CC BY
170
25. Watanabe I., Ichihashi Y., Tanabe Sh., Amano M., Miyozaki N., Petrov E.A., Tatsukawa R. Trace Element accumulation in Baikal seal (Phoca
СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРАХ Принадлежность к организации Ершова Татьяна Сергеевна, кандидат биологических наук, доцент кафедры прикладной биологии и микробиологии, Институт рыбного хозяйства, биологии и природопользования (ИРХБиП), АГТУ, Астрахань, Россия; e-mail: ershova@mail.ru
Танасова Анастасия Сергеевна, младший научный сотрудник Научно - исследовательской части, аспирант кафедры гидробиологии и общей экологии, ИРХБиП, АГТУ, Астрахань, Россия; e-mail: ershova@mail.ru
Зайцев Вячеслав Федорович, доктор сельскохозяйственных наук, профессор, заведующий кафедрой гидробиологии и общей экологии, ИРХБиП, АГТУ, Астрахань, Россия; e-mail: ershova@mail.ru
Володина Виктория Викторовна, кандидат биологических наук, заведующая лабораторией ихтиопатологии, Каспийский научно-исследовательский институт рыбного хозяйства (КаспНИРХ), Астрахань, Россия; e-mail: kaspnirh@mail.ru
Статья поступила в редакцию 28.03.2016 г.
sibirica) from the lake Baikal. Environmental Pollution. 1996. Vol. 94, No. 2. P. 169-179.
INFORMATION ABOUT AUTHORS Affiliations
Tatyana S. Ershova, Ph. D. (Biology), assistant professor, the chair of Applied Biology and Microbiology, Institute of Fisheries, Biology and Environmental Management (IFBEM), ASTU, Astrakhan, Russia; e-mail: ershova@mail.ru
Anastasia S. Tanasova, junior researcher, Scientific Research Department, postgraduate, the chair of Hydrobiology and General Ecology, IFBEM, ASTU, Astrakhan, Russia; e-mail: er-shova@mail.ru
Vyacheslav F. Zaytsev, Doctor of Agrarian Sciences, professor, the head of the chair of Hy-drobiology and General Ecology, IFBEM, ASTU, Astrakhan, Russia; e-mail: ershova@mail.ru
Victoria V. Volodina, Ph. D. (Biology), the head of the laboratory of Ichthyopathology, Caspian Scientific Research Institute of Fisheries (CaspSRIF), Astrakhan, Russia; e-mail: kasp-nirh@mail.ru
Article was received 28.03.2016.
Биологические науки / Biological Science Оригинальная статья / Original Article УДК 631.523.13.579 / UDC 631.523.13.579
Детекции бактериальных инфекций с помощью ДНК-зондов
© 2016 Зубаирова П. Ю., Исрапов И. М.
Дагестанский государственный педагогический университет, Махачкала, Россия; e-mail: shahova_patya@mail.ru; sirizhat@mail.ru
Резюме. В статье использованы методы получения диагностических ДНК-зондов для детекции бактериальных инфекций. Способы получения зондов нуклеиновых кислот в настоящее время достаточно хорошо разработаны. Для идентификации возбудителей бактериальных инфекций методом молекулярной гибридизации необходим зонд, содержащий последовательность ДНК, которая являлась бы уникальной для данного микроба и могла бы служить его идентификации и дифференциации от других.
Ключевые слова: ДНК-зонды, ник-трансляция, рестриктазы, дот-гибридизация, рекомбинантные ДНК.
Формат цитирования: Зубаирова П. Ю., Исрапов И. М. Детекции бактериальных инфекций с помощью ДНК-зондов. // Известия Дагестанского государственного педагогического университета. Естественные и точные науки. Т. 10. № 2. 2016. С. 34-40.
Detections of Bacterial Infections by Using the DNA Probes
© 2016 Patimat Yu. Zubairova , Israp M. Israpov
Dagestan State Pedagogical University, Makhachkala, Russia; e-mail: shahova_patya@mail.ru; sirizhat@mail.ru
Abstract. The article suggests methods for diagnostic DNA probes for the detection of bacterial infections. Currently, methods for preparing nucleic acid probes are well developed. To identify the pathogens of bacterial infections using molecular hybridization probe is needed, comprising a DNA sequence that is unique to have this microbe and can serve the purpose of identification and differentiation of other species. Keywords: DNA probes, Nick-translation, restriktazy, dot hybridization, recombinant DNA.
