CC BY
253
ИЗУЧЕНИЕ ПЛАЗМИДНЫХ ДНК СИБИРЕЯЗВЕННЫХ ШТАММОВ С ПОМОЩЬЮ МЕТОДОВ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ
©2012 ^ ^
Зубаирова П.Ю.
Дагестанский государственный педагогический университет
В настоящее время наиболее удобными подходами при анализе бактериальных штаммов являются исследования внехромосомныхДНК (тазмидный анализ), а также зондирование бактериального генома с помощью специфических ДНК-зондов. В последнее время для диагностики и дифференциации возбудителей бактериальных инфекций широко применяют методы молекулярной гибридизации с использованием нерадиоактивных ДНК-зондов также изучение геномною полиморфизма близкородственных бактерий В работе использовали 3 вакцинных сибиреязвенных штамма: 55 ВНИИВВиМ, 71/12, СТИ-1.
Today the searching of extrachromosomal DNA (plasmid analysis) and also sensing bacterial genome using specific DNA-probes are the most convenient method for analysis of the bacterial strain. Recently the methods of molecular hybridization with using nonradioactive DNA-probes and also the study of genomic polymorphism closely related bacteria are used widely for diagnosis and differentiation of bacterial infections. Three anthrax vaccine strains were used in this paper: 55 ВНИИВВиМ, 71/12, СТИ-1.
Ключевые слова: плазмиды, ДНК-зонды, ник-трансляция, рестриктазы,
дот-гибридизация.
Keywords: plasmids, DNA-probes, nick-translation, endonuclease, dot-hybridization.
Плазмиды - генетические факторы бактерий, расположенные вне хромосом, представляют собой молекулы ДНК, способные к автономному размножению и к долгому существованию в этой форме. Не имея значения для роста и размножения бактерий, плазмиды обусловливают ряд их важных свойств. Плазмиды Б1 и Б контролируют способность бактерий действовать в качестве генетических доноров, плазмиды К - резистентность к лекарственным веществам, плазмиды Шу - синтез гемолизина, плазмиды I'п I - синтез энтеротоксина, плазмиды Со1 - синтез колицинов, плазмиды К - синтез некоторых антигенов. Знания о плазмидах имеют большое практическое значение: лекарственная резистентность бактерий в основном
контролируется плазмидами [5]. Благодаря плазмидам К лекарственная резистентность легко передается от одних бактерий к другим. Плазмиды I'п I, Шу и К участвуют в определении патогенных свойств бактерий [3]. Любой метод выявления патогенных микроорганизмов должен быть достаточно простым и обладать высокой специфичностью и чувствительностью. Специфичный диагностический тест должен давать положительный ответ только на микроорганизм или молекулу-мишень, чувствительный - обнаруживать очень малые количества такой мишени даже на фоне других микроорганизмов или молекул, загрязняющих образец. Простота метода подразумевает, что он является достаточно продуктивным, эффективным и недорогим для рутинного применения.
В последнее время плазмиды стали удобными объектами для использования их в качестве диагностических зондов, с помощью которых можно обнаруживать ту или иную опасную инфекцию [6]. Это удобный и относительно простой метод для решения
ряда вопросов эпидемиологии и микробиологии, так как плазмиды ответственны за синтез важнейших факторов патогенности. В последнее время для диагностики и дифференциации возбудителей бактериальных инфекций широко применяют методы молекулярной гибридизации с использованием нерадиоактивных ДНК-зондов, также изучение геномного полиморфизма близкородственных бактерий [4]. Зонды получают разными способами. Один из них состоит в следующем. ДНК патогенного микроорганизма расщепляют с помощью рестрицируюшей эндонуклеазы и клонируют в плазмидном векторе. Затем проводят скрининг рекомбинантных плазмид с использованием геномной ДНК как патогенного, так и непатогенного штаммов. Те плазмиды, которые содержат последовательности, гибридизующиеся только с ДНК патогенного штамма, составляют основу видоспецифичных зондов. После этого проводят ряд дополнительных гибридизаций с ДНК, выделенными из различных организмов, чтобы