Чувствительность/устойчивость к антибактериальным препаратам клинических штаммов холерного вибриона эльтор, выделенных на Кавказе в период седьмой пандемии холеры Текст научной статьи по специальности «Биологические науки»

Є

Чувствительность/устойчивость к антибактериальным препаратам клинических штаммов холерного вибриона эльтор, выделенных на Кавказе в период седьмой пандемии холеры

В. Н. САВЕЛЬЕВ, Б. В. БАБЕНЫШЕВ, И. В. САВЕЛЬЕВА, О. В. ВАСИЛЬЕВА, Л. В. ГУСЕВА, Г. М. ГРИЖЕБОВСКИЙ, Ш. Х. КУРБАНОВ, Б. М. АСВАРОВ, Б. А. БАТЫРОВА, И. Г. ДОРОШЕНКО, А. Д. АНТОНЕНКО

Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт, Ставрополь

Antibacterial Susceptibility/Resistance of Vibrio cholerae eltor Clinical Strains Isolated in the Caucasus During the 7th Cholera Pandemic

V. N. SAVELYEV, B. V. BABENYSHEV, I. V. SAVELYEVA, O. V. VASILYEVA, L. V. GUSEVA, G. M. GRIZHEBOVSKY,

SH. KH. KURBANOV, B. M. ASVAROV, B. A. BATYROVA, I. G. DOROSHENKO, A. D. ANTONENKO

Stavropol Research Plague Institute, Stavropol

Представлены данные о чувствительных и устойчивых к антибактериальным препаратам фенотипах холерного вибриона эльтор с различными наборами маркеров чувствительности или устойчивости, обусловивших вспышки и спорадические случаи холеры на Кавказе в 1970—1998 гг. Показано нарастание в 1990—1994 гг. по сравнению с 1970—1989 гг. доли фенотипов холерного вибриона, устойчивых к тетрациклину и хлорамфениколу, обычно используемых для лечения холеры. Холерные вибрионы эльтор при хранении их на искусственных питательных средах утрачивали отдельные маркеры устойчивости, в связи с чем ретроспективное изучение их антибиотикограмм имеет лишь ориентировочное прогностическое значение при выборе препарата для этиотропного лечения холеры при угрозе возникновения вспышки данного заболевания.

Ключевые слова: холерный вибрион эльтор, антибиотикофенотипы, антибиотикограммы.

-Q-

The data on antibacterial susceptibility and resistance of Vibrio cholerae eltor phenotypes with different sets of the susceptibility or resistance markers conditioning the outbreaks and sporadic cases of cholera in the Caucasus within 1970—1998 are presented. An increase of the number of the Vibrio cholerae phenotypes resistant to tetracycline and chloramphenicol usually used in the treatment of cholera was recorded in 1990—1994 vs. 1970—1989. The El Tor cholera vibrios stored on synthetic media lost some of their resistance markers, therefore the retrospective investigation of the antibioticograms was only of approximate prognostic value in the choice of the drugs for the etiotropic treatment of cholera in view of possible outbreak of the disease.

Key words: Vibrio cholerae eltor, antibioticophenotypes, antibioticograms.

Введение

Начавшаяся в 1961 г. на о. Сулавеси (Индонезия) и продолжающаяся в настоящее время седьмая пандемия холеры неоднократно проявляла себя на Кавказе: в1970, 1977, 1981, 1985, 1988-1989, и в 1993 гг. отмечены вспышки холеры в Азербайджане (занос инфекции из Ирана); в 1970—1973, в 1993, 1994 и в 1998 гг. — в Дагестане (заносы из Ирана, Индии, стран Ближнего Востока); в 1990 г. — в Ставропольском крае (занос холеры из Сирии). Зоной выноса холеры из Дагестана в 1994 г. были Ставропольский и Краснодарский края, где инфекция, благодаря

© Коллектив авторов, 2010

Адрес для корреспонденции: 355035, Ставрополь, ул. Советская, 13—15. СтавНИПЧИ

предпринятым противохолерным мероприятиям, не получила эпидемического распространения [1—3]. При такой географии заносов и распространения холеры на Кавказе клинические изоляты вибрионов эльтор оказались неоднородными по некоторым фенотипическим признакам, в том числе по чувствительности к антибактериальным препаратам.