For citation: Zubairova P. Yu., Israpov I.M. Detections of Bacterial Infections by Using the DNA Probes. Dagestan State Pedagogical University. Journal. Natural and Exact Sciences. Vol. 10. No. 2. 2016. pp. 34-40. (In Russian)
Естественные и точные науки ••• 35
Natural and Exact Sciences •••
ДНК-зонд (англ. DNA probe) - фрагмент ДНК, меченный тем или иным образом и использующийся для гибридизации со специфическим участком молекулы ДНК. Такой зонд позволяет идентифицировать комплементарные ему нуклеотидные последовательности. Для мечения зонда можно использовать хромофоры (флуоресцентное мечение), радиоактивные изотопы или группы, делающие возможным детектирование в ходе последующей ферментативной реакции (например, био-тиновое мечение). ДНК-зонды могут применяться для гетерогенного детектирования целевых нуклеиновых кислот, при котором мишень или зонд прикрепляют к твёрдой фазе или гелевой подложке. К такому типу детектирования относятся саузерн-блот, нозерн-блот, дот-блот, ДНК-микрочип и флуоресцентная гибридизация in situ. После осуществления гибридизации несвязанные избыточные молекулы зонда отмывают. Введённая в ДНК-зонд метка позволяет определить области, в которых произошло связывание ДНК-зонда и мишени.
В настоящее время способы получения зондов нуклеиновых кислот достаточно хорошо разработаны. Для идентификации возбудителей бактериальных инфекций методом молекулярной гибридизации необходим зонд, содержащий последовательность ДНК, которая являлась бы уникальной для данного микроба и могла служить его идентификации и дифференциации от других видов. Поэтому в качестве генных зондов могут быть использованы как ДНК, так и РНК, выделенные из бактерий. Метод клонирования рекомбинантных ДНК позволяет получить неограниченное количество любых фрагментов нуклеиновой кислоты [16. С. 557-558].
Диагностические тест-системы с применением клонированных нуклеотидных последовательностей в качестве молекулярных зондов были использованы для выявления атипичных штаммов возбудителя чумы, дефектных по продукции видоспе-цифических антигенов и, следовательно, не диагностируемых иммунологическими методами.
Плазмида пестициногенности рРst (6,0 МД) и плазмида, ответственная за синтез капсульного антигена pFra (60-65 МД), являются уникальными для возбудителя чумы, и потому перспективны в разработке на их основе видоспецифических для чумного микроба генетических зондов. О. Г. Шишкиной сконструирован видоспецифи-ческий ДНК-зонд на основе плазмиды рFra чумного микроба [14. С. 16-17].
Патогенные лептоспиры, по современной классификации составляющие один вид - Leptospira interrogans, демонстрируют возможности изменения антигенной структуры микроорганизма в процессе перси-стенции. Данные ряда работ Тедикова В. М., Фурсова В. В. и др. свидетельствуют об образовании антигенных вариантов возбудителя в организме диких и лабораторных животных. В связи с характерными трудностями выделения и культивирования перси-стирующих микроорганизмов разработаны методы обнаружения лептоспир, основанных на выявлении специфических фрагментов ДНК в исследуемых образцах.
Тест-система, позволяющая выявлять микобактерий - возбудителей туберкулеза в клиническом материале, разработана И. Г. Мальковым [6. С. 52-54].
Видовую принадлежность синтезированного фрагмента устанавливали, применяя олигонуклеотидные зонды, избирательно гибридизующиеся с ДНК M. tubercu-
losis, M. bovis, M. avium, M. paratuberculosis или M. fortuitum [11. С. 30-33].
ДНК-зонды для обнаружения у холерных вибрионов генов токсинообразования [5. С. 203-206] хотя и позволяют надежно дифференцировать потенциально токси-генные штаммы от нетоксигенных, все же не могут быть использованы в целях идентификации вида, поскольку гены vct присутствуют в геномах далеко не всех штаммов холерных вибрионов и, кроме того, имеют высокую степень гомологии с генами термолабильного токсина Escherichia coli. Генетические детерминанты нейраминида-зы также обнаруживаются не у всех холерных вибрионов [4. С. 112-114]. Поэтому Е. В. Монахова и соавт. конструировали ви-доспецифический зонд для идентификации холерных вибрионов из фрагментов хромосомной ДНК [9. С. 7-18].