удостовериться, что потенциальные зонды не дают с ними перекрестной гибридизации. Для определения чувствительности метода каждый из зондов проверяют также на модельных образцах, в том числе и на смешанных культурах [1]. В большинстве лабораторий для гибридизации используют зонды, меченные каким-либо радиоактивным изотопом, чаще всего 32Р. Такие зонды обладают высокой удельной радиоактивностью и обеспечивают хорошее отношение сигнал/шум. Радиоактивно меченный зонд наносят на фильтр с фиксированной на нем ДНК-мишенью, проводят гибридизацию, отмывают несвязавшийся ДНК-зонд и детектируют метку с помощью радиоавтографии. Однако 32Р является короткоживущим изотопом, испускающим высокоэнергетическое излучение; при работе с ним необходимо использовать специальное оборудование и обеспечивать безопасную утилизацию отходов. Чтобы обойти эти трудности, были созданы нерадиоактивные системы детекции. Для усиления гибридизационного сигнала в этом случае используется ферментативное превращение хромогенного или хемилюминесцентного субстрата: первый из них под действием фермента изменяет окраску, а второй испускает свет. В большинстве подобных систем применяются ДНК-зонды, содержащие биотинилированные нуклеотиды. Гибридизация и детекция сигнала проводятся более или менее стандартным образом [2, 7-9]. Генетический аппарат сибиреязвенного микроба состоит из хромосомы и двух плазмид (pXOl и рХ02) - внехромосомных элементов, открытых в начале 80-х годов Брюсом Эдвардом Ивинсом и очень важных для проявления вирулентности и иммуногенности. Плазмида pXOl содержит три гена экзотоксина - pag, lef и суа. Первый из них кодирует синтез протективного антигена, второй - летального фактора, третий - отечного фактора. В pXOl имеются также гены регуляторов синтеза этих продуктов. Плазмида рХ02 содержит наиболее значимые гены, определяющие синтез капсулы.
В настоящее время в литературе описано несколько методов выделения высокомолекулярной плазмидной ДНК из клеток возбудителя сибирской язвы и других бацилл рода Bacillus [10-12].
Во всех этих методах используют 3 основные процедуры выделения плазмид: выращивание бактерий, лизис бактериальных клеток, очистка плазмидной ДНК. Для выделения плазмидной ДНК сибиреязвенных штаммов нами было использовано два метода: модифицированный метод Т. В. Casse [11] и метод R.Caspar, D.Robertson [10]. Наши модификации заключались во внесении в схему выделения этапа обработки клеток лизоцимом и протеиназой К. В работе использовали 3 вакцинных сибиреязвенных штамма: 55 ВНИИВВиМ, 71/12, СТИ-1. Для выращивания штаммов возбудителя сибирской язвы мы использовали твердые питательные среды (2% агар Хоттингера), так как урожай клеток на них был выше, чем при использовании жидких сред и достигал Ю10 микробных тел в 1 мл культуры. Для получения лизатов в суспензию клеток, содержащую 10 клеток/мл, добавляли лизоцим и инкубировали 1 час при 37°С. Для полного разрушения клеток добавляли лизирующую смесь, содержащую
0,1 Н раствор NaOH с 1% ДДС, приготовленную на ТБ буфере (pH 12,45), и инкубировали 30 минут. Количество лизированных клеток, полученных данным методом, достигало 98-99% (контроль осуществляли при просмотре мазков с помощью фазово-контрастного микроскопа).
Таким образом, для разрушения клеток вакцинных штаммов возбудителя сибирской язвы по
методу Т. В. Casse применяется обработка бактерий лизоцимом (10-15 мг/мл) и лизируютцей смесью, включающей в себя 0,1 Н NaOH с 1% ДЦС в ТЕ буфере, pH которого 12,45.
Для отделения плазмидной ДНК от хромосомной к лизату добавляли 5 М раствор NaCL до конечной концентрация 1 М, выдерживали на холоде в течение 14 часов и центрифугировали при 10000 об/мин при t = 4 С. Дальнейшую очистку плазмидной ДНК от белков проводили путем обработки смесью фенола с хлороформом после предварительной инкубации пробы ДНК протеиназой К в течение 30 минут при 37 С. Далее плазмидную ДНК осаждали добавлением 2 объемов охлажденного этанола и осадок растворяли в 10 мМ трис-буфере, pH 8,0.
