентами смеси. Наличие в исследуемом спектре всей совокупности
До массового соотношения фермент : терапевтический агент равного 50 в пределах погрешности определения (±10%) исследованные вещества (мирамистин, лидокаин, хитозан, глицерин, алкилоксибензолы) не влияют на ферментативную активность (по казеину) трипсина.
Как нами было установлено при нахождение в растворе при повышенной температуре многие из изученных препаратов деструктурируют, что отражается в том числе на УФ-Вид спектрах.
полос с совпадающими (с точностью до 1нм) положениями максимумов и значениями максимальных коэффициентов экстинкции (с точностью до 10%) свидетельствует о тождественности исследуемого и сравниваемого соединений. Появление лишних полос или увеличение интенсивности отдельных максимумов может быть вызвано присутствием примесей или наличием межмолекулярных взаимодействий в исследуемом растворе.
Продукты деструкции могут инактивировать использованные ферменты (наиболее лабильный терапевтический агент). Была изучена кинетика термоинактивации Тр (в условиях отсутствия автолиза и ассоциации) в растворе 1/15М фосфатного буфера (рН 6,2) при различных температурах и времени выдерживания, в присутствии и без исследованных веществ. Полученные данные приведены в таблице.
Рис. 1. УФ спектры растворов хитозана (Хт), трипсина (Тр) и мирамистина (Мир)
Рис. 2. УФ спектры растворов хитозана (Хт), трипсина (Тр) и мирамистина (Мир)
Таблица. Величины эффективных констант скорости инактивации (ч-1) исследуемых препаратов при разных температурах, субстрат казеин_____
t, °С 25° 37° 45° 55° 65°
Образец k k k k k
Тр 0,006 0,112 0,325 0,66 2,59
Тр-Мир 0,003 0,042 0,3425 - 1,852
Хт-Тр-Мир 0,006 0,023 0,231 - -
Хт-Тр 0 0,028 0,18 0,63 2,10
Тр-Глицерин (2% в ФБ 6,2) 0,008 0,025 0,269 - -
Хт-Тр-Гл 27:1 (2% в ФБ 6,2) 0 0,031 0,186 - -
Тр-лидокаин - - - - 2,4
В модельных условиях (рН 6,2 и 37°С) исследованные терапевтические агенты могут подвергаться гидролитической деструкции (модификации), что хорошо видно из данных УФ-вид спектроскопии. Это может отражаться на их биологических свойствах. Продукты деструкции не снижают протеолитическую активность трипсина в условиях эксперимента.
Как видно из полученных данных Хт стабилизирует Тр в процессе термоинактивации в растворе (@=кпреп/кТр<1). Совместная инкубация Тр с Мир или продуктами его деструкции стабилизирует протеиназу от инактивации. Соиммобилизованные препараты Мир и ферментов сохраняют свою биоцидность [4].
Список литературы
1. Ефименко Н.А., Лысенко М.В., Стернин Ю.И., Новожилов А.А., Кнорринг Г.Ю
Протеолитические энзимы в хирургии: исторические аспекты и современные представления о применении// Русский медицинский журнал, 2011, №5.-С.368-375.
2. Белов А.А. Разработка промышленных технологий получения новых медицинских материалов на основе модифицированных волокнообразующих полимеров, содержащих биологически активные белковые вещества. Дисс. на соис. ученой степ. доктора технич. наук М.: РХТУ. 2009. С.385.
3. Досадина Э.Э., Бркич Л.Л., Пятигорская Н.В. и др. Использование хитозана в качестве носителя протеиназ и мирамистина для получения ферментсодержащего геля //Бутлеровские сообщения. 2016.Т.48.№10.с.49-59.
4. Савельева Е. Е., Досадина Э. Э., Бркич Л. Л. и др. Хитозансодержащие композиты протеиназ //Хим. пром. сегодня, 2017, №6, с. 32-42.