Как известно, зонд представляет собой олиго- или полинуклеотид, несущий «ре-портерную» группу, необходимую для детекции гибридизации.
Одним из способов получения зондов является реакция ник-трансляции ("nick" -разрыв). ДНК-полимераза I E. coli присоединяет нуклеотидные остатки к 3'-гидроксильному концу, который образуется при разрыве одной из цепей двухцепочеч-ной молекулы ДНК. Кроме того, благодаря своей 5'-3'-экзонуклеазной активности фермент может удалять нуклеотиды с 5'-конца, образующегося при разрыве. Удаление нуклеотидов с 5"-конца разрыва и последовательное добавление нуклеотидов к 3'-концу приводят к перемещению разрыва вдоль цепи ДНК [7. С. 5-10].
Заменяя нуклеотиды, формирующие цепь ДНК, на радиоактивные или нерадиоактивные, можно получить меченную ДНК. Как известно, наибольшей чувствительностью обладают ДНК-зонды, меченные Р32. К недостаткам метода отнесем то, что, во-первых, работа с радиоактивным материалом небезопасна и требует определенных мер предосторожности, во-вторых, Р32 является короткоживущим изотопом (период полураспада 14 дней) и его активность быстро уменьшается. Этих недостатков лишено нерадиоактивное, так называемое «цветное» мечение. В таком случае модифицированные определенным образом нуклеотиды зонда выявляются в результате цветной реакции. Однако эта метка имеет низкую чувствительность «цветного» мече-ния.
Разработка нерадиоактивных меток развивается по трем направлениям на основе:
1) хемилюминесцентных меток;
2) флюоресценции хелатных комплексов европия;
3) биотин-стрептавидиновой системы.
Имеются методы прямого введения
фрагмента, необходимого для детекции, в зонд, например, хелатирующих фрагментов непосредственно в олигонуклеотиды и ДНК. Получены производные олигонуклео-тидов и ДНК, содержащие присоединенную щелочную фосфатазу. Однако значительно чаще детектируемую метку вводят с помощью ферментативной реакции. Сравнение чувствительности нерадиоактивных гибри-дизационных зондов, меченных флюо-ресцеином, хемилюминесцентной меткой (изолюменол) и ферментом (пероксидаза хрена, щелочная фосфатаза), показало, что наилучшее разрешение пригибридизации с ДНК достигнуто с пробами, меченными ферментом. Сравнение чувствительности нерадиоактивных зондов, меченных диок-сигенином и биотином для обнаружения Escherichia coli, показало, что соотношение сигнал/фон было меньше для биотинили-рованных проб по сравнению с дигоксиге-ниновыми.
В 1988 году А. Г. Альжановой и В. М. Генераловой в качестве метки было использовано производное биотина - фотобиотин [1. С. 223-225].
Чувствительность выявления ДНК при применении стрептавидин-пероксидазы составляла приблизительно 1х10, а при использовании конъюгата щелочная фосфатаза - стрептавидин - приблизительно 1х10 г ДНК.
В 1981 году Langer и сотрудники сообщили о синтезе аналогов нуклеотидтри-фосфатов (dUTP и UTP), которые содержат биотин, ковалентно связанный с С-5-позицией пиримидинового кольца.
Нуклеотидное производное может быть присоединено к нуклеиновой кислоте посредством ДНК-полимеразы I и служить мишенью для авидина или стрептавидина, которые имеют высокое специфическое сродство к биотину (константа дисс. = 10-14; 10-15. Меченную биотином ДНК выявляют с помощью конъюгата стрептавидин-фермент или авидин-фермент, в присутствии субстрата, по цветной реакции. P. R. Lange et al. [24], V. T. Chan et al. [17], M. Eweida et al. [20] показали, что чувствительность обнаружения ДНК с помощью биотинилированного зонда в дот-гибридизации при сравнении с радиоактивным зондом может составлять фемтаграм-мы ДНК.
Естественные и точные науки ••• 37
Natural and Exact Sciences •••
В 1990 году Л. З. Файзулиным [12. С. 5859] было доложено о результатах тестирования бактериальных вирусных инфекций с помощью ДНК-зондов, меченных биоти-ном по методу А. В. Карпухина и Н. Н. Вей-ко с соавт. [12. С. 58-59]. При использовании коньюгата стрептавидин-пероксидазы такие зонды по чувствительности выявления специфических последовательностей нуклеиновых кислот не уступали зондам, меченным Р32.
