CC BY
51
УДК 591.181:599.323.4
ВЛИЯНИЕ ХРОНИЧЕСКОЙ СВИНЦОВОЙ ИНТОКСИКАЦИИ НА РАДИКАЛООБРАЗОВАНИЕ В МОЗГЕ И ГЛУТАМАТНУЮ НЕЙРОТОКСИЧНОСТЬ В КУЛЬТУРЕ НЕЙРОНОВ МОЗЖЕЧКА
© 2009 г. А.А. Кравцов1, А.Я. Шурыгин1, Н.О. Абрамова2, Н.С. Скороход2, Е.И. Удодова2, Т.В. Андросова1,
Л.В. Шурыгина1
1Кубанский государственный университет, 1Kuban State University,
ул. Ставропольская, д. 149, г. Краснодар, 350040, Stavropolskaya St., 149, Krasnodar, 350040,
rector@kubsu.ru rector@kubsu.ru
2ООО «БализФарм», 2OOO «Baliz Farm»,
ул. Мира 4б, пос. Пашковский, г. Краснодар, 350910 Mir St., 4b, Pashkovsky, Kracnodar, 350910,
baliz@kubsu.ru baliz@kubsu.ru
Исследовано влияние хронической свинцовой интоксикации в пренатальный и ранний послеродовой период в дозе 6 мг/кг массы тела крысы на радикалообразование в головном мозге потомства и уровень глутаматной нейротоксичности в культуре нейронов мозжечка. Установлено, что хроническая свинцовая интоксикация крыс в период беременности и вскармливания вызывает повышение уровня свободных радикалов в головном мозге потомства, а также усиливает токсическое действие глутамата на культивируемые нейроны мозжечка.
Ключевые слова: ацетат свинца, свободные радикалы, глутамат, нейротоксичность, нейроны мозжечка.
Influence of a chronic lead intoxication in prenatal and the early postnatal period in a dose of weight of a body of a rat of 6 mg/kg on free radical generation in a brain of posterity and level of glutamate neurotoxicity in cerebellar neurons culture is investigated. It is established, that the chronic lead intoxication of rats in pregnancy and feeding causes increase of level of free radicals in a posterity brain, and also strengthens toxic action ofglutamate on cultivated neurons of the cerebellum.
Keywords: lead acetate, free radicals, glutamate, neurotoxicity, cerebellar neurons.
Пренатальное и послеродовое действие свинца влияет на высшие функции ЦНС, затормаживает развитие мозга, искажает поведенческие реакции [1, 2]. При этом вредному влиянию свинца особенно подвержен развивающийся мозг [1, 3, 4]. Особую опасность представляют малые дозы свинца при длительном действии [5]. Свинец, являющийся прооксидан-том, проявляет токсическое действие путём активации свободнорадикального окисления в тканях мозга, что оказывает мембранотоксический эффект [6-8].
Известно, что глутамат - основной возбуждающий нейротрансмиттер головного мозга [9], однако при некоторых патологиях (ишемия мозга, гипогликемия, гипоксия) возрастающие внеклеточные концентрации глутамата вызывают повреждение и отсроченную гибель нейронов в различных отделах мозга [10]. Исследованиями многих авторов установлено, что токсическое действие глутамата связано с перегрузкой нейронов кальцием, способствующей активации ряда кальцийзависимых ферментов и появлению свободных радикалов, вызывающих повреждение мембранных структур и нарушающих клеточный метаболизм [10, 11].
Приведенные данные свидетельствуют об актуальности и необходимости проведения экспериментальных исследований отдаленных последствий токсического действия малых доз свинца на мозг в период эмбриогенеза. В связи с вышеизложенным в задачу наших исследований входило изучение влияния хронической интоксикации ацетатом свинца в пренаталь-ный и ранний послеродовой период на содержание
свободных радикалов в головном мозге и уровень глутаматной нейротоксичности в культуре нейронов мозжечка крысят.
Методика исследования
Исследования выполнены на 7, 9-дневных крысятах линии Wistar. Самки разделены на 2 группы: интакт-ные и подвергнутые воздействию свинца. Самки 2-й группы получали ацетат свинца из расчета 6 мг/кг массы тела в течение всей беременности и в послеродовой период (7-9 дней после родов, т.е. до момента изъятия ткани для определения уровня свободных радикалов или получения культур нейронов мозжечка).
Для исследования влияния хронической свинцовой интоксикации на радикалообразование в мозге крысят использовали хемилюминесцентный метод [12]. Его суть в том, что, чем больше в изучаемом образце свободных радикалов, тем выше уровень светимости, который регистрирует прибор хемилюмино-мер. Исследования проводили с образцами ткани мозга интакных животных и подвергшихся свинцовой интоксикации. Регистрацию свечения осуществили на приборе SMARTLUM 5773 с использованием программного обеспечения PowerGraph 3.3. Интенсивность свечения оценивали по светосумме, определяемой как площадь под кривой, у. е.