Продолжающаяся тенденция приобретения микроорганизмами резистентности к антибиотикам, используемым для лечения инфекционных заболеваний, находит подтверждение и в отношении холерных вибрионов эльтор. Так, в первые же годы шествия седьмой пандемии холеры по Азиатскому континенту появились сообщения о находках клинических штаммов холерного вибриона биотипа эльтор, устойчивых к антибактериальным

-е-

e

препаратам, количество которых значительно возросло в 1980—1990 гг. прошлого столетия. Нередки случаи, когда от больных холерой вымвлялись вибрионы эльтор, устойчивые к нескольким препаратам антибактериального действия [4—10].

Известно, что механизм выработки бактериями устойчивости к антибиотикам сводится либо к спонтанным мутациям, либо к обмену генами или отдельными генетическими элементами между штаммами и даже видами микроорганизмов. В последнее время данные о конъюгативных плазмидах холерного вибриона, обусловливающих множественную резистентность к антибиотикам, дополнились результатами исследований интегронов и SXT-элемента, которые переносят и аккумулируют набор генов резистентности и реплицируются вместе с ДНК вибрионов в клеточных поколениях [11—13]. Полагают, что микробные клетки, содержащие генетические элементы по-лиантибиотикорезистентности, получают селективное преимущество в кишечнике теплокровного макроорганизма и количественно доминируют здесь над чувствительными клетками. На искусственных питательных средах (без антибиотиков), наоборот, преобладают клетки, не содержащие гены резистентности. Таково одно из современных объяснений нестабильности признака антибиотикоустойчивости холерного вибриона [2, 10, 12].

Цель данной работы — изучение чувствительности/резистентности к антибактериальным препаратам и вариабельности маркеров антибиотикорезис-тентности штаммов холерного вибриона биотипа эльтор, выщеленных от людей на Кавказе с 1970 по 1998 гг. и хранившихся в музее живыгх культур на искусственных питательных средах.

Материал и методы

В работе использованы 105 штаммов холерного вибриона Эльтор, выщеленныгх в Азербайджане (23 штамма), Дагестане (46 штаммов), в Краснодарском и Ставропольском краях — 10 и 25 штаммов соответственно. Все изоляты по культурально-морфологическим, биохимическим и серологическим свойствам были типичными представителями семейства Vibrionaceae, рода Vibrio, вида Vibrio cholerae eltor, сероваров Ogawa или Inaba, гемолизотрицательные в пробе Грейга; их геном содержал ген токсинообра-зования (ctxA).

О &

кра

ая

й

Кра Ст

са сно вр

ода оп

ар -

Воли

о К ж тон к ий №

О

к

р

S

я

ув

со

О

т

СО

S

т

о>

л

X

Е

а

§ о*

ув

со

О

т

Cd

S

т

0>

л

X

Е

3

5

0

00

1

5

3

1+

0 00 + ° <1

00

К И

нр J4 р

я,

а

§ о*

ув

со

О

т

СО

5

6

0

а

§ о*

1+

ю

28 56+7, 22 44+7 18 100 00 37 100 00

2,6+47 73 13 26+6,2 4 22,3+9,8 14 77,7+9,8 25 67,6+7,7 12 32,4+7,7

33 66+6,7 17 34+6,7 12 66,7+11 3 36 1 1,8+37 72 1,8+72 01

29 58+6,9 21 42+6,9 5 о +11 9 8 5 0 1+ 1 8 3 6+8,38 13 6, 26 + 0

2,5+61 8 2,5+48 24 61 2 11 5 8 17 5 28 75,7+7,0 2 3+79 0

00 0 00 00 18 00 37 100 00

2

3

ё 2 з т

0 0

я и

а 5

OV Ч

1 д ее ы и д

И Л

До л

( Л

A í

0W Cl

Л£ рр е0 а

Рб í а

_ е©Р 5^

Á ¡151

и 0йИ т н ёИi е

Н — а — и

-8- *

ф и в ° р

i

0 s и ■

м ф р

ё о а р |Ю

S о

РР

м

з ч

0> ш

не U

Ü и &

5 &

У

О

4 о s<

X

5

со

о

о

X

у

от

о

4 от

5

о-

X

о

0 ч о-

Ü

1

4

5

G\

ш

7>

ф

~о

S

ш

л

о-

X

U"