В последнее время в литературе описано множество методов применения биотини-лированных ДНК-зондов для определения различных видов бактерий [12. С. 93-94], соотетствующих по чувствительности радиоактивным зондам. В 1989 году был разработан нерадиоактивный ДНК-зонд для обнаружения Mycoplasm. Гибридизованный зонд выявляли с помощью авидина и щелочной фосфатазы. Метод позволил обнаружить до 0,3 нг ДНК в пробе [17. С. 80838091].
В 1992 году опубликованы результаты по идентификации, выделению, клонированию и характеристике фрагментов ДНК Mycobacterium tuberculosis, которые могут быть использованы в качестве зондов для идентификации M. tuberculosis. Чувствительность и специфичность их (2,5 и 2,3 т. п. н.) была проверена в Саузерн- и дот-блот гибридизации. Чувствительность метода - 200 пг, что эквивалентно 10 нг / мл [25. С. 551-557].
В. М. Тедиков и А. П. Добрица клонировали детерминанту протективного антигена (pag) Bac. anthracis СТИ и изучили его экспрессию в клетках E. coli, B. subtilis и B. anthracis [10. С. 3-8]. Сравнительно высокая продукция РА (до 20 мг/л культуры) была достигнута при клонировании pag в составе рекомбинантных плазмид рРА3 и рРА10 в клетках Bac. subtilis. Плазмида рРАЗбыла получена в результате встройки в бирепликонный вектор pOLYA15, способного удерживаться в клетках E. coli, и бацилл Bam H1 -фрагмента рРА2 с pag.
Показано, что штаммы B. subtilis с геном РА эффективно защищают морских свинок от летальных доз вирулентного штамма B. subtilis, являясь менее токсигенными по сравнению с вакцинным штаммом B. anthracis Stern.
В. Б. Тимошин с соавт. получили видо-специфический ДНК-зонд для идентификации токсигенных штаммов возбудителя сибирской язвы [11. С. 30-33]. Для идентификации штаммов возбудителя сибирской язвы отобрали 2 рекомбинантные плазми-
ды: pZAT1, содержащую BamH1/Hind111-фрагмент (900 т. п. н.) в составе вектора pBR322 и pZAT1, содержащую Hind111-фрагмент (1,7 т. п. н.) в составе вектора pUC19.
Анализ радиоавтографа показал наличие гомологии BamH1/Hind111-фрагмента плазмиды pZAT1 со всеми испытанными токсигенными штаммами Bacillus anthracis, в том числе и с шестью вирулентными. Сибиреязвенные штаммы, не содержащие плазмиду pXO1, и иные виды микроорганизмов в реакции гибридизации дали отрицательные результаты. При испытании в качестве зонда Hind111-фрагмента плазмиды pZAT1 результаты гибридизации с тестируемыми штаммами оказались идентичными полученным при использовании BamH1/Hind111 -фрагмента плазмиды
pZAT1.
Таким образом, на основе видоспецифи-ческой области плазмиды pXO1 сконструирован ДНК-зонд, позволяющий идентифицировать токсигенные штаммы возбудителя сибирской язвы, дифференцируя их от других представителей рода Bacillus и микроорганизмов иных таксономических групп.
Данные литературы свидетельствуют о том, что фенотипические признаки бактерий могут широко варьировать в зависимости как от условий культивирования, так и от аллельного состояния ответственных за экспрессию генов. Поэтому наиболее консервативной структурой, характеризующей вид микроорганизма, остается его геном. В этой связи основанная на характеристике генома возбудителя диагностика представляется наиболее перспективной. Использование видо-родоспецифических ДНК-зондов позволяет быстро идентифицировать бактериальных возбудителей в исследуемых пробах и определить их потенциальную эпидемическую опасность.
Современные подходы типирования бактерий, основанные на изучении структурной организации генома методами ре-стрикционного анализа, геномной дактилоскопии и полимеразной цепной реакции, позволяют выявлять тонкие генетические различия и достоверно идентифицировать возбудитель. Такой анализ генома бактерий обеспечивает более тонкую по сравнению с другими известными методами маркировку штаммов, что свидетельствует о перспективности этих методов в решении таких важных теоретических и практических задач, как определение генетической изменчивости бактерий, филогенетических взаи-
моотношений между различными штаммами, установление клональной истории изолятов, клонального анализа циркулирующих популяций возбудителя, изучение
с пероксидазой или щелочной фосфатазой // Молекулярная биология. 1991. Т. 22. № 3. 780 с.