Глутаматную нейротоксичность определяли на 7, 8-дневных культурах зернистых клеток мозжечка, полученных от 7, 9-дневных крысят методом фер-ментно-механической диссоциации [13]. Под эфир-
ным наркозом у крысят извлекали мозг и выделяли мозжечок, который затем переносили в камеру Максимова, заполненную сбалансированным солевым раствором PBS, содержащем, г/л: KH2PO4 - 0,144; NaCl - 9; Na2HPO4-12H2O - 1,062; рН 7,2. Промывали этим же раствором несколько раз и измельчали. Затем переносили в PBS, содержащий 0,25 % трипсина (Sigma, США) и 0,04 % EDTA (Sigma, США) и оставляли на 20 мин при 35 °С. После инкубации ткань промывали тремя сменами PBS и один раз средой для культивирования, которая содержала 90 % минимальной среды Игла, 10 % эмбриональной телячьей сыворотки (ПанЭко, Россия), 0,8 % глюкозы, 2 мМ глута-мина, 0,5 МЕ/мл инсулина, 10 мМ HEPES, 22 мМ NaHCO3. Затем ткань подвергали механической диссоциации с помощью пастеровских пипеток в среде культивирования. Суспензию клеток центрифугировали 1,5 мин при 1500 об/мин, удаляли надосадок и ресуспендировали в свежей среде для культивирования. Суспензию клеток по 150 мкл наносили на покровные стёкла (24x24 мм), предварительно покрытые полиэтиленимином и помещённые в пластиковые чашки Петри (35 мм), и оставляли на 40 мин в СО2-инкубаторе для прикрепления клеток к субстрату. Затем в чашки добавляли по 1 мл питательной среды. Концентрацию K+ через 24 ч культивирования повышали до 25 мМ, что оказывает трофическое действие на клетки-зёрна мозжечка [14].
Спустя 7-8 дней культивирования нейроны мозжечка от самок интактных и получавших ацетат свинца подвергали 10-минутному воздействию 100 мкМ глутамата в инкубационном солевом растворе, содержащем, г/л: Na2HPO4-12H2O - 0,1263; CaCl2 -0,2568; NaCl - 8; KCl - 0,42; NaHCO3 - 1; глюкоза - 2 (рН 7,5). Через 4-5 ч культуры фиксировали ФУСом (формалин 20 %, ледяная уксусная кислота 10 %, спирт 70 %) и помещали в 70%-й спирт. После чего для каждой культуры в 9 полях зрения подсчитывали число живых и погибших нейронов на инвертированном микроскопе Invertoscopes ID 03.
Статистический анализ результатов проводили в редакторе Microsoft Office Excel 2003 c использованием t-критерия Стьюдента.
Результаты исследования
Анализ данных, полученных в ходе исследования содержания свободных радикалов в ткани мозга 7, 9-дневных крысят, показал, что интенсивность свечения в опытах с образцами ткани крысят, получавших ацетат свинца в пренатальный и ранний послеродовой период, значительно превышает интенсивность свечения в опытах с образцами ткани от интактных животных (рис. 1). Так, если для интактных проб свето-сумма составила 144,07±1,88 у. е., то для свинцовых проб - 180,68 ± 2,53 (р < 0,001).
Представленные данные показывают, что в мозге крысят, подвергшихся хронической свинцовой интоксикации в пренатальный и ранний послеродовой период, значительно повышается радикалообразование, что согласуется с результатами наших более ранних экспериментов, показавших, что пренатальная свин-
цовая интоксикация значительно нарушает окислительно-восстановительное равновесие в мозге новорожденных крысят [15].
Рис. 1. Влияние хронической свинцовой интоксикации на интенсивность хемилюминесценции в гомогенатах мозга 7, 9-дневных крысят. * - достоверность отличий в сравнении с контролем р<0,001
Анализ данных, полученных при исследовании влияния хронической свинцовой интоксикации на ней-ротоксичность глутамата, показал, что выживаемость нейронов мозжечка в культурах, полученных от интакт-ных крысят, и в культурах от крысят, подвергнутых хронической свинцовой интоксикации, практически не отличается и составляет 87,35 ± 1,68 и 84,79 ± 1,32 % соответственно (рис. 2).
Рис. 2. Выживаемость нейронов мозжечка в культуре после воздействия глутамата на фоне свинцовой интоксикации. *- достоверность отличий в сравнении с контролем р < 0,001
Через 4 ± 4,5 ч после 10-минутного воздействия 100 мкМ глутамата доля живых нейронов в культуре резко снижается. При этом, если в культуре нейронов мозжечка от интактных животных доля выживших нейронов составила 30,29 ± 1,62 %, то в культуре клеток мозжечка от крысят, подвергнутых свинцовой интоксикации в пренатальный и ранний послеродовой период, этот показатель оказался значительно ниже -7,41 ± 1,50 % (рис. 2).