□

■О

ф

□

ш

■О

ш

S

X

S

X

ф

о

7>

S

X

S

W

о

о

со

о

(ь

(Ъ

(Ъ

со

т

л

л

ф

I

I

т

X

I

ш

ü

со

71

ш

W

ф

со

э

ф

■О

S

о

X

с

ф

д

о-

2

о

s<

о

Є

e|p :r

iR

<S

1

■&

o S ч Э

■A ce

«5 *

о Я 4 S

& S к *

& a

13 u

s * *1 ■&

©

a

ffl

■ 4

Ü ¡ — §

o =

e- ^

И -&

* § o -S

h ® У *e

«is § ^

lili

OVM(^^Din

^OOt^^Din

t^VOOOO

І І I

lllllllllllll

III III +ІІІІІ+ІІІІІІ

І І I

І I

І І I

lili

lililí

І I

І III

І I

II III +1 III

lili

lllll

CNC^TfiO'sO-HCNC^TfiO'sOt'^

1S

&

=S

cd

a

1S

&

3 oo

’cd S

VD , Л io

O 00

E2 o\

а сл Й ^

H —<

o p ^

^ C5\ ^

ч2о

5 "

4 O

o 25

с

o

CQ

Ü&

2|^ü o JT л 4

cd<^o

§~a ^

§ K; и S Й2£Я^

л, <^\ ^ <3\

5 Л g «

° 3S л s

и a cd o * &

„ К я ^

sk-^

E^2 (H Ч к Ü

и

o

<u

=1

П5

Ф

І

£

Штаммы хранились в 0,4% агаре Хоттингера под вазелиновым маслом при комнатной температуре (20—24°С).

Чувствительность/устойчивость штаммов холерных вибрионов к антибактериальным препаратам (ампициллин, гентами-цин, доксициклин, канамицин, хлора-мфеникол (левомицепин), полимиксин, рифампицин, фуразолидон, ципрофлокса-цин, норфлоксацин, офлоксацин) определяли диско-диффузионным методом [14]. Диски с данными антибиотиками получены из НИЦФ при СанктПетербургском НИИ антибиотиков и ферментов (Малое научно-производственное предприятие ИНКО 1ЦММ, Санкт-Петербург).

Результаты и обсуждение

Из данных, представленных в табл. 1, следует, что часть клинических штаммов холерных вибрионов эльтор, выделенных в Азербайджане (1971, 1977, 1981, 1985, 1988—1989 гг.), Дагестане (1970, 1973, 1993, 1995, 1998 гг.), в Ставропольском (1973, 1980 гг.) и Краснодарском (1987, 1993 гг.) краях, оказалась в 100 % случаев чувствительной к тетрациклину, доксициклину, хлорамфениколу (левомицетину) и к препаратам фторхинолонового ряда (ципро-флоксацину, норфлоксацину, офлоксацину) и устойчивой к ампициллину (16, 2 ± 6 %), кана-мицину (27±8,1%), эритромицину (32,4±7,7%), рифампици-ну (62,2±7,5%) и полимиксину (100%). Лишь один штамм, выделенный в Азербайджане в 1989 г., был устойчив к тетрациклину (2,7±2,6%). Холера, обусловленная холерными вибрионами эльтор с указанным спектром чувствительности/устойчивости к антибактериальным препаратам, занесена в Азербайджан из Ирана [3].

Занос холеры из Сирии на территорию Ставропольского края в 1990 г. [1] характеризовался обнаружением у больных и вибрионо-носителей холерных вибрионов эльтор, устойчивых к тетрациклину уже в 16,6±8,7%, а из стран Ближнего Востока в Дагестан в 1994 г. — устойчивыми к тетрациклину были 66±6,7% и к лево-мицетину 44±7% клинических изолятов. Вместе с тем штаммы

Є

холерных вибрионов, выделенные в Ставропольском и Краснодарском краях в 1990 и 1994 гг., оставались чувствительными в 100% случаев к доксициклину и препаратам фторхинолонового ряда, устойчивыми в том или ином проценте случаев к эритромицину, канами-цину, ампициллину, фуразолидо-ну, рифампицину и полимиксину.