2. Бурков А. Н. Методология конструирования коммерческих тест-систем для диагностики инфекционных заболеваний. Автореф. дисс. ... д-ра. мед. наук. Нижний Новгород, 2001. 20 с.
3. Дымшиц Г. М. Нерадиоактивно меченые олиго- и полинуклеотидные зонды - инструмент изучения структуры генома и диагностики // Со-ровский образовательный журнал. 2001. Т. 7. № 9. С. 30-37.
4. Касина И. В. Оценка и совершенствование контроля качества новых препаратов для выявления и идентификации возбудителя холеры. Дисс. ... канд. биол. наук. Саратов, 2009. 139 с.
5. Касина И. В., Саяпина Л. В., Анисимова Т. И., Малахаева А. Н., Адамова Г. В., Осина H. A., Шарова И. Н., Парамонов И. В., Савельев В. Н., Еременко Е. И., Замараев B. C., Антонов В. А. Внедрение новой тест-системы диагностической для выявления ДНК Vibrio cholerae (ctxAtcpA) методом ПЦР // Молекулярная диагностика холеры. Матер. VIII Рос. науч.-практ. конф. по проблеме «Холера». Ростов н/Д., 2005. С. 203-206.
6. Мальков И. Г. Дифференциация культур ми-кобактерий туберкулеза человеческого и бычьего видов с помощью ДНК-зондов // Ветеринария.
1993. № 2. С. 52-54.
7. Молекулярная биология клетки. В 3-х томах / Б. Альбертс, Д. Брей, Дж. Льюис и др. М.: Мир,
1994. 1558 с.
8. Момыналиев К. Т., Говорун В. М. Перспективы применения методов ДНК-диагностики в лабораторной службе // Клиническая лабораторная диагностика. 2000. № 4. С. 25-32.
9. Монахова Е. В., Писанов Р. В. Токсины холерных вибрионов // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2005. № 1. С. 7-18.
10. Тедиков В. М., Добрица А. П. Клонирование и экспрессия детерминанты протективного антигена Вас. anthracis в клетках E. coli, Вас. subtilis, Вас. Anthracis // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 1993. № 2. С. 3-8.
11. Тимошин В. Б., Замараев B. C., Антонов В. А., Липницкий A. B. Видоспецифический ДНК-зонд для идентификации токсигенных штаммов возбудителя сибирской язвы // Молекулярная генетика, микробиология и иммунобиология. 1994. № 1. С. 30-33.
12. Файзуллин Л. З., Сигаиатудлина Н. М., Вей-ко H. H., Немцова М. В., Богуш A. И., Карпухин A. B. Создание и применение нерадиоактивных ДНК-I
механизмов распространения, персистен-ции и формирования эпидемических вариантов.
2001. С. 21-24.
13. Фурсов В. В. Структурная организация плазмиды пестициногенности чумного микроба: ил РГБ ОД 61:85-3/1100, 1995. С. 75-78.
14. Шишкина О. Г. Получение видоспецифиче-ского генетического зонда на основе плазмиды, определяющей синтез антигена фракция 1 чумного микроба. Автореферат дисс. ... канд. мед. наук. Саратов, 1990. 20 с.
15. Brigati D. J, Leary J. J., Ward D. C. Rapid and sensitive colorimetric method for visualizing blotin-labeled DNA probes hybridized to DNA or RNA immobilized on nitrocellulose: Bio-blots. // Proc. Nation. Acad. Sci. 1983. Vol. 80. P. 4045-4049.
16. Buckland R. M. Strong signals from streptav-idin biotin // Nature. 1986. Vol. 320. P. 557-558.
17. Chan V. T, Fleming K. A., Mc Gee J. O. D. Detection of subpicogram quantities of specific DNA sequences on blot-hybridization with biotinylated probes // Nucl. Acid. Res. 1985. Vol. 13. P. 80838091.
18. Dahlen P., Hurskainen P., Lovgren T. Time-Resolved Fluorometry for the identification of Viral DNA in Clinical Speciments // J. din. Microbiol. 1988. Vol. 26. P. 2434-2436.
