CC BY
51
УДК 612.8
ИЗУЧЕНИЕ АНТИОКСИДАНТНЫХ И НЕЙРОПРОТЕКТОРНЫХ СВОЙСТВ ЛИТИЕВОЙ СОЛИ КОМЕНОВОЙ КИСЛОТЫ
© 2012 г. А.Я. Шурыгин1, А.А. Кравцов1, Е.А. Немчинова2, Н.С. Скороход2, Н.О. Абрамова2, Л.В. Шурыгина1,
Э.И. Злищева1, Т.В. Андросова1
Кубанский государственный университет, ул. Ставропольская, 149, г. Краснодар, 355040, rector@kubsu. гы
2ООО «Бализ Фарм», ул. Мира, 4/1, г. Краснодар, 350910, baliz@kыbsы.гы
Kuban State University, Stavropolskaya St., 149, Krasnodar, 355040, rector@kubsu. ru
2OOO «Baliz Farm», Mir St., 4/1, Krasnodar, 350910, [email protected]
Исследовано влияние комената лития на образование свободных радикалов в модельной системе и на выживаемость культивируемых нейронов мозжечка после токсического воздействия глутамата. Установлено, что коменат лития обладает антиоксидантным и нейро-протекторным действием, коменовая кислота — значительно менее выраженным защитным действием на нейроны. Выбранный в качестве препарата сравнения хлорид лития антиоксидантного и нейропротекторного действия не оказывает.
Ключевые слова: нейропротекция, коменат лития, антиоксидант, свободные радикалы, глутаматная нейротоксич-ность.
Influence of lithium comenate on generation of free radicals in model system and on survival of cultivated cerebellar neurons after toxic influence of a glutamate is investigated. It is established that lithium comenate possesses antioxidatic and neuroprotective, action in a dose dependent manner. Comenic acid possesses considerably less expressed protective action on neurons. Chosen as a preparation of comparison LiCl antioxidative and protective action doesn't render.
Keywords: neuroprotection, lithium comenate, antioxidant, free radical, glutamate neurotoxicity.
Негативное влияние окружающей среды на человеческий организм (экзогенные, эндогенные интоксикации, техногенные загрязнения и ионизирующее излучение, а также чрезмерная физическая нагрузка, стресс, переутомление) сопровождается увеличением образования свободных радикалов (СР), инициирующих повреждение клеток и ведущих к образованию различных патологий.
Действие СР связано с их влиянием на структуру и функции биологических мембран. Особенно чувствителен к гиперпродукции СР и окислительному стрессу головной мозг, где наблюдается высокая интенсивность обменных процессов, отсутствие избыточных запасов энергии, высокое содержание субстратов пере-кисного окисления и катализаторов реакции липидного переокисления [1]. В последние годы окислительный стресс считается одним из значимых факторов патогенеза нейродегенеративных заболеваний. Главную роль он играет в патологических механизмах ишемии мозга. Антиоксидантная защита организма при окислитель-
ном стрессе не способна полностью нейтрализовать избыток активных форм кислорода. В этих условиях применяются антиоксидантные препараты для защиты мозга от повреждения.
Известно использование препаратов лития (хлорида лития, углекислого лития, лития оксибутирата) в качестве лекарственных средств при различных заболеваниях центральной нервной системы (ЦНС) с тяжёлыми нейродегенеративными проявлениями - эпилепсией, ишемией мозга, рассеянным склерозом [2]. Нами ранее было проведено исследование нейропротекторных свойств коменовой кислоты при токсическом воздействии глутамата на нейроны мозга в культуре. Результаты были положительными. В связи с этим представлялось важным исследовать литиевую соль коменовой кислоты, что и явилось целью данной работы.
Мы исходили также из того, что коменовая кислота обладает антиоксидантным свойством и выраженным ростостимулирующим эффектом на культуры нейронов мозга пренатально стрессированных животных [3].
