CC BY
57
УДК 577.2:573.6
ДЕТЕКТУВАННЯ ЗБУДНИКА СИБІРКИ ЗА ДОПОМОГОЮ ПОЛІМЕРАЗНОЇ ЛАНЦЮГОВОЇ РЕАКЦІЇ У РЕАЛЬНОМУ ЧАСІ
1ДУ «Інститут мікробіології та імунології ім. І. І. Мечникова НАМН України», Харків 2Національний науковий центр «Інститут експериментальної і клінічної ветеринарної медицини» НААН України, Харків 3Інститут Роберта Коха, Берлін, Німеччина
E-mail: olga.limanskaya@mail.ru
Отримано 20.04.2012
Точна ідентифікація бацил Bacillus anthracis залишається складним завданням при диференціації збудника сибірки від близькоспоріднених видів B. cereus та B. thuringiensis через існування високого ступеня гомології нуклеотидних послідовностей з представниками групи Bacillus cereus sensu lato.
Розроблено молекулярно-генетичні набори праймерів та проб для полімеразної ланцюгової реакції у реальному часі з гібридизаційно-флуоресцентною детекцією для диференціації бацил B. anthracis від B. cereus та B. thuringiensis.
Цільовою мішенню для праймерів та проб визначено фрагмент гена ssp хромосомної ДНК, що характеризується гексануклеотидною інсерцією тільки для ізолятів B. anthracis. Використання проб у форматах TaqMan та молекулярного маяка дало змогу за допомогою полімеразної ланцюгової реакції у реальному часі надійно диференціювати бактерії B. anthracis від близькоспоріднених видів B. cereus та B. thuringiensis. Сигнал флуоресценції для шпилькових проб із форматом молекулярного маяка був позитивний тільки для штамів B. anthracis, а для близькоспоріднених видів B. cereus та B. thuringiensis — негативний. У разі використання лінійних проб TaqMan реєстрували високоін-тенсивний сигнал флуоресценції для всіх ізолятів B. anthracis і сигнал значно нижчої інтенсивності — для B. cereus та B. thuringiensis. Розроблені підходи можуть бути корисними для клінічних, епідеміологічних та епізоотологічних досліджень.
Ключові слова: збудник сибірки, Bacillus anthracis, полімеразна ланцюгова реакція у реальному часі.
Технологія ДНК-діагностики невпинно вдосконалюється — від високовартісної низь-коефективної, з використанням декількох процедур, до недорогої, високоефективної, із застосуванням автоматизованої процедури. До сучасних технологій ПЛР-детекції (ПЛР — полімеразна ланцюгова реакція) та типування патогенів можна віднести ПЛР з використанням проб у різних форматах — лінійних TaqMan, шпилькових молекулярних маяків, скорпіонових праймерів-проб,
LUX праймерів-проб (LUX — light upon extension), Sunrise праймерів-проб, LNA-модифі-кованих праймерів (LNA — locked nucleic acis, або замкнена нуклеїнова кислота) [1-5].
Здійснюючи пошук молекулярно-генетичних маркерів та розробляючи відповідні набори праймерів для детекції та типування патогенів, ми виходимо з того, що раніше створені тест-системи втрачають актуальність через появу нової інформації щодо молекулярної організації патогенів, а також
нових сиквенсів генів та їхніх фрагментів у базах даних. Так, наприклад, у 2006 р. компанією Cepheid (США) було розроблено тест-систему на основі ПЛР у реальному часі (ПЛР-РЧ) з використанням скорпіонової проби для детекції збудника сибірки В. апіНгасів на основі виявлення обох плаз-мід рХО1 та рХО2, що визначають його патогенність, яка залежить від двох факторів — капсули і токсину виразки. Вироблення капсули зумовлено генами сарА, сарВ та сарС, локалізованими на плазміді рХО2. Компоненти токсину кодуються трьома генами: рад, суа і ^, локалізованими на плазміді рХО1 [6, 7].