Лизаты сибиреязвенных клеток по методу R.Caspar, D.Robertson получали по следующей схеме: клетки выращивали в жидкой питательной среде (LB-бульон) на шуттель-аппарате с постоянной аэрацией в течение 14-16 часов при 37 С. Осадок клеток ресуспендировали в 50 мл буфера Е и лизировали добавлением 100 мл подогретого щелочного раствора, состоящего из 50 мМ триса, 15% сахарозы, 3% ДЦС, 0,5 М NaOH и инкубировали в течение 30 мин при 60 С. Лизат экстрагировали дважды равным объемом смеси фенол-хлороформа и к водной фазе добавляли 25 мл охлажденного 2 М триса (pH 7,0) для нейтрализации. После переосаждения ДНК этанолом смесь инкубировали 30 мин при 37°С с РНК-азой (100 мкг/мл), добавляли протеиназу К (50 мкг/ мл) и выдерживали 20 мин при 55 С. После экстракции фенол-хлороформом ДНК из водной фазы, осаждали охлажденным перегнанным этанолом и растворяли в ЮмМ трис HCL, pH 8,0.
В результате были получены достаточно очищенные препараты плазмидной ДНК сибиреязвенных штаммов.
В дальнейших исследованиях выделение плазмидной ДНК осуществляли по методу R.Caspar, D.Robertson. Метод выделения плазмидной ДНК из штаммов возбудителя сибирской язвы, по R.Caspar, D.Robertson, позволяет получать в течение 6-8 часов в достаточных количествах очищенные образцы плазмидной ДНК.
Известно, что сибиреязвенные штаммы имеют одну или две плазмиды pXOl и рХОП (или могут вообще не иметь их), ответственные в основном за проявление вирулентных свойств [8, 9]. Спорообразующие сапрофиты рода Bacillus не содержат этих плазмид, поэтому в качестве ДНК-зонда мы использовали в дот-гибридизации плазмидную ДНК 71/12.
Плазмидную ДНК метили радиоактивным фосфором и био-11- дУТФ методом ник-трансляции. Меченные ДНК-зонды гибридизовали с препаратами хромосомных ДНК штаммов 55- ВНИИВВиМ, СТИ-1, 71/12, В. subtilis США, В. cereus 96, В. anthrocoides 1328 в различных разведениях. Дот-гибридизацию проводили в течение 16-18 часов без формамида при температурах 65, 68, 70, 73°С. Выявление результатов гибридизации осуществляли в случае применения Р-32, радиоавтографией, а в случае био-11-дУТФ - конъюгатом стрептавидин-щелочная фосфатаза в присутствии двойного субстрата (НБТ и БСИП).
Для определения чувствительности ДНК-зондов были приготовлены 10-кратные разведения ДНК из вакцинных штаммов бациллы сибирской язвы, концентрация которых была предварительно определена на спектрофотометре и составляла 200 нг /мл. Далее пробы наносили в точку на мембранный фильтр и гибридизовали с плазмидным ДНК-зондом, выделенным из штамма 71/12 (pXOl и рХОП) (табл. 1).
Приведенные в таблице 1 данные свидетельствуют о том, что плазмидный зонд, приготовленный из штамма 71/12 (pXOl, рХОП), меченный биотином и радиоактивным фосфором, выявляет не менее 1 нг ДНК вакцинных штаммов сибирской язвы в пробе, что соответствует концентрации 200 нг/мл. Однако при температуре гибридизации 70°С данный зонд дает положительный сигнал с исходным разведением ДНК В. cereus 100 нг).
Таблица 1
Результаты определения чувствительности выявления ДНК сибирской язвы с помощью ДНК- зонда методом дот-гибридизации
Разведение
Плазмидный ДНК- зонд меченый:
Пробы ДНК Биотином Фосфором
100 нг 10 нг 1 нг 100 пкг 100 нг 10 нг 1 нг 100 пкг
ДНК штамма N55 + + + - + + + -
ДНК штамма СТИ + + + - + + + -
ДНК штамма 71/12 + + + - + + + -
ДНК В.сегеиз + - - - + - - -
ДНКВ.эиШэ - - - - - - - -
" + проба выявлена, " - " - проба не выявлена
Для определения чувствительности ДНК- зондов на основе сибиреязвенной плазмиды, выделенной из штамма 71/12, были приготовлены 10-кратные разведения бактериальной культуры из вакцинных штаммов бациллы сибирской язвы (55-ВНИИВВиМ, СТИ-1, 71/12) на жидкой питательной среде ЬВ. Исходная концентрация клеток была предварительно определена титрованием на твердой питательной среде и составляла 10 клеток / мл. Далее из каждой пробы (1 мл) выделяли суммарную ДНК, наносили в точку на мембранный фильтр и гибридизовали при температуре 68°С и 73°С с плазмидным ДНК-зондом, меченным радиоактивным фосфором и био-11-дУТФ (табл. 2).