Методы исследования
При изучении комената лития (монолитиевая соль коменовой кислоты) в качестве препарата сравнения выбрали хлорид лития. Антиоксидантные свойства комената лития изучали с использованием модельной системы, генерирующей СР, - систему цитрат-фосфат-люминол (ЦФЛ) следующего состава: 4 мл фосфатного буфера (105 мМ КО, 20 мМ КН2РО4, 4 мМ цитрата натрия; pH 7,45) с добавлением люминола (10 мМ). Образование СР инициировали введением при постоянном перемешивании 30 мкл 35 мМ раствора сульфата железа (II). В данной модели окисление ионов железа в присутствии ортофосфата и цитрата сопровождается образованием СР, и при этом возникает хемилюминесценция (ХЛ), избирательно усиливающаяся люминолом, но уменьшающаяся в присутствии антиоксидантов. Регистрацию ХЛ осуществляли прибором SmartLum 5773 в течение 5 мин. Оценивали светосумму ХЛ. Результаты экспериментов определяли по интенсивности ХЛ, у.е., и рассчитывали ее снижение в процентах от контроля (ХЛ модельной системы без препаратов), принятого за 100 %. Обработку полученных данных осуществляли с помощью программного обеспечения PowerGraph 3.3.
Антиокислительную активность литиевой соли коменовой кислоты оценивали по угнетению ХЛ модельной системы при добавлении водных растворов препарата в сравнении с раствором коменовой кислоты и хлоридом лития. Конечная концентрация вещества в кювете составляла 0,1 и 0,01 мг/мл [4].
Влияние комената лития на глутаматную цитоток-сичность в культуре нейронов мозжечка крысят изучали в сравнении с хлоридом лития. Коменовая кислота исследована нами ранее [5].
Культуры зернистых клеток мозжечка получали из мозга 7-9-дневных крысят методом ферментно-механической диссоциации [6]. Их после 7 дней культивирования подвергали действию глутамата и/или монолитиевой соли коменовой кислоты либо хлорида лития. Воздействие глутаматом осуществляли в сбалансированном солевом растворе (ССР) следующего состава, мМ: Na2HPO4 - 0,35; Caa2 - 2,3; №а -136,7; т - 5,6; NaHCOз - 11,9; глюкоза - 11,1 (рН 7,5). Длительность воздействия - 10 мин, контрольные культуры помещались на 10 мин в ССР без глутамата. Коменат и хлорид лития вносили в культуры нейронов после возвращения их в исходную питательную среду из ССР в концентрациях 10-3, 10-4 и 10-5 М. Культуры помещали в СО2-инкубатор на 4 ч, затем фиксировали. Морфологический анализ культур проводили в фазо-
вом контрасте на инвертированном микроскопе Invertoscopes ГО 03 для оценки количества живых и погибших нейронов. Количество живых нейронов выражали в процентах от их общего количества.
Статистическую обработку данных проводили с использованием ^критерия Стьюдента.
Результаты исследования
Результаты исследования антиоксидантных свойств препаратов представлены в табл. 1.
Таблица 1
Уровень снижения СР в модельной системе ЦФЛ в присутствии коменовой кислоты и её литиевой соли, % от контроля
Препарат Концентрация вещества, мг/мл
0,01 0,1
Коменат лития 36,91±1,00* 66,67±1,20*
Коменовая кислота 33,29±1,36* 69,39±1,16*
Хлорид лития 0,42±1,75 6,32±1,92
* - p<0,001 в сравнении с контролем.
Анализ данных, представленных в табл. 1, показывает, что литиевая соль коменовой кислоты значительно снижает содержание СР в сравнении с контролем в модельной системе ЦФЛ, причем уровень снижения практически не отличается от уровня гашения СР коменовой кислотой. При этом антиокислительные свойства литиевой соли коменовой кислоты, так же как и коменовой кислоты, зависят от концентрации вещества. Так, увеличение концентрации как ко-меновой кислоты, так и литиевой соли коменовой кислоты в испытуемом растворе с 0,01 до 0,1 мг/мл способствует повышению (на 36 и 30 %) уровня гашения СР. Применение хлорида лития в этих же концентрациях влияния на уровень СР не оказывает.
Таким образом, литиевая соль коменовой кислоты обладает выраженным антиоксидантным действием, при этом её антиокислительные свойства практически не отличаются от коменовой кислоты. Хлорид лития в испытуемых нами концентрациях антиокислительных свойств в модельной системе ЦФЛ не проявил.
Результаты исследований нейропротекторных свойств показали, что число выживших нейронов при воздействии как хлорида лития, так и комената лития, независимо от концентрации вещества, практически не отличалось от контроля (табл. 2, ССР без глутамата).