По отношению к антибактериальным препаратам выделенные на Кавказе штаммы холерного вибриона эльтор подразделяются на фенотипы — антибиотикочувствительные и антибиотикоустойчивые (табл. 2 и 3). При этом антибиотикочувствительные фенотипы включали от 5 до 11 маркеров чувствительности к антибактериальным препаратам, наиболее часто применяемым в современной терапии холеры. Так, в Азербайджане (1971, 1977, 1981, 1985, 1988—1989 гг.), Дагестане (1970, 1973, 1993, 1995, 1998 гг.), Ставропольском (1973, 1980 гг.) и Краснодарском (1987, 1993 гг.) краях 37,8% штаммов имели фенотип У.екоІєтає єНот 1е1х+, ёох+, 1еу+, егіїг+, кап+, атр+, Шг+, сірг+, погі+, оАох+, гіГ+ (11 маркеров); 29,8% У.екоІєтає гНот — фенотип 1е1х+, ёох+, 1еу+, егіїг+, кап+, атр+, Шг+, сірг+, погГ+, оАох+ (10 маркеров) и 13,5% штаммов У.екоІєтає гНот — 1е1г+, ёох+, 1еу+, атр+, сірг+, погі+, оАох+ 7 маркеров).

Из семи фенотипов, выявленных на указанных территориях Кавказа, шесть содержали маркеры чувствительности к антибиотикам (тетрациклину, доксициклину, левомицетину), обычно применяемых для лечения больных холерой. Доля фенотипа с отсутствием чувствительности к тетрациклину составляла всего 2,7%. Во время вспышки холеры в Ставропольском крае в 1990 г. чувствительность к тетрациклину отсутствовала у одного фенотипа, но на его долю уже приходилось 16,6%.

Из семи фенотипов чувствительность к антибиотикам штаммов, обусловивших самую крупную вспышку холеры в Дагестане за весь период седьмой пандемии, только два фенотипа были чувст-

3

1

п>

£

1

Ф

К £=1

Краге

с а

§ ё

д

^ о т

0 р в

ир

ас о

р о

1 с с

1

вро 7, сно

опо 199ода

О 9 р

л зР

кра

Р

й

1

1

9 З

8 О 0

„ Я 8 & кра ай

1Д

9 а

1 А

з

е

р

~ О»

I— р

40 Не

8 А 40 ж гг а .) н

0\ Ці 4а ы Ю

X X X X X X

X X X X

X ХХХХХ X хххх

X X

X X

XXX хххх

ХХХХХХ XXX

хххх

X X

XXX

ХХХХХ ХХХХХ

XX хххх

ХХХХХХХХХХХХХ XXX хххх

»—ЮЗ 42» 0\ V)

£ § а Т Г 0= 8 Д а э

^ ІЗ

л

л

л

иеЗ

в Л с 0нТ в ° в я і о

но и в

л -

и ■

©

с о

а -в

ноо

Я о

а 2

а -в-

и

•в-

в

7

ьСС

и и т

Н №

а/

1

Ф

А

і

н

2

2

О

н

2

7>

О

с

о

х

2

СО

О"

ф

ф

ф

X

о

н

2

□

О-

О

Ф“

ф

ф

со

т

1

л

ф

I

1 т ф н ш

£

из

7>

ш

ы

ф

со

п

ф

■О

О

ф

с

Ф

д

о-

2

0 2<

п

ш

X

1 г

2 2

Є

& ©

& S

g

u

s- ^ §

£ 's e b о ^ ь ®

у «Є § ^

3523

5365

754662

15566

93 3 2 0

033436

6645

1676765

00 00 00 00

слслсл ;

UOUOUOUO 00 00 00 00

OW'tOO

4 5 5 5 3333

С С С С

^t"^00<^ ,

1 3 86 1 3 71 75 54 35 72 73 74 75 76

с

л

о

п

о a вй а ай

H o.

о &

вительными к тетрациклину, левомицетину и доксицикли-ну. У остальных пяти фенотипов (66%) отсутствовала чувствительность к тетрациклину, а у четырех — к тетрациклину и левомицетину.

Следует отметить, что все фенотипы холерного вибриона эльтор, выявленные в период эпидемических осложнений по холере на Кавказе с 1970 по 1994 г., обладали чувствительностью к препаратам хинолонового ряда: ципроф-локсацину, норфлоксацину и офлоксацину. В то же время антибиотикоустойчивые фенотипы изученных клинических изолятов, выделенных на Кавказе в 1970—1990 гг., содержали от 1 до 7 маркеров резистентности, в основном к эритромицину, канамицину, ампициллину, фуразолидону, полимиксину, и только 1 фенотип (V.cholerae eltor tetr-, eritr-, kan-, fmp-, rif-, pol-) был устойчив и к тетрациклину (см. табл. 3).