Донедавна вважали, що наявність обох зазначених плазмід є відмітною особливістю патогенних штамів В. апіНгасів. Проте існують штами близькоспоріднених бактерій В. сегеив та В. іНигіпдіепзів, які містять послідовності більше половини відкритих рамок зчитування плазмід рХО1 та рХО2
О. Ю. Лимaнcъкa1^ 2 Л. О. Муртaзaєвa1 С. Клі3
О. П. Лимaнcъкий1
B. anthracis [8, 9]. А в 2009 р. з’явилось повідомлення [10], що знайдено штами близь-коспорідненого виду B. cereus, які містять обидві плазміди рXO1 та рXO2. Oтже, тільки наявність цих двох плазмід не дозволяє диференціювати штами B. anthracis від інших представників групи B. cereus sensu lato (яка також включає близькоспоріднені бактерії B. thuringiensis, B. cereus, B. mycoides, B. pseudomycoides та B. weihenstephanensis).
B. anthracis, грампозитивна аеробна бактерія, що утворює ендоспори, є етіологічним агентом сибірки, небезпечного, а часом із летальним наслідком, захворювання людини і тварин, що може інфікувати людей шкірним, респіраторним або шлунково-кишковим шляхами [11-15].
У цій роботі на основі аналізу поліморфізму поодиноких нуклеотидів гена ssp хромосомної ДНК близькоспоріднених видів бактерій групи Bacillus cereus sensu lato визначено праймери і проби та проведено диференціацію B. anthracis від близькоспо-ріднених видів В. cereus і B. thuringiensis за допомогою ПЛР-РЧ з пробами у форматах TaqMan та молекулярного маяка.
Матеріали і методи
Множинне вирівнювання та наступний статистичний аналіз проводили на основі комп’ютерного аналізу нуклеотидних послідовностей гена ssp бактерій B. anthracis, B. cereus і B. thuringiensis та їхніх фрагментів за допомогою ліцензійного пакета прикладних програм GeneBee [16], термодинамічний аналіз праймерів, проб та ампліконів — за допомогою програм MeltCalc [17], Exiqon (Exiqon, Данія; http://www.exiqon.com) та Oligo (версія 3.0, США) [18]. Дизайн системи праймерів та проб було виконано за традиційною схемою: множинне вирівнювання (для можливості побудови філогенетичного дерева) ^ філогенетичний аналіз (для контролю надійності класифікації ізолятів видів, що аналізують, ^ множинне вирівнювання (з метою визначення позицій одно-нуклеотидних поліморфізмів та фрагментів з високим ступенем подібності).
Тестування набору праймерів для детек-ції B. anthracis здійснювали із застосуванням зразків ДНК, екстрагованої з ізолятів B. cereus, B. pseudomycoides, B. anthracis, B. thuringiensis, B. weihenstephanensis, B. flu-orescens, B. mycoides, наданих д-ром S. Klee (Інститут Роберта Коха, Берлін, Німеччина). ПЛР-РЧ проводили на термоциклері ABI7500 (Applied Biosystems, США) за
таких температурних і часових параметрів: початкова інкубація для денатурації ДНК-матриці та активації FastStart Taq ДНК-полімерази — 95 ОС, 4 хв; денатурація — 95 ОС, 15 с; відпал — 60 ОС, 60 с; синтез — 72 ОС, 20 с; кількість циклів — 40. Для проведення ПЛР-РЧ використовували універсальний набір реагентів TaqMan Environmental Master mix від фірми Applied Biosystems (США), до складу якого входить референсний барвник ROX (6'-карбокси-Х-родамін). ПЛР-РЧ проводили в об’ємі реакційної суміші 20 мкл, що містила: 4 мкл реакційного буфера TaqMan; 0,8 мкМ кожного праймера; 0,07 мкМ специфічної проби; 5 мкл ДНК.
Для ампліфікації фрагмента гена ssp B. anthracis використовували розроблений набір праймерів Banssp9 — Banssp10 і проб, послідовності та позиції яких наведено нижче:
Banssp9 (98-123) 5'-gcgactgaaacaaatgta-caagcagt-3' ;
Banssp10 (230-203) 5'-cgtctgtttcagttg-caaattctgtacc -3'.
Лінійна проба у форматі TaqMan: (156-180) 5'-FAM-cgcaagcttctggtgctag-cattcaaagc -3'-RTQ1.