Таблица 2
Влияние хлорида лития, комената лития и коменовой кислоты на выживаемость нейронов после токсического действия глутамата
Вещество Выживаемость нейронов, %
ССР без глутамата ССР с глутаматом
Контроль Концентрация вещества Глутамат Концентрация вещества
10-3 М 10-4 М 10-5 М 10-3 М 10-4 М 10-5 М
Хлорид лития 84,3±0,87 83,62±4,35 79,97±2,06 82,90±2,74 26,69±0,93* 27,12±3,21* 28,66±2,53* 20,61±5,26*
Коменат лития 80,69±2,60 84,80±1,78 86,36±1,04 56,06±2,61* # 67,50±3,92* # 61,09±3,64* #
Примечание. Достоверность отличий: * - p<0,001 в сравнении с контролем; # - p<0,001 в сравнении с глутаматом.
После воздействия глутамата выживаемость нейронов мозжечка значительно снижалась (табл. 2, ССР с глутаматом). Практически на этом же уровне оставалась выживаемость нейронов и при добавлении на фоне глутамата хлорида лития во всех исследуемых нами концентрациях. В то же время применение ко-мената лития способствовало четкому и достоверному сокращению гибели нейронов после воздействия глутамата. Так, если в группе культур «глутамат» выживаемость нейронов составляла немногим более 25 %, то во всех группах культур с добавлением комената лития на фоне глутамата выживаемость нейронов была в 2 и более раза выше (p<0,001). При этом максимальная выживаемость нейронов - в группе культур при воздействии комената лития в концентрации 10-4 М.
Таким образом, применение комената лития в условиях глутаматной цитотоксичности способствует достоверному сокращению гибели нейронов мозжечка в культуре. Вероятно, одно из объяснений этого факта заключается в том, что коменат лития обладает, как это нами установлено, антиоксидантными свойствами. Хлорид лития не оказывает влияния на устойчивость нейронов мозжечка к глутаматной цитоток-сичности.
Необходимо отметить, что защитный эффект коме-новой кислоты, изученный нами ранее, существенно ниже, чем у комената лития, и составляет около 20 % при концентрации 10-3 М и около 10 при концентрации 10-4 М [5]. В литературе имеются данные о том, что хлорид лития проявляет антиоксидантные свойства в экспериментах in vivo, но не предотвращает окислительное повреждение, вызванное хроническим стрессом [7]. Обнаружено защитное действие хлорида лития при глутаматной токсичности в культуре нейронов мозжечка. Однако нейропротекторное действие этого препарата проявлялось только при предварительной инкубации культур с 1,310-3 М LiCl в тече-
Поступила в редакцию_
ние 6-7 дней [8]. Наши данные показывают преимущество комената лития в сравнении с коменовой кислотой и в ещё большей степени с хлоридом лития и являются важным свидетельством в пользу перспективности препаратов на основе этого вещества, а также создают возможность для проведения дальнейших фармакологических исследований по защите мозга при окислительном стрессе.
Литература
1. Попова М.С., Степаничев М.Ю. Индукция клеточного
цикла, амилоид-бетта и свободные радикалы в механизмах развития нейродегенеративных процессов в мозге // Нейрохимия. 2008. Т. 25, № 3. С. 170-178.
2. Авруцкий Г.Я., Недува А.А. Лечение психиатрических
больных: руководство для врачей. М., 1988. 528 с.
3. Шурыгин А.Я. Препарат бализ. Краснодар, 2002. 416 с.
4. Фархутдинов Р.Р., Лиховских В.А. Хемилюминесцент-ные методы исследования свободнорадикального окисления в биологии и медицине. Уфа, 1995. 90 с.
5. Influence of comenic acid on cultured granule cells of cerebel-
lum under glutamate neurotoxicity / A.Y. Shurygin [et al.] // Traditional medicine: A current situation and perspectives of development: мaterials of the III international scientific conference. August, 18-22. Ulan-Ude, 2008. P. 73.
6. Влияние хронической свинцовой интоксикации на ради-
калообразование в мозге и глутаматную нейротоксич-ность в культуре нейронов мозжечка / А.А. Кравцов [и др.] // Изв. вузов. Сев.-Кавк. регион. Естеств. науки. 2009. № 5. С. 97-99.
7. Chronic lithium treatment has antioxidant properties but
does not prevent oxidative damage induced by chronic variate stress / A.P. Vasconcellos [et al.] // Neurochem Res. 2006. Vol. 31, № 9. P. 1141-1151.
8. Nonaka Sh., Hough Chr.J., Chuang D.-M. Chronic lithium
treatment robustly protect neurons in the central nervous system against excitotoxicity by inhibiting N-methyl-d-aspartate receptor-mediated calcium influx // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. Vol. 95. P. 2642-2647.
16 сентября 2011 г.
