CC BY
75
УДК 612.8 : 663.256
ДЕЙСТВИЕ ЭКСТРАКТА КРАСНОГО ВИНА НА ГЛУТАМАТНУЮ НЕЙРОТОКСИЧНОСТЬ
© 2013 г. А.Я. Шурыгин, А.А. Кравцов, Е.А. Немчинова, Н.С. Скороход, Л.В. Шурыгина, Н.М. Агеева,
Ю.В. Гапоненко
Шурыгин Алексей Яковлевич - доктор биологических наук, профессор, заведующий отделом биологически активных веществ, Кубанский государственный университет, ул. Ставропольская, 149, г. Краснодар, 350040.
Кравцов Александр Анатольевич - кандидат биологических наук, научный сотрудник, Кубанский государственный университет, ул. Ставропольская, 149, г. Краснодар, 350040, e-mail: balizfarm@mail.ru.
Немчинова Елена Александровна - научный сотрудник, ООО «Бализ Фарм», ул. Мира, 4/1, пос. Пашковский, г. Краснодар, 350910, e-mail: balizfarm@mail.ru.
Скороход Наталья Сергеевна - научный сотрудник, ООО «Ба-лиз Фарм», ул. Мира, 4/1, пос. Пашковский, г. Краснодар, 350910, e-mail: balizfarm@mail.ru.
Шурыгина Людмила Васильевна - кандидат биологических наук, старший научный сотрудник, заведующий отделом биологически активных веществ, ООО «Бализ Фарм», ул. Мира, 4/1, пос. Пашковский, г. Краснодар, 350910, e-mail: balizfarm @mail. ru.
Агеева Наталья Михайловна - доктор технических наук, профессор, заведующая лабораторией, Северо-Кавказский зональный НИИ садоводства и виноградарства Россельхозакадемии, ул. 40 лет Победы, 39, г. Краснодар, 350901, e-mail: ageyeva@inbox. ru.
Гапоненко Юрий Васильевич - кандидат технических наук, научный сотрудник, Северо-Кавказский зональный НИИ садоводства и виноградарства Россельхозакадемии, ул. 40 лет Победы, 39, г. Краснодар, 350901, e-mail: yg78@list.ru.
Shurygin Aleksey Yakovlevich - Doctor of Biological Science, Professor, Head of Department of Biologically Active Substances, Kuban State University, Stavropolskaya St., 149, 350040, Krasnodar.
Kravtsov Aleksandr Anatol'evich - Candidate of Biological Science, Researcher, Kuban State University, Stavropolskaya St., 149, 350040, Krasnodar, e-mail: balizfarm@mail. ru.
Nemchinova Elena Aleksandrovna - Researcher, OOO «Baliz Farm», Mir St., 4/1, pos. Pashkovsky, Krasnodar, 350910, e-mail: balizfarm@mail.ru.
Skorochod Natal'ya Sergeevna - Researcher, OOO «Baliz Farm», Mir St., 4/1, pos. Pashkovsky, Krasnodar, 350910, e-mail: balizfarm@mail.ru.
Shurygina Lyudmila Vasil'evna - Candidate of Biological Science, Senior Researcher, Head of Department of Biologically Active Substances, OOO «Baliz Farm», Mir St., 4/1, pos. Pashkovsky, Krasnodar, 350910, e-mail: balizfarm@mail.ru.
Ageeva Natal'ya Michaylovna - Doctor of Technical Science, Professor, Head of Laboratory, North Caucasian Zone Scientific Research Institute of Horticulfure and Viticulture, 40 Let Pobeda St., 39, Krasnodar, 350901, email: ageyeva@inbox.ru.
Gaponenko Yuriy Vasil'evich - Candidate of Technical Science, Researcher, North Caucasian Zone Scientific Research Institute of Horticulfure and Viticulture, 40 Let Pobeda St., 39, Krasnodar, 350901, e-mail: yg78@list.ru.
Исследовано влияние экстракта красного вина на глутаматную нейротоксичность. Установлено, что экстракт красного вина повышает устойчивость культивируемых нейронов к токсическому действию глутамата. Поскольку у исследованного экстракта обнаружена антиоксидантная активность, полученный результат по крайней мере частично может быть объяснен антиоксидантным действием веществ, содержащихся в вине.