Шпилькова проба у форматі молекулярного маяка:
5'-FAM-cggcgcgcaagcttctggtgctagcattca-aagccgccg-3' - RTQ1,
де FAM — флуорофор (флуоресцеїн), а RTQ1 — відповідний йому гасник флуоресценції (з максимумом спектра поглинання за довжини хвилі 515 нм). Для шпилькової проби підкреслено комплементарні фрагменти, які утворюють стебло шпильки, а не позначена послідовність відповідає послідовності мішені, що впізнається. Синтезовані праймери та проби отримано від компанії «Синтол» (Російська Федерація).
Результати та обговорення
Увага до визначення цільових мішеней, зумовлено декількома обставинами. По-перше, дані літератури [19, 20] та наші дискусії з фахівцями в галузі детекції B. anthracis (зокрема з проф. W. Beyer, приватна інформація) свідчать, що, наприклад, ген plcR є нетривіальною мішенню і має достатню дискримінуючу потужність для диференціації B. anthracis від близькоспо-ріднених видів B. cereus та B. thuringiensis [21]. По-друге, спроби відтворити надійну ПЛР-детекцію B. anthracis (що є надзвичайно важливим в умовах сьогодення для захи-
сту населення України, зважаючи на біоте-рористичний потенціал B. anthracis) можуть призвести до хибнонегативних результатів через помилковість наведених у літературі праймерів. Вибірково проведений авторами комп’ютерний аналіз відомих наборів прай-мерів на основі гена plcR показав, що в роботі [20] наведено не послідовності праймерів, а комплементарні фрагменти, у роботі [19] прямим і зворотним праймерами для детекції B. anth racis слугували послідовності праймерів, специфічних до B. cereus та B. thuringiensis (результати не показано).
На основі комп’ютерного аналізу низки генів хромосомної ДНК близькоспоріднених видів B. ünthracis, В. сєгєш, B. thuringiensis, B. wheihenstephanensis нами визначено, що ген ssp характеризується достатньою дис-кримінуючою потужністю, тобто містить точкові мутації, або однонуклеотидні полі-морфізми, що дає змогу встановити молекулярні мішені та позиції, які можуть бути використані як дискримінуючі нуклеотиди для створення наборів праймерів і проб. Множинне вирівнювання нуклеотидних послідовностей повномірного гена ssp (завдовжки 301 п. н. для B. ünthracis та 295 п. н. — для В. œreus і B. thuringiensis), що кодує низькомолекулярний кислоторозчинний протеїн, для ізолятів групи B. cereus sensu lato дозволило виявити таку особливість геномної організації, як наявність гексанук-леотидної вставки, яка є характерною тільки для ізолятів B. anthracis та делетованою для ізолятів B. cereus і B. thuringiensis. Тому цю інсерцію використали як хромосомний маркер для розроблення видоспецифічних проб для детекції B. anthracis, частиною мішені для якої є зазначений гексануклеотид (рис. 1).
Локалізацію розроблених праймерів (прямого Banssp9 та зворотного Banssp10)
і проб стосовно «+»- та «-»-нитки ДНК наведено на рис. 2. Важливою особливістю нук-леотидної послідовності гена ssp є наявність прямого повтору завдовжки 46 п. н., що враховували під час розроблення як даного набору праймерів і проб, так і раніше створеного набору праймерів для детекції збудника сибірки за допомогою стандартної ПЛР з електрофоретичною детекцією [22].
Сучасні технології ПЛР-РЧ передбачають використання різноманітних флуоро-генних гібридизаційних проб (сигнал флуоресценції яких змінюється за гібридизації з мішенню). Відомі типи таких проб можна розподілити на два класи — з двома або з одним флуорофором. Перша група проб
базується на зміні взаємодії між лігандами під час гібридизації з послідовністю мішені, що зумовлює зміну інтенсивності флуоресценції. До цієї групи належать молекулярні маяки — шпилькові структури з локалізованою у петлі послідовністю впізнавання та стеблом, на кінцях якого у просторовій близькості розташовані флуорогенний барвник та нефлуорогенний гасник. У процесі гібридизації з мішенню флуорофор просторово відділяється від гасника, що спричинює значне збільшення флуоресценції. До цієї групи також належать скорпіонові праймери-проби, що є біфункціональними молекулами, у яких праймер ковалентно з’єднаний із пробою. Важливо, що кількісні методи аналізу дозволяють вимірювати флуоресценцію в кожному циклі ПЛР, а не тільки після закінчення аналізу.