19. Eys van G. J. J. M., Gravecamp C., Gerritsen M. J. Detection of Leptospires in Polymerase chain Reaction // J. Clin. Microbiol. 1089. Vol. 27. № 10. P. 2258-2262.
20. Eweida M., Silt T. L., Sira S. Highly sensitive and specific non-radioactive biotinylated probes for dot-blot, sauthern and colony hybridization // J. of Virological Methods. Vol. 26. 1. P. 35-43.
21. Grothues D., Tummler B. Nonradioactive DNA-probes for detection Mycoplasm // Microbiol. and Immunolog. 1989. P. 129-132.
22. Hames B. O, Higgins S. J. Nucleic acid hybridisation. Oxford-Washington, 1985. P. 30, 99, 120.
23. Jablonski E., Tullis P. H., Moomaw E. W. Preparation of oligo-desoxinucleotidealkaline phos-phatase conjugate and their use as gibridization probs // Nucl. Acid. Res. 1986. Vol. 14. P. 6115.
24. Lange P. R, Waldrop A. L, Ward D. C. Enzymatic synthesis of biotin-labeled polynucleotides: novel nucleic acid affinity probes // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1981. Vol. 78. P. 6633-6637.
25. Mecalanos J. J., Swartz D. J., Pearson G. D. Cholera toxin genes: nucleotide sequence, deletion analysis and vaccine development // Nature. 1983. Vol. 306. P. 551-557.
26. Mickey S. Urdea, Brian D. Warner. Comparison non-isotopic hybridization methods by using
Литература
1. Альжанова А. Г., Генералова В. М. Определение нерадиоактивно-меченной фотобиотином ДНК с использованием конъюгатов стрептавидина
ибридизанионных тест-систем для диагностики // Материалы II Всес. симп. «Теоретические и прикладные аспекты молекулярной биологии». М.,
Естественные и точные науки ••• 39
Natural and Exact Sciences •••
synthetic oligonucleotides probes labeling fluorimet-ric, chemiluminescent and ferments // Nucl. Acids Res. 1988. No. 11. P. 4937-4956.
27. Renz M., Kurz C. A colorimetric method for DNA hybridization // NAR. Vol. 12. P. 3435-3444.
dase or alkaline phosphatase. Molekulyarnaya bi-ologiya [Molecular biology]. 1991. Vol. 22. No. 3. 780 p. (In Russian)
2. Burkov A. N. Metodologiya konstruirovaniya kommercheskikh test-sistem dlya diagnostiki in-fektsionnykh zabolevaniy [Methodology of designing of commercial test systems for diagnosis of infectious diseases]. Author's abstr. ... Dr. of Med. Sci. Nizhny Novgorod, 2001. 20 p. (In Russian)
3. Dymshits G. M. Nonradioactive marked oligo-and polynucleotide probes, the instrument for studying the structure of a genome and diagnostics. Soro-sovsky obrazovatel'nyy zhur-nal [Soros Educational Journal]. 2001. Vol. 7. No. 9. pp. 30-37. (In Russian)
4. Kasina I. V. Otsenka i sovershenstvovanie kontrolya kachestva no-vykh preparatov dlya vy-yavleniya i identifikatsii vozbuditelya kholery [The assessment and improvement of quality control of new preparations for revealing and identification of the causative agent of cholera]. Diss. ... Cand. Biol. Sci. Saratov, 2009. 139 p. (In Russian)
5. Kasina I. V., Sayapina L. V., Anisimov T. I., Ma-lakhaeva A. N., Adamova G. V., Osina N. A., Sharova I. N., Paramonov I. V., Savelyev V. N. Eremenko E. I., Zamaraev V. S., Antonov V. A. Introduction of new test system diagnostic for identification of DNA of Vibrio cholerae (ctxAtcpA) by PCR method. Molekulyarnaya diagnostika kholery. Mater. VIII Ros. nauch.-prakt. konf. po probleme «Kholera» [Molecular diagnosis of cholera. Mater. of the 8th Russ. sci-entif. pract. conf. on a problem "Cholera". Rostov-on-Don, 2005. pp. 203-206. (In Russian)
6. Malkov I. G. Differentiation of cultures of mycobacteria of tuberculosis of human and bull species with the help of DNA probes. Veterinariya [Veterinary Science]. 1993. No. 2. pp. 52-54. (In Russian)
7. Molekulyarnaya biologiya kletki [Molecular cy-tobiology]. In 3 volumes / B. Alberts, D. Brey, J. Lewis et al. Moscow, Mir Publ., 1994. 1558 p.