Ключевые слова: красное вино, глутамат, нейроны, нейропротекция, антиоксидант.
Influence of extract of red wine on a glutamate neurotoxicity is investigated. It is established that extract of red wine increases fastness of cultivated neurones to toxic action of a glutamate. As antioxidatic activity is found in the studied extract, on the received result, at least can be partially explained by antioxidatic action of the substances containing in wine.
Keywords: red wine, glutamate, neurones, neuropatronage, antioxidant.
Давно известно, что употребление красного вина в количествах, исключающих неприятные последствия, оказывает положительное влияние на здоровье человека. Виноградные вина рекомендуются при упадке сил, малокровии, ослабленным и истощённым больным в стадии выздоровления после тяжёлых болезней, ранений или операций, а также для снятия стрессовых ситуаций. Многогранное действие вина на человеческий организм определяется его сложным химическим составом. Красное вино содержит комплекс биологически активных веществ, этанол и сахар, полисахариды, кислоты, фенолы.
Фенольные соединения, или полифенолы - многочисленная и сложная группа соединений, имеющих особое значение для свойств и качества красного вина (их концентрация в белом вине намного ниже). Фенольные соединения вина делятся на 2 основные группы: флавоноиды и нефлавоноиды. Наиболее распространёнными флавоноидами в вине являются флавоно-лы, катехины (флаван-3-олы), а в красном вине - анто-цианины. Соединения нефлавоноидной природы представлены бензойной кислотой, бензальдегидом, коричной кислотой, коричным альдегидом, тирозолом [1].
Изучение роли фенольных соединений в свойствах многих лекарственных растений показало их способность влиять на многие процессы, протекающие в организме [2-4]. Полезные свойства красного вина обусловлены содержащимися в нём полифенолами с ан-тиоксидантным действием, например, флавоноидами. Поскольку развитие многих патологических процессов в организме связано с гиперпродукцией свободных радикалов, то именно способность нейтрализовать эти активные кислородные метаболиты играет крайне важную роль в процессе лечения. Для феноль-ных соединений установлена способность нейтрализовать радикалы кислорода [5, 6].
Качество красного вина в значительной степени обусловлено количественным и качественным составом флавоноидов. Поэтому очевидно, что важную роль играет технология производства вина, влияющая не только на фенольный состав вина, но и на содержание в нём сахаров. Как показали исследования, повышенный уровень сахара в вине может свести на нет многие его положительные свойства [7]. В исследованиях, проведённых на крысах, показано, что применение флаво-ноидов, входящих в состав красного вина, предотвращает накопление липофусцина в нейронах животных, получавших алкоголь [8], что свидетельствует об анти-оксидантном действии флавоноидов красного вина. Данные статистики показывают, что красное вино в малых дозах обладает большим протективным эффектом в отношении ишемического инсульта в сравнении с другими винами, ликерами [9].
В настоящее время основными заболеваниями, приносящими вред здоровью человека, приводя к снижению трудоспособности, смерти или недееспособности, наряду с сердечно-сосудистыми являются церебровас-
кулярные. В то же время за прошедшее десятилетие значительно увеличился интерес к лекарственным средствам, применяющимся в традиционной народной медицине для лечения патологий мозга, поскольку оказалось, что они могут быть не только эффективными, но и не оказывать побочных действий.
Известно, что гибель нейронов при таких патологических состояниях, как ишемия, гипоксия, связана с накоплением в синаптическом пространстве избытка глутамата. В условиях продолжительной активации глутаматом ММЭА-рецепторов и энергетического дефицита внутриклеточное депо неспособно аккумулировать поступающий в клетку кальций, что приводит к резкому повышению его концентрации в цитоплазме [10]. В этих условиях возрастает активность кальций-зависимых ферментов (протеазы, фосфолипазы), которые начинают разрушать клетку. Ситуация усугубляется и возрастающим количеством свободных радикалов, которые могут непосредственно повреждать липидный слой мембраны и повышать доступность содержащихся в ней ненасыщенных жирных кислот для липолитических ферментов. Все эти процессы приводят к отсроченной гибели нейронов. Необходимо отметить, что, например, при инсульте именно нейроны, находящиеся в зоне так называемой «полутени» и гибнущие в течение первых часов после инсульта, можно спасти, значительно снизив последствия данной патологии [11]. Возрастание свободно-радикального окисления наблюдается при различных видах стресса, что также повреждает нейроны и может приводить к гибели.