Для ПЛР-РЧ з лінійною пробою у форматі TaqMan сигнал флуоресценції був високо-інтенсивний для всіх ізолятів B. anthracis і значно нижчий або взагалі відсутній для інших представників групи B. cereus sensu lato (для деяких ізолятів — негативний). Для ПЛР-РЧ з пробою у форматах молекулярного маяка позитивний сигнал реєстрували тільки для штамів B. anthracis (рис. 3).
На відміну від ПЛР-РЧ із шпильковою пробою у форматі молекулярного маяка, при проведенні ПЛР з лінійною пробою TaqMan реєстрували різний рівень сигналу флуоресценції для різних представників групи B. cereus sensu lato. На думку авторів, наступне секвенування фрагмента гена ssp, що ампліфікується, дасть змогу з’ясувати це питання.
Численні молекулярно-діагностичні компанії розробляють і випускають комплексні системи і тести для генетичного аналізу для клінічного, промислового ринків та ринку біозахисту. Такі системи уможливлюють швидке тестування генетичних та інфекційних захворювань завдяки автоматизації складних ручних лабораторних процедур. Інтеграція таких трьох складних
і тривалих процедур, необхідних для проведення ПЛР у реальному часі, як підготовка зразка, ампліфікація ДНК та детекція результатів аналізу в одному картриджі, дає можливість проводити швидке надійне молекулярне тестування, що особливо важливо для ідентифікації збудників інфекційних захворювань та патогенів з біотерорис-тичним потенціалом.
Поява перших високотехнологічних систем закритого типу, зокрема GeneXpert System (Cepheid Inc., США) [23], що базуються на
Рис. 1. Фрагмент множинного вирівнювання гена ssp для 1 ізоляту Bacillus anthracis, 20 ізолятів B. cereus та 25 ізолятів B. thuringiensis, на основі якого створено проби у форматах TaqMan і молекулярного маяка для ПЛР-РЧ. Наведено номери, що відповідають номерам ізолятів у базі даних GenBank:
в ізоляті B. anthracis DQ146892 виділено унікальну для B. anthracis інсерцію завдовжки 6 н. Для ізолятів B. cereus та B. thuringiensis виділено нуклеотиди, які не збігаються з нуклеотидами послідовності ізоляту B. anthracis DQ146892, що сприяє підвищенню специфічності проб. Чорна смуга під нуклеотидними послідовностями вказує на наявність висококонсервативних ділянок гена, а провали на ній відповідають варіабельним позиціям. Проба TaqMan 5'-FAM-cgcaagcttctggtgctagcattcaaagc-3'-RTQ1. Для проби у форматі молекулярного маяка підкреслено комплементарні фрагменти, які утворюють стебло шпильки (5'-FAM-cggcgcgcaagcttctggtgctagcattcaaagccgccg-3'- RTQ1)
я
к
Проба TaqMan
Рис. 2. Локалізація праймерів та проби на гені
ssp хромосомної ДНК збудника сибірки:
набір праймерів Banssp9 — BanssplO дозволяє ампліфікувати фрагмент гена ssp завдовжки 133 п. н., що містить цільову мішень для шпилькової (або лінійної) проби. Двома прямокутниками виділено прямий повтор
ПЛР-РЧ зі скорпіоновими праймерами-пробами, дозволила скоротити час генотипуван-ня або аналізу зразка на наявність інфекційного збудника до 30-45 хв. Такі системи можуть, з одного боку, слугувати альтернативою високовартісним референс-лаборато-ріям, оскільки не потребують спеціалізованого персоналу та лабораторних приміщень. А з другого боку, такі прилади закритого типу орієнтовані тільки на набори реагентів від конкретного виробника і не дають змоги використовувати реакційні компоненти від інших компаній. Створені в цій роботі набори праймерів та проб для детекції збудника сибірки можуть бути використані в системах відкритого типу в лабораторіях з обладнанням для проведення ПЛР-РЧ, яка увійшла в практику дослідних та клінічних лабораторій у всьому світі [24].