8. Momynaliev K. T., Govorun V. M. Peospects of applying the methods of DNA diagnostics in laboratory service. Klinicheskaya laboratornaya diagnostika [Clinical laboratory diagnostics]. 2000. No. 4. pp. 25-32. (In Russian)
9. Monakhova E. V., Pisanov R. V. Toxins of cholera vibrions. Molekulyarnaya genetika, mikrobiologi-ya i virusologiya [Molecular genetics, microbiology and virology]. 2005. No. 1. pp. 7-18. (In Russian)
28. Tchen P., Syvanen A., Ranki A. Time-resolved fluorometry: a sensitive method to quatify DNA-hybrids // NAR. 1986. Vol. 14. P. 1017-1028.
29. Welkos S. L. Plasmid-associated. Virulence factors of non-toxigenic (pXOl) Bacillus anthra-
cells. Molekulyarnaya genetika, mikrobiologiya i virusologiya [Molecular genetics, microbiology and virology]. 1993. No. 2. pp. 3-8. (In Russian)
11. Timoshin V. B., Zamaraev V. S., Antonov V. A., Lipnitsky A. V. Species-specific DNA probe for identifying the toxigenic strains of the anthrax causative agent. Molekulyarnaya genetika, mikrobiologiya i immu-nobiologiya [Molecular genetics, microbiology and an immunobiology]. 1994. No. 1. pp. 30-33. (In Russian)
12. Fayzullin L. Z., Sigaiatudlina N. M., Veyko N. N., Nemtsova M. V., Bogush A. I., Karpukhin A. V. Creating and applying the nonradioactive DNA-I ib-ridizanion test systems for diagnostics. Materialy II Vses. simp. «Teoreticheskie i prikladnye aspekty mo-lekulyarnoy biologii » [Materials of the 2nd All-Russ. simp. "Theoretical and applied aspects of molecular biology"]. Moscow, 2001. pp. 21-24. (In Russian)
13. Fursov V. V. Structural organization of a plasmid of a pesticinogenous plague microbe: il RSB OD 61:85-3/1100. 1995. pp. 75-78. (In Russian)
14. Shishkina O. G. Poluchenie vidospetsifich-eskogo geneticheskogo zonda na osnove plazmidy, opredelyayushchey sintez anti-gena fraktsiya 1 chumnogo mikroba [Receiving a species-specific genetic probe on the basis of the plasmid defining synthesis of an antigene fraction of 1 plague microbe]. Author's abstr. ... Cand. Med. Sci. Saratov. 1990. 20 p. (In Russian)
15. Brigati D. J, Leary J. J., Ward D. C. Rapid and sensitive colorimetric method for visualizing blotin-labeled DNA probes hybridized to DNA or RNA immobilized on nitrocellulose: Bio-blots // Proc. Nation. Acad. Sci. 1983. Vol. 80. P. 4045-4049.
16. Buckland R. M. Strong signals from streptav-idin biotin // Nature. 1986. Vol. 320. P. 557-558.
17. Chan V. T, Fleming K. A., Mc Gee J. O. D. Detection of subpicogram quantities of specific DNA sequences on blot-hybridization with biotinylated probes // Nucl. Acid. Res. 1985. Vol. 13. P. 80838091.
18. Dahlen P., Hurskainen P., Lovgren T. Time-Resolved Fluorometry for the identification of Viral DNA in Clinical Speciments // J. Clin. Microbiol. 1988. Vol. 26. P. 2434-2436.
19. Eys van G. J. J. M., Gravecamp C., Gerritsen M. J. Detection of Leptospires in Polymerase chain Reaction // J. Clin. Microbiol. 1089. Vol. 27. № 10. P. 2258-2262.
References
1. Alzhanova A. G., Generalova V. M. Definition of non-radioactive-marked with photobiotine DNA with the use of conjugates of streptavidine with peroxi-
cis. Microbial Pathogenesis. 1991 No 10. P. 183198.