Таким образом, установлено, что интоксикация крысят ацетатом свинца в пренатальный и ранний послеродовой период не оказывает существенного влияния на выживаемость нейронов мозжечка в культуре. Воздействие же глутамата в концентрации 100 мкМ в течение 10 мин на культуры нейронов мозжечка резко
сокращает число выживших нейронов в культуре как интактных клеток, так и клеток, полученных от крысят, подвергшихся в пренатальный и в ранний послеродовой период интоксикации ацетатом свинца в дозе 6 мг/кг массы самки. При этом выживаемость нейронов мозжечка в культуре на фоне свинцовой интоксикации значительно и достоверно ниже, чем в аналогичной интактной культуре.
Результаты, представленные в данной работе, свидетельствуют о том, что хроническая пренатальная и послеродовая свинцовая интоксикация способствует повышению радикалообразования в развивающемся головном мозге, а также усиливает токсическое воздействие глутамата на культивируемые нейроны мозжечка. На основании полученных данных об активации радикалообразования можно предположить, что одним из механизмов повышения уровня нейротокси-ческого действия глутамата при свинцовой интоксикации, вероятно, является усиление перекисного окисления липидов в нейронах мозжечка.
Работа выполнена при поддержке РФФИ (грант № 08-04-99067).
Литература
1. Влияние введения свинца беременным крысам на го-
ловной мозг их потомства (отдалённые последствия) / Б.Я. Рыжавский [и др.] // Бюл. экспер. биол. и мед. 2000. Т. 129, № 1. С. 28-30.
2. Чухловина М.Л. Свинец и нервная система (обзор) // Гигиена и санитария. 1977. № 5. С. 39-42.
3. Роль загрязнения среды обитания свинцом в задержке
психологического развития детей дошкольного возраста / Л.И. Привалова [и др.] // Вестн. РАМН. 2002. № 11. С. 50-53.
4. Inflammation-like glial response in lead-exposed immature
rat brain / L. Struzyn'ska [et al.] // Toxicological sciences. 2007. Vol. 95, № 1. P. 156-162.
Поступила в редакцию
5. Зербино Д.Д., Соломенчук Т.И., Поспишиль Ю.А. Свинец -
этиологический фактор поражения сосудов: основные доказательства // Архив патологии. 1997. Т. 59, № 1. С. 9-11.
6. Зависимость изменения иммунных и биохимических
механизмов поддержания гомеостаза от материальной куммуляции свинца в организме (экспериментальное исследование) / Ю.И. Кундиев [и др.] // Медицина труда и промышленная экология. 2001. № 5. С. 11-17.
7. Adonaylo V.N., Oteiza P.I. Lead intoxication: antioxidant
defenses and oxidative damage in rat brain // Toxicology. 1999. Vol. 135. P. 77-85.
8. Lead-induced increase in antioxidant enzymes and lipid
peroxidation products in developing rat brain / K.K. Boka-ra [et al.] // Biometals. 2008. Vol. 21. P. 9-16.
9. Механизм регуляции глутаматергической синаптиче-
ской передачи в ЦНС позвоночных / О.В. Голодухин [и др.] // Успехи совр. биол. 1983. Т. 95, № 3. С. 383-397.
10. Pictorial Review of Glutamate Excitotoxicity: Fundamental
Concepts for Neuroimaging / L.P. Mark [et al.] // Am. J. Neuroradiol. 2001. Vol. 22. P. 1813-1824.
11. Perez Velazquez J.L., Frantseva M. V., Carlen P.L. In Vitro
Ischemia Promotes Glutamate-Mediated Free Radical Generation and Intracellular Calcium Accumulation in Hippo-campal Pyramidal Neurons // The J. of Neuroscience. 2001. Vol. 17, № 23. P. 9085-9094.
12. Фархутдинов У.Р., Фархутдинов Р.Р. Особенности хе-
милюминесценции плазмы крови и активность альвеолярных макрофагов при экспериментальной пневмонии // Бюл. экспер. биол. и мед. 2000. Т. 129, № 3. С. 260264.
13. Викторов И.В., Хаспеков Л.Г., Шашкова Н.А. Руково-
дство по культивированию нервной ткани: методы, техника, проблемы. М., 1986. 230 с.
14. NMDA-stimulated expression of BDNF mRNA in cultured
cerebellar granule neurons / M. Favaron [et al.] // Neuroreport. 1993. Vol. 4, № 10. P. 1171-1174.
15. Обменные и ростовые процессы в нервной ткани крысят,
пренатально получавших ацетат свинца / А.Я. Шурыгин [и др.] // Наука Кубани. 2008. № 3. С. 25-30.
9 февраля 2009 г.