В этой связи представляет интерес исследование влияния веществ, содержащихся в вине, на гибель нервных клеток. Ранее нами было установлено защитное действие различных препаратов, обладающих ан-тиоксидантными свойствами, при глутаматной нейро-токсичности [12, 13].
Цель данного исследования - определение влияния экстракта красного вина Саперави МЯ на культивируемые нервные клетки, подвергнутые воздействию глута-мата. Выбор Саперави в качестве источника феноль-ных соединений неслучаен: этот сорт винограда в Краснодарском крае обладает наибольшим технологическим запасом фенольных соединений (405 г/дм3) в зависимости от технологии производства вина.
Материалы и методы
Экстракт Саперави был получен из красного сухого столового вина Саперави МЯ 2010 путём отгонки спирта, упаривания до 50 % первоначального объёма под вакуумом в ротационном испарителе с лиофиль-ной сушкой. В последующих экспериментах использовали водные растворы полученного экстракта.
Антиоксидантные свойства экстракта Саперави изучали с использованием модельных систем, генерирующих свободные радикалы: система «цитрат-фос-
фат-люминол» (ЦФЛ) и липопротеинов желтка яиц (ЖЛП). Система ЦФЛ состоит из цитрата натрия (4 мМ), фосфатного буфера (105 мМ КС1, 20 мМ КН2РО4, рН 7,45), люминола (10 мМ). Окисление ионов железа в присутствии ортофосфата и цитрата сопровождается образованием радикалов, при этом возникает хемилюминесценция (ХЛ), которая подавляется в присутствии антиоксидантов и избирательно усиливается люминолом [14]. Система ЖЛП - желток куриного яйца, разведённый фосфатным буфером. Суспензия ЖЛП как модельная система отличается от других липидосодержащих систем доступностью получения, высокой стабильностью и относительно хорошей окисляемостью [15]. Радикалообразование инициировали введением при постоянном перемешивании 1 мл 35 мМ раствора сернокислого железа (FeSО4x7H2О) в 19 мл среды. Концентрация экстракта Саперави МЯ в пробе - 0,01 % (0,1 мг/мл).
Регистрацию ХЛ осуществляли прибором ХЛ-003 в течение 5 мин для ЦФЛ и 10 мин для ЖЛП. Оценивали светосумму ХЛ. Результаты экспериментов определяли по интенсивности ХЛ, у.е., и рассчитывали снижение ХЛ в процентах от контроля (ХЛ модельной системы без препарата), принятого за 100 %.
Влияние экстракта красного вина Саперави МЯ на глутаматную цитотоксичность изучали в культуре нейронов мозжечка. Культуры получали из мозга 7-9-дневных крысят методом ферментно-механической диссоциации [16]. После 8 дней культивирования культуры клеток подвергали действию глутамата и/или экстракта Саперави МЯ. Воздействие глутама-том осуществляли в сбалансированном солевом растворе (ССР) следующего состава, мМ: №2НР04 -0,35; СаСЬ - 2,3; №С1 - 136,7; КС1 - 5,6; МаНСОз -12; глюкоза - 11 (рН 7,5). Длительность воздействия -20 мин, контрольные культуры помещались на 10 мин в ССР без глутамата. Экстракт вносили в культуры нейронов после возвращения их в исходную питательную среду из ССР в концентрациях от 5 до 60 мкг/мл. Затем культуры помещали в СО2-инкубатор на 4 ч и фиксировали. Морфологический анализ культур проводили в фазовом контрасте на инвертированном микроскопе InveI"toscopes ГО 03 для оценки количества живых и погибших нейронов. Количество живых нейронов выражали в процентах от их общего количества.
Статистическую обработку данных проводили с использованием ^критерия Стьюдента.
Результаты и обсуждение
Роль свободных радикалов в патогенезе стрессовых расстройств, ишемических, травматических и дегенеративных поражений нервной системы установлена давно. Головной мозг особенно чувствителен к активации свободнорадикального окисления, поскольку обладает более высоким уровнем потребления кислорода и содержит большее количество липи-дов в сравнении с другими органами [17]. Введение в организм лекарственных препаратов может привести к серьёзным изменениям свободнорадикального окисления и антиоксидантного статуса в ЦНС, что делает
необходимым детальное изучение антиоксидантных свойств применяющихся препаратов.