Таблица 2
Чувствительность выявления клеток сибирской язвы методом дот гибридизации
с помощью плазмидного ДНК-зонда
Пробы Плазмидный ДНК- зонд меченый:
Биотином 68°с Фосфором73°с
10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10
Штамм 55 + + + + + _ + + + + + _
Штамм СТИ + + + + + - + + + + + -
Штамм 71/12 + + + + + - + + + + + -
" + проба выявлена, " - " - проба не выявлена
Таким образом, в случае применения радиоактивного зонда минимальное количество выявляемых сибиреязвенных клеток составило 10 клеток/мл. При использовании биотинилированного ДНК-зонда в комплексе с коньюгатом стрептавидин - щелочная фосфатаза было выявлено такое же количество бактериальных клеток. Проведение сравнительной оценки детекции комплекса биотин - стрептавидин с применением пероксидазного коньюгата и коньюгата щелочной фосфатазы показало, что интенсивность пятен при использовании пероксидазного коньюгата была в 2 раза ниже.
Для определения специфичности ДНК-зонда 71/12 были исследованы 3 положительные пробы ДНК и 3 отрицательные пробы ДНК, выделенные от спорообразующих сапрофитов. Полученные результаты свидетельствуют о том, что представленные для испытания радиоактивные ДНК-зонды при 73°С не гибридизуются с контрольными препаратами ДНК, выделенными из спорообразующих сапрофитов, и дают четкий положительный сигнал с препаратами ДНК вакцинных штаммов сибирской язвы.
Однако представленные ДНК-зонды, меченные биотином, дают незначительный положительный сигнал с ДНК спорообразующих сапрофитов (В.сегеш 96) в разведениях до 100 нг при температуре гибридизации 65°Си ниже (табл. 3).
Таблица 3
Количество выявляемых клеток сибирской язвы методом дот - гибридизации с _____________________помощью плазмидного ДНК-зонда___________________________
Разведение Пробы ДНК Плазмидный ДНК-зонд меченый:
Биотином 65°С Фосфором 73°с
100 нг 10 нг 1 нг 100 пкг 100 нг 10 нг 1 нг 100 пкг
ДНК штамма N55 + + + - + + + -
ДНК штамма СТИ + + + - + + + -
ДНК штамма 71/12 + + + - + + + -
ДНК В.сегеиз + - - - + - - -
ДНКВ.эиШэ - - - - - - - -
" + проба выявлена, проба не выявлена
Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что плазмидную ДНК В. аМЬтаав штамма 71/12, меченную либо Р-32, либо био-11-дУТФ, можно применять в качестве ДНК-зонда для обнаружения сибиреязвенных плазмид, содержащих одну или две плазмиды, и для дифференциации сибиреязвенных штаммов от штаммов спорообразующих сапрофитов В.виЫШв США и В.ап1:Ьгосо1с1е8 1328 в дот-гибридизации, причем оптимальной температурой является 68-73°С.
При проведении гибридизации в температурном режиме свыше 73°С чувствительность метода снижалась. В то же время данный метод не позволяет четко дифференцировать В.апЙггаав от В.сегеш 96 с помощью нерадиоактивного ДНК-зонда при I = 65-68°С. Поэтому для идентификации сибиреязвенных штаммов был использован метод клонирования плазмидной ДНК рХ01, выделенной из сибиреязвенного штамма 55-ВННИВВиМ для поиска видоспецифического ДНК-зонда.
Целью данного этапа работы было изучение возможности конструирования видоспецифического для возбудителя сибирской язвы ДНК-зонда на основе нуклеотидных последовательностей высокомолекулярной плазмиды рХ01, выделенной из сибиреязвенного штамма 55-ВННИВВиМ.