Таким чином, проведено порівняння проб у форматах TaqMan і молекулярного маяка для детекції бацил B. anthracis та диференціації їх від близькоспоріднених видів B. cereus і B. thuringiensis за допомогою ПЛР у реальному часі. Аналіз графіків ампліфікації показав, що шпилькова проба у форматі молекулярного маяка, молекулярною мішенню для якої є фрагмент гена ssp хромосомної ДНК, характеризується позитивним сигналом флуоресценції для ізолятів B. anthracis, тимчасом як для інших представників групи B. cereus sensu lato такий сигнал — відсутній. Висока специфічність шпилькової проби у форматі
Цикл
Проба молекулярний маяк
Цикл
Рис. 3. Ампліфікація ДНК представників групи B. cereus sensu lato за допомогою ПЛР-РЧ з різними форматами проб:
А — лінійна проба TaqMan;
Б — шпилькова проба у форматі молекулярного маяка
молекулярного маяка при детекції B. Œnthracis зумовлена гексануклеотидною делецією в сайті зв’язування проби в гені ssp хромосомної ДНК для ізолятів B. cereus та
B. thuringiensis. Важливою якістю розробленого набору праймерів і проб, на відміну від існуючих наборів на основі хромосомних генів rpoB [25, 26], gyrB [27], gyrA [28], 16S rRNA [7], plcr [20, 29], є здатність надійно диференціювати збудник сибірки від близь-коспоріднених видів, які характеризуються високим рівнем гомології нуклеотидних послідовностей.
Роботу виконано за фінансової підтримки д-ра Лиманського O. П., а також частково підтримано грантом АМН 95/2010 від НАМН України.
ЛІТЕРАТУРА
1. Lukhtanov E., Lokhov S., Gorn V. et al. Novel DNA probes with low background and high hybridization-triggered fluorescence // Nucl. Acids. Res. — 2007. — V. 35, N 5. — e30.
2. Chen C., Ridzon D., Broomer A. et al. Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR // Ibid. — 2005. — V. 33, N 20. — e179.
3. Afonina I., Mills A., Sanders S. et al. Improved biplex quantitative real-time polymerase
chain reaction with modified primers for gene expression analysis // Oligonucleotides. — 2006. — V. 16. — P. 395-403.
4. Afonina I., Ankoudinova I., Mills A. et al. Primers with 5' flaps improve real-time PCR // BioTechniques. — 2007. — V. 43. — P. 770-774.
5. Лиманская О. Ю., Мухина Т. Н, Степанши-на В. Н. и др. Детекция изолятов дикого типа и точечных мутаций в геноме устойчивых к изониазиду микобактерий туберкулеза // Мол. биол. — 2010. — Т. 44, № 4. — С. 635-645.
6. Ulrich M. P., Christensen D. R., Coyne S. R. et al. Evaluation of the Cepheid GeneXpert System for detecting Bacillus anthracis // J. Appl. Microbiol. — 2006. — V. 100, N 5. — P. 1011-1016.
7. Hadjinicolaou A. V., Demetriou V. L., Hezka J. et al. Use of molecular beacons and multi-allelic real-time PCR for detection of and discri -mination between virulent Bacillus anthracis and other Bacillus isolates // J. Microbiol. Meth. — 2009. — V. 78, N 1. — P. 45-53.
8. Pannucci J., Okinaka R. T., Sabin R., Kuske C. R. Bacillus anthracis pXO1 plasmid sequence conservation among closely related bacterial species // J. Bacteriol. — 2002. — V. 184, N 1.— P. 134-141.
9. Pannucci J., Okinaka R. T., Williams E. et al. DNA sequence conservation between the Bacillus anthracis pXO2 plasmid and genomic sequence from closely related bacteria // BMC Genom. — 2002. — V. 9, N 1. — P. 34-41.
10. Kolsto B., Tourasse N. J., Okstad O. A. What sets Bacillus anthracis apart from other Bacillus species? // Annu. Rev. Microbiol. — 2009. — V. 63. — P. 451-476.
11. Anthrax in humans and animals. Edited by Turnbull P. — Geneva: WHO Press, 2008. — 219 p.
12. Ellerbrok H., Nattermann H., Ozel M. et al. Rapid and sensitive identification of pathogenic and apathogenic Bacillus anthracis by real-time PCR // FEMS Microbiol. Lett. — 2002. — V. 214, N 1. — Р. 51-59.