Как показали наши исследования, экстракт вина Саперави обладает антиоксидантной активностью, что проявляется в снижении интенсивности ХЛ в модельных системах, генерирующих свободные радикалы. Гашение ХЛ в системе ЦФЛ составило 68,43 %, в системе ЖЛП - 86,36. Эти результаты свидетельствуют о том, что содержащиеся в экстракте Саперави соединения обладают антиоксидантной активностью и способны перехватывать активные формы кислорода (система ЦФЛ), а также ингибировать образование липопероксильных радикалов, о чём свидетельствует снижение интенсивности ХЛ в модельной системе ЖЛП.
Воздействие глутамата на нейроны мозжечка привело к сокращению доли живых клеток в среднем до 22 %. Применение экстракта Саперави значительно повышало выживаемость нейронов. Так, при дозах 5, 10 и 30 мкг/мл количество неповреждённых нейронов составляло 38,6, 41,5 и 37,1 % соответственно (рисунок).
* * щ щ *
—=F—1 щ —
Глутамат Глутамат; Глутамат; Глутамат; Глутамат, Саперави Саперави Саперави Саперави 5 мкг/мл 10 мкг/мл 20 мкг/мл 30 мкг/мл
Влияние экстракта красного вина Саперави МЯ 2010 на глу-таматную нейротоксичность в культуре нейронов мозжечка крыс; * - р<0,001
Доза 20 мкг/мл была наиболее эффективной: доля живых нейронов в данном случае составила 47,4 %. Применение более высокой дозы (60 мкг/мл) не повышало выживаемость нейронов после применения глу-тамата. В отсутствие глутамата экстракт Саперави не влиял на количество живых клеток в культурах нейронов мозжечка крыс. Доля живых нейронов в контрольных культурах и культурах с экстрактом Саперави составляла более 95 %.
Полученные результаты могут быть объяснены наличием у биологически активных веществ, содержащихся в вине, антиоксидантных свойств. В литературе имеются данные о протекторном действии различных антиоксидантов при воздействии глутамата на нервные клетки. Поэтому вполне логично предположить, что по крайней мере частично наблюдаемое нами защитное действие экстракта вина Саперави МЯ 2010 обусловлено антиоксидантными свойствами его компонентов.
В настоящее время проведен ряд исследований, показывающих, с одной стороны, каким образом употребление красного вина может оказывать положительное влияние на здоровье человека и на мозг, в
частности, а с другой - роль технологии изготовления вин. Проведение глубоких исследований влияния соединений, присутствующих в вине и винограде, представляет большой интерес с точки зрения их возможного применения в лекарственных целях при патологиях мозга, поскольку полученные на данный момент результаты свидетельствуют о перспективности этого направления. Учитывая общеизвестное положительное действие вина на сердечно-сосудистую систему (достаточно вспомнить так называемый «французский парадокс») и тесную взаимосвязь ряда патологических процессов мозга с нарушениями функционального состояния сосудов, установление положительного влияния соединений вина и винограда на восстановление мозга после стрессов и болезней, возможно, позволило бы оказывать эффективное комплексное терапевтическое воздействие при ряде церебральных патологий.
Считаем необходимым отметить, что, на наш взгляд, использовать алкогольные напитки, в том числе и вино, с целью профилактики таких патологий, как инсульт, нецелесообразно. Согласно данным статистики [9], систематическое употребление алкоголя в 3 раза повышает риск развития кровоизлияний в мозг (геморрагический инсульт) и более чем в 2 раза ише-мического инсульта. Некоторый протекторный эффект был отмечен лишь в отношении ишемического инсульта и только при употреблении малых доз алкоголя. Наибольшее защитное действие отмечено для красного вина, видимо, в данном случае положительное влияние биологически активных соединений, имеющихся в вине, перекрывает отрицательный эффект этанола. Поэтому речь можно вести об использовании именно биологически активных соединений, имеющихся в вине.
Таким образом, нами установлено защитное действие экстракта красного вина Саперави NR 2010 на нейроны мозжечка при токсическом воздействии глу-тамата. Наше исследование наряду с результатами, полученными другими авторами [7], свидетельствует о наличии у экстракта красного вина нейропротектор-ных свойств.