Рестрикционный анализ плазмидной ДНК, выделенной из штамма 55-ВНИИВВиМ и расщепленной рестриктазами ВатН1, ЕсоМ, НтсПП, показал, что образуется набор высокомолекулярных фрагментов, которые имеют молекулярные массы, превышающие емкость вектора рИС19 (35). Поэтому для получения банка клонированных фрагментов плазмидную ДНК штамма 55-ВНИИВВиМ разрезали одновременно двумя рестриктазами Ват Н1+ Есо М, ВатН1+НтсШ1, затем суммарный препарат ДНК лигировали с линейными молекулами вектора рИС 19, полученного в результате обработки плазмиды рестриктазами ВатН1, ВатШ + ЕсоМ, ВатН1+ НтсПП (метод «шот-ган»). Лигированную смесь ДНК использовали для трансформации клеток Е.соК, штамм УМ109 по методу Т. Маниатис [3]. На селективной среде, содержащей ампициллин, Ч-Еал и ИПТЕ, было отобрано для дальнейшей работы 32 трансформанта. Для обнаружения видоспецифической последовательности среди случайного набора фрагментов плазмидной ДНК, клонированных в составе рекомбинантных плазмид на основе вектора риС19, проводили скрининг полученной клонотеки методами рестрикционного анализа и молекулярной гибридизации. Из этих клонов выделяли плазмидные ДНК, разрезали рестриктазой ВатШ, ЕсоМ, НтсПП и анализировали электрофорезом в 1% агарозе. Как следует из данных, представленных в таблице 4, полученные клоны имели размеры вставок от 0,6 до 4,5 т.п.о.
При анализе клонов методом дот-гибридизации было выявлено, что все рекомбинанты положительно гибридизовались с меченной Р-32 плазмидной ДНК штамма 55-ВНИИВВиМ.
Следующим этапом работы явилось проведение работ по отбору клонов, наиболее подходящих для конструирования гибридизационных ДНК-зондов. С этой целью 10-кратные разведения препаратов, выделенных из сибиреязвенных клеток и спорообразующих, наносили в точку на мембранные фильтры в количестве 5 мкл. В качестве ДНК-зонда было использовано 13 рекомбинантных плазмид Е.соК.
Таблица 4
Результаты рестрикционного анализа рекомбинантных плазмид эндонуклеазами
ВатШ, ЕсоШ, НтйШ
Номер плазмиды Размеры вставок
рВА 1 0,6
рВА 2 0,7
рВАЗ 0,8
рВА 4 0,9
рВА 5 1,0
рВАб 1,2
рВА 7 1,4
рВА 8 1,7
рВА 9 1,9
рВАЮ 2,3
рВА 11 2,7
рВА 12 3,0
рВА 13 4,5
При анализе клонов методом дот-гибридизации было выявлено, что все рекомбинанты положительно гибридизовались с меченной Р-32 плазмидной ДНК штамма 55-ВНИИВВиМ.
Следующим этапом работы явилось проведение работ по отбору клонов, наиболее подходящих для конструирования гибридизационных ДНК-зондов. С этой целью 10-кратные разведения препаратов, выделенных из сибиреязвенных клеток и спорообразующих, наносили в точку на мембранные фильтры в количестве 5 мкл. В качестве ДНК-зонда было использовано 13 рекомбинантных плазмид Е.соК, меченных радиоактивным фосфором в реакции ник-трансляции. В отдельных экспериментах для мечения использовали фрагменты-вставки, выделенные из рекомбинантных плазмид, методом электроэлюции. Во всех опытах температура гибридизации составляла 65°С.
В эксперименте использовали препараты ДНК, выделенные из вакцинных сибиреязвенных штаммов (СТИ-1, 55-ВНИИВВиМ, 71/12) и 5 препаратов хромосомных ДНК бацилл, полученных из коллекции музейных культур ВНИИВВиМ (В.сегеш, В.ап1:Ьгасо1с1е8, В.8иЬиП8, В.гг^а1:егшт, В.те8еп1епси8).