13. Beyer W., Pocivalsek S., Bohm R. J. Poly me -rase chain reaction-ELISA to detect Bacillus anthracis from soil samples-limitations of present published primers // Appl. Microbiol. — 1999. — V. 87, N 2. — P. 229-236.
14. Herzog A. B., McLennan S. D., Pandey A. K. et al. Implications of limits of detection of various methods for Bacillus anthracis in computing risks to human health // Appl. Environ. Microbiol. — 2009. — V. 75, N 19. — P. 6331-6339.
15. Szinicz L. History of chemical and biological warfare agents // Toxicology. — 2005. — V. 214. — P. 161-181.
16. Бродский Л.И., Драчев А. Л., Татузов Р. Л., Чумаков К. М. Пакет прикладных программ для анализа последовательностей
биополимеров: GeneBee // Биополимеры и клетка. — 1991. — Т. 7, Вып. 1. — С. 10-14.
17. Schütz E., von Ahsen N. Spreadsheet software for thermodynamic melting // Biotechniques. — 1999. — V. 27, N 6. — Р. 1218-1224.
18. Rychlik W., Spencer W., Rhoads R. Optimization of the annealing temperature for DNA amplification in vitro // Nucl. Acids Res. — 1990. — V. 18, N 21. — P. 6409-6417.
19. Ko K. S., Kim J.-W., Kim J.-M. et al. Population structure of the Bacillus cereus group as determined by sequence analysis of six housekeeping genes and the plcR gene // Infect. Immun. —
2004. — V. 72, N 9. — P. 5253-5261.
20. Easterday W. R., Van Ert M. N., Simonson T. S. et al. Use of single nucleotide polymorphisms in the plcR gene for specific identification of Bacillus anthracis // J. Clin. Microbiol. —
2005. — V. 43, N 4. — P. 1995-1997.
21. Патыка Т. И., Патыка Н. В., Патыка В. Ф. Филогенетические взаимосвязи серологических вариантов Bacillus thuringiensis // Биополимеры и клетка. — 2009. — Т. 25, № 3. — С. 240-244.
22. Лиманська О. Ю., Муртазаєва Л. О., Лиманський О. П. Видоспецифічна детек-ція збудника сибірки // Біотехнологія. — 2012. — Т. 5, № 1. — С. 92-99.
23. Helb D., Jones M., Story E. et al. Rapid Detection of Mycobacterium tuberculosis and rifampin resistance by use of on-demand, near-patient technology // J. Clin. Microbiol. — 2010. — V. 48, N 1. — P. 229-237.
24. ПЦР «в реальном времени» / Под общ. pед. Ребрикова Д. В. — М.: Бином. Лаборатория знаний, 2009. — 215 с.
25. Qi Y., Patra G., Liang X. et al. Utilization of the rpoB gene as a specific chromosomal marker for real-time PCR detection of Bacil -lus anthracis // Appl. Environ. Microbiol. — 2001. — V. 67, N 8. — P. 3720-3727.
26. Ko K., Kim J.-M., Kim J.-W. et al. Identi fi ca -tion of Bacillus anthracis by rpoB sequence analysis and multiplex PCR // J. Clin. Microbiol. — 2003. — V. 41, N 7. — Р. 2908-2914.
27. Лиманская О. Ю., Лиманский А. П. Маркеры для видоспецифической детекции бацилл группы Bacillus cereus // Журн. микробиол. эпидемиол. иммунобиол. — 2008. — N 3. — С. 20-26.
28. Satterfield B., Kulesh D., Norwood D. et al. Tentacle Probes™: differentiation of difficult single-nucleotide polymorphisms and deletions by presence or absence of a signal in real-time PCR // Clin. Chem. — 2007. — V. 53, N 12. — P. 2042-2050.
29. Bavykin S., Lysov Y., Zakhariev V. et al. Use of 16S rRNA, 23S rRNA, and gyrB gene sequence analysis to determine phylogenetic relationships of Bacillus cereus group microorganisms // J. Clin. Microbiol. — 2004. — V. 43, N 8. — P. 3711-3730.