Литература
1. Soleas G.J., Diamandis E.P., Goldberg D.M. Wine as a Biological Fluid: History, Production, and Role in Disease Prevention // J. of Clinical Laboratory Analysis. 1997. Vol. 11. P. 287-313.
2. Барабой В.А. Растительные фенолы и здоровье человека. М., 1984. 160 с.
3. Высочина Г.И. Об агликонах флавоноидных соединений некоторых евроазиатских видов рода Polygonum L.
Поступила в редакцию_
// Актуальные вопросы ботанического ресурсоведения в Сибири. Новосибирск, 1976. С. 180-189.
4. Минаёва Г.В. Флавоноиды в онтогенезе растений и их практическое использование. Новосибирск, 1978. 252 с.
5. Kaur Ch., Kapoor H.C. Antioxidant activity and total phenolic content of some Asian vegetables // Intern. J. Food. Sci. and Techn. 2002. Vol. 37, № 2. P. 153-161.
6. Rice-Evans C.A., Miller N.J. Antioxidant activities of flavonoids as bioactive components of food // Biochem. Soc. Trans. 1996. Vol. 24, № 3. P. 790-795.
7. Carneiro A., Assuncao M., De Freitas V., Paula-Barbosa M.M., Andrade J.P. Red Wine, but not Port Wine, Protects Rat Hippocampal Dentate Gyrus Against Ethanol-Induced Neuronal Damage-Relevance of the Sugar Content // Alcohol & Alcoholism. 2008. Vol. 43, № 4. P. 408-415.
8. De Freitas V., da Silva Porto P., Assungao M., Cadete-Leite A., Andrade J.P., Paula-Barbosa MM. Flavonoids from grape seeds prevent increased alcohol-induced neuronal lipofuscin formation // Alcohol and Alcoholism. 2004. Vol. 39, № 4. Р. 303-311.
9. Виленский Б.С. Современная тактика борьбы с инсультом. СПб., 2005. 288 с.
10. Большаков А.П. Глутаматная нейротоксичность: нарушение ионного гомеостаза, дисфункция митохондрий, изменение активности клеточных систем // Нейрохи-мия. 2008. Т. 25, № 3. С. 157-169.
11. Мозг. Теоретические и клинические аспекты / под ред.
B.И. Покровского. М., 2003. 536 c.
12. Шурыгин А.Я., Кравцов А.А., Батсурен Д., Тунсаг Ж., Скороход Н.С., Удодова Е.И., Мирошниченко Е.В., Асеева Т.А., Петров Е.В., Николаев С.М. Сравнительное изучение защитного действия экстракта корней Astragalus mongolicus Bunge и Astragalus membranceus (Fischer) Bunge на зернистые нейроны мозжечка крыс в условиях глутаматной токсичности // Наука Кубани. 2009. № 3. С. 46-49.
13. Шурыгин А.Я., Скороход Н.С., Злищева Э.И., Андросова Т.В., Кравцов А.А., Немчинова Е.А., Абрамова Н.О. Влияние полипептидной фракции СК, выделенной из кумыса, на нейритный рост и глутаматную цитотоксич-ность в культуре нервной ткани // Наука Кубани. 2010. № 3. С. 32-35.
14. Фархутдинов Р.Р., Лиховских В.А. Хемилюминесцент-ные методы исследования свободнорадикального окисления в биологии и медицине. Уфа, 1995. 90 с.
15. Клебанов Г.И., Бабенкова И.В., Теселкин Ю.О. Оценка антиокислительных свойств плазмы крови с применением желточных липопротеидов // Лаб. дело. 1988. № 3.
C. 59-62.
16. Кравцов А.А., Шурыгин А.Я., Абрамова Н.О., Скороход Н.С., Удодова Е.И., Андросова Т.В., Шурыгина Л.В. Влияние хронической свинцовой интоксикации на ра-дикалообразование в мозге и глутаматную нейроток-сичность в культуре нейронов мозжечка // Изв. вузов. Сев.-Кавк. регион. Естеств. науки. 2009. № 5. С. 97-99.
17. Зозуля Ю.А., Барабой В.А., Сутковой Д.А. Свободнора-дикальное окисление и антиоксидантная защита при патологии головного мозга. М., 2000. 344 с.
20 августа 2012 г.