При определении специфичности полученных рекомбинантных плазмид в реакции дот-гибридизации с вакцинными штаммами сибирской язвы было обнаружено, что: клоны рВА8, рВАЮ гибридизовались со всеми препаратами ДНК бацилл; клоны рВА5, рВА9 давали положительный сигнал с ДНК бацилл, кроме В.8иЬ|Ш8, В.те8еп1епси8, а клоны рВАб, рВА7 не гибридизовались только с ДНК В.8иЬ|Ш8, хотя выявляли ДНК сибиреязвенных штаммов в концентрации 1 нг. Рекомбинантные клоны рВА11, рВА12, рВА13 также выявляли ДНК сибиреязвенных штаммов в концентрации 1 нг, но давали положительный сигнал с исходными разведениями сапрофитов, кроме В.мЛмПкч, В.гг^а1:егшт. Сравнение результатов дот-гибридизации тотальных ДНК различных штаммов бацилл с ДНК-зондами из рекомбинантных плазмид показало, что сибиреязвенные штаммы отличаются от сапрофитов по интенсивности сигналов радиоавтографии. Различия в степени гибридизации с молекулярными зондами рекомбинантных плазмид прежде всего связаны с разной степенью гомологии этих зондов комплементарным им нуклеотидным последовательностям в ДНК штаммов бацилл. Таким образом, при дот-гибридизации рекомбинантных клонов с хромосомной ДНК различных бацилл было показано, что данные фрагменты не обладают видовой специфичностью. Они гибридизовались со всеми испытанными штаммами бацилл с различной интенсивностью. Поэтому необходим дальнейший поиск и анализ плазмидной библиотеки для выявления видоспецифических фрагментов, не обладающих последовательностями, гомологичными ДНК спорообразующих сапрофитов.
Примечания
1. Ахмедзянов Ю. А., Найманов П. И. Использование плазмидного скрининга для дифференциации штаммов Bac.anthracis от близкородственных видов почвенных бацилл // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. 1989. № 11. С. 26-28. 2. Дымшиц Г. М. Нерадиоактивно меченые олиго- и полинуклеотидные зонды - инструмент изучения структуры генома и диагностики // Соровский журнал. 2001. Т. 7. № 9. 3. Ерошенко Г. А., Кутырев В. В. Молекулярные аспекты изучения возбудителей особо опасных бактериальных инфекций // Пробл. особо опасных инфекций. 2003. Вып. 86. С. 54-68. 4. Канапина А. Ш. Изучение природы плазмид В. Subtilis. М. : РАН Институт общей генетики имени Н. И. Вавилова, 1995. 5. Касина И. В., Саяпина Л. В., Анисимова Т. И., Малахаева А. Н., Адамова Г. В., Осина Н. А., Шарова И. Н., Парамонов И. В., Савельев В. Н., Еременко Е. И., Замараев В. С., Антонов В. А. Внедрение новой тест-системы диагностической для выявления ДНК Vibrio cholerae (ctxAtcpA) методом ПЦР. Молекулярная диагностика холеры // Мат-лы VIII Рос. науч.-практ. конф. Ростов н/Д., 2003. С. 203-206. 6. Монахова Е. В., Писанов Р. В. Токсины холерных вибрионов // Молекулярно-генетическая микробиология и вирусология. 2005. № 1. С. 7-18. 7. Оттен Т. Ф. Возможности и перспективы бактериологической диагностики микобактериоза // Проблемы туберкулеза и болезней легких. 2004. № 5. С. 32-35. 8. Проскурина В. А. Скрининг плазмидной ДНК сибиреязвенного микроба / Современные аспекты природной очаговости, эпидемиологии и профилактики особо опасных инфекционных болезней // Тез. докл. науч. конф. Омск, окт. 1993 г. Ставрополь, 1993. С. 347-348. 9. Тимошин В. Б., Замараев В. С., Антонов В. А., Липницкий А. В. Видоспецифический ДНК-зонд для обнаружения токсигенных штаммов возбудителя сибирской язвы // Молекулярно-генетическая микробиология и вирусология. 1994. № 1. 10. Caspar R. L, Robertson D. L. Purification and phisicalanalysis of B. anthracis plasmids pXOl and pX02 // Biochem. Biophis. Res. Com. 1987. V. 149. N 2. P. 362-366. 11. Casse F. C., Boucher J. S., Yulliod М. M. Identification and characterization of large plasmids in R.meliloti using agarose gel electrophoresis // J. Gen. Microbiol. 1979. V. 113. P. 229-242. 12. Ravel J., Jiang L., Stanley S. T. et al. The complete genome sequence of Bacillus anthracis Ames «Ancestor» // J. Bacteriol. 2009. V. 191. № 1. P. 445-446. 13. Yoshimura K., Yamamoto 0., Seki Т., Oshima Y. Distribution of heterogeneous and homologous plasmids in genus Bacillus// App. environm. Microbiol. 1983. V. 46. P. 1268-1275.
Статья поступила в редакцию 11.10.2012 г.