ДЕТЕКЦИЯ ВОЗБУДИТЕЛЯ СИБИРСКОЙ ЯЗВЫ С ПОМОЩЬЮ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ В РЕАЛЬНОМ ВРЕМЕНИ
О. Ю. Лиманская1- 2 Л. А Муртазаева1
С. Кли3
А. П. Лиманский1
ТУ «Институт микробиологии и иммунологии им. И. И. Мечникова НАМН Украины», Харьков
2Национальный научный центр «Институт экспериментальной и клинической ветеринарной медицины» НААН Украины, Харьков
3Институт Роберта Коха, Берлин, Германия
E-mail: olga.limanskaya@mail.ru
Точная идентификация бацилл Bacillus anthracis остается сложной задачей при дифференциации возбудителя сибирской язвы от близкородственных видов B. cereus и B. thuringiensis из-за высокой степени гомологии нуклеотидных последовательностей с представителями группы Bacillus cereus sensu lato. Разработаны молекулярно-генетические наборы праймеров и проб для полимеразной цепной реакции в реальном времени с гибридиза-ционно-флуоресцентной детекцией для дифференциации бацилл B. аnthracis от B. cereus и B. thuringiensis.
Целевой мишенью для праймеров и проб определен фрагмент гена ssp хромосомной ДНК, характеризующийся гексануклеотид-ной инсерцией только для изолятов B. аnthra-cis. Использование проб в форматах TaqMan и молекулярного маяка позволило с помощью полимеразной цепной реакции в реальном времени надежно дифференцировать бактерии B. аnthracis от близкородственных видов B. cereus и B. thuringiensis. Сигнал флуоресценции для шпилечных проб с форматом молекулярного маяка был положительным только для штаммов B. аnthracis, а для близкородственных видов B. cereus и B. thuringiensis — отрицательным. При использовании линейных проб TaqMan регистрировали высокоинтенсивный сигнал флуоресценции для всех изолятов B. аnthracis и сигнал значительно более низкой интенсивности — для B. cereus и B. thuringiensis. Разработанные подходы могут быть полезными для клинических, эпидемиологических и эпизоотологических исследований.
Ключевые слова: возбудитель сибирской язвы, Bacillus anthracis, полимеразная цепная реакция в реальном времени.
DETECTION OF CAUSATIVE AGENT OF ANTHRAX BY REAL-TIME POLYMERASE CHAIN REACTION
O. Yu. Limanskaya1' 2 L. A. Murtazaeva1
S. Klee3 A. P. Limanskii1
1Mechnikov Institute of Microbiology and Immunology of National Academy of Medical Sciences of Ukraine, Kharkiv
2National Scientific Center «Institute of Experimental and Clinical Veterinary Medicine» of National Academy of Agrarian Sciences of Ukraine, Kharkiv
3Robert Koch-Institut, Berlin, Germany
E-mail: olga.limanskaya@mail.ru
Correct identification of Bacillus anthracis bacilli remains a challenge for differentiation of the anthrax infectious agent from closely related species B. sereus and B. thuringiensis because of a high homology level of nucleotide sequences with the Bacillus cereus sensu lato instances. In this paper, we have developed molecular genetic sets of primers and probes for real-time polymerase chain reaction with hybridization-fluo-rescence detection for differentiation of B. anth-racis bacilli from В. sereus and B. thuringiensis.
Fragment of ssp gene of chromosomal DNA characterized by hexanucleotide insertion only for B. anthracis isolates was determined as final target for primers and probes. Applying of TaqMan and molecular beacon probes enabled reliable discrimination between B. anthracis bacteria and closely related species B. sereus and B. thuringiensis by real-time polymerase chain reaction. The fluorescence signal for hairpin probes with a molecular beacon format was positive only for B. anthracis strains but for closely related B. sereus and B. thuringiensis species it was negative. Using line TaqMan probes, we registered high-intensity fluorescent signal for all
B. anthracis isolates and a signal for B. sereus and B. thuringiensis was much low intensity. The developed approaches could be useful for clinical, epidemiological and epizootiological studies.
Key words: anthrax causative agent, Bacillus anthracis, real-time polymerase chain reaction.