10. Tedikov V. M., Dobritsa A. P. Cloning and expression of a protective antigene determinant of Вас. anthracis in E. coli, Вас. subtilis, Вас. anthracis
20. Eweida M., Silt T. L., Sira S. Highly sensitive and specific non-radioactive biotinylated probes for dot-blot, sauthern and colony hybridization // J. of Virological Methods. Vol. 26. 1. P. 35-43.
21. Grothues D., Tummler B. Nonradioactive DNA-probes for detection Mycoplasm. // Microbiol. and Immunolog. 1989. P. 129-132.
22. Hames B. O, Higgins S. J. Nucleic acid hybridisation. Oxford-Washington, 1985. P. 30, 99, 120.
23. Jablonski E., Tullis P. H., Moomaw E. W. Preparation of oligo-desoxinucleotidealkaline phosphatase conjugate and their use as gibridization probs // Nucl. Acid. Res. 1986. Vol. 14. P. 6115.
24. Lange P. R, Waldrop A. L, Ward D. C. Enzymatic synthesis of biotin-labeled polynucleotides: novel nucleic acid affinity probes // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1981. Vol. 78. P. 6633-6637.
СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРАХ Принадлежность к организации
Зубаирова Патимат Юсуповна, кандидат биологических наук, доцент кафедры естествознания, естественно-
географический факультет (ЕГФ), ДГПУ, Махачкала, Россия; e-mail:
shahova_patya@mail.ru
Исрапов Исрап Магомедович, доктор биологических наук, профессор кафедры естествознания, ЕГФ, ДГПУ, Махачкала, Россия; e-mail: sirizhat@mail.ru
Статья поступила в редакцию 28.03.2016 г.
25. Mecalanos J. J., Swartz D. J., Pearson G. D. Cholera toxin genes: nucleotide sequence, deletion analysis and vaccine development Nature. 1983. Vol. 306. P. 551-557.
26. Mickey S. Urdea, Brian D. Warner. Comparison non-isotopic hybridization methods by using synthetic oligonucleotides probes labeling fluorimet-ric, chemiluminescent and ferments // Nucl. Acids Res. 1988. No. 11. P. 4937-4956.
27. Renz M., Kurz C. A colorimetric method for DNA hybridization // NAR. Vol. 12. P. 3435-3444.
28. Tchen P., Syvanen A., Ranki A. Time-resolved fluorometry: a sensitive method to quatify DNA-hybrids // NAR. 1986. Vol. 14. P. 1017-1028.
29. Welkos S. L. Plasmid-associated. Virulence factors of non-toxigenic (pXOl) Bacillus anthracis. Microbial Pathogenesis. 1991 No 10. P. 183-198.
INFORMATION ABOUT AUTHORS Affiliations
Patimat Yu. Zubairova, Ph. D. (Biology), assistant professor, the chair of Natural Sciences, faculty of Natural Sciences and Geography (FNSG), DSPU, Makhachkala, Russia; e-mail: shahova_patya@mail.ru
Israp M. Israpov, Doctor of Biology, professor, the chair of Natural Sciences, FNSG, DSPU, Makhachkala, Russia; e-mail: sirizhat@mail.ru
Article was received 28.03.2016.
Биологические науки / Biological Science
Оригинальная статья / Original Article
УДК 636.5.6 (470.64) / UDC 636.5.6 (470.64)
Изменения в распределении и составе орнитофауны
Кабардино-Балкарии под влиянием антропогенного фактора
© 2016 Иванов И. В., Кетенчиев Х. А., Козьминов С. Г., Гемуева З. Х.
Кабардино-Балкарский государственный университет имени Х. М. Бербекова, Нальчик, Россия; e-mail: igvikiv@mail.ru; h_a_k@mail.ru; s_g_k@mail.ru;
meniki0510@mail.ru
Резюме. Рассматривается влияние антропогенных факторов на распределение и состав орнитофауны Кабардино-Балкарии. Приводятся примеры, когда виды, не являющиеся синантропами, расширяют с помощью человека свой ареал, проникая и осваивая новые для них биотопы; так, многие равнинные виды поселяются в горах, а дендрофилы в степных районах. В ландшафтах, где влияние деятельности человека значительно, намечается преобладание мелких форм. От деятельности человека страдают как промысловые, так и почти все крупные птицы.
Ключевые слова: орнитофауна, синантроп, евритопность, стенотопность, дендрофилы, ландшафт, биотоп, горный, равнинный, разнообразие.