Однако в 1994 г., в период вспышки холеры в Дагестане, число маркеров резистентности у одного фенотипа (V.cholerae eltor tetr-, lev-, eritr-, kan-, amp-, fur-, rif-, pol-) возросло до восьми, а шесть фенотипов из семи выявленных оказались устойчивыми к тетрациклину, при этом четыре из них несли маркер устойчивости к тетрациклину и хло-рамфениколу. Доля полирезис-тентных фенотипов холерного вибриона эльтор с 8 маркерами устойчивости составила 26%, с 3—7 маркерами — 40% (см. табл. 3).

С целью изучения стабильности маркеров устойчивости проанализированы антибио-тикограммы 24 полирезис-тентных штаммов холерных вибрионов, определённые в год выделения и спустя 17—22 года хранения на искусственных питательных средах. Результаты, представленные в

О

табл. 4, позволяют сделать заключение о том, что первоначально резистентные штаммы холерного вибриона при длительном хранении на искусственных питательных средах потеряли от 2 до 8 маркеров устойчивости к антибактериальным препаратам. При этом 19 изолятов, изученных повторно, с интервалом в 17—22 года, сохранили от 3 до 7 маркеров устойчивости, оставшись, по-прежнему, по-лиантибиотикорезистентными. Утрата отдельных маркеров устойчивости к антибактериальным препаратам не коррелировала с диагностическими признаками штаммов и географическими местами выделения. Утрата связана, скорее всего, с селекцией чувствительных клеток бактериальной культуры, растущей на питательных средах, не содержащих антибиотик.

Заключение

Следует отметить, что все фенотипы холерного вибриона эльтор, выявленные в период эпидемических осложнений по холере на Кавказе с 1970 по 1994 г., обладали чувствительностью к препаратам хинолонового ряда: ципрофлоксаци-ну, норфлоксацину и офлоксацину. В то же время антибиотикоустойчивые фенотипы изученных клинических изолятов, выделенных на Кавказе в 1970—1990 гг., содержали от 1 до 7 маркеров резистентности, в основном к эритромицину, кана-мицину, ампициллину, фуразолидону, полимик-сину, и только 1 фенотип (V.cholerae eltor tetr-, eritr-, kan-, fmp-, rif-, pol-) был устойчив и к тетрациклину (см. табл. 3).

ЛИТЕРАТУРА

1. Богданов И. К. Совершенствование эпидемиологического надзора и ликвидация эпидосложнений по холере в Ставропольском крае. Дисс. в виде науч. докл. канд. мед. наук. Саратов, 1993; 44.

2. Грижебовский Г. М. Холера на Кавказе (теоретические и прикладные вопросы эпидемиологии).Дисс. в виде науч. докл. докт. мед. наук. Ставрополь, 1997; 78.

3. Савельев В. H., Алиев М. H., Мамедов С. Д. и др. О прогнозировании холеры эльтор в Азербайджане. Холера. Матер. Росс. науч. конф.: Вопр эпидемиол микробиол лаб диагностики Ростов-на-До ну, 1992; 50—53.

4. Подосинникова Л. С., Ломов Ю. М., Кудрякова Т. А. и др. Характеристика холерных вибрионов, выделенных в России и некоторых странах СНГ в 90-е годы. Мат Рос. науч.-практ. конф. по проблеме. «Холера». Ростов-на-Дону, 1995; 76—79.

5. Ръжко И. В., Цураева Р. И., Ломов Ю. М. и др. Результаты оценки активности антибактериальных препаратов in vitro и vivo эпидемически значимых штаммов холерного вибриона биотипа эльтор. Эпидемиол и инфек бол 2000; 3: 21-25.

6. Ръжко И. В., Дудина Н. А., Ломов Ю. М. и др. Активность 22 препаратов в отношении штаммов Vibrio cholerae О1 и 0139 серо-групп, выделенных от людей в период с 1927 по 2005 гг. в разных регионах мира. Антибиотики и химиотер 2005; 50; 8—9.

Однако в 1994 г., в период вспышки холеры в Дагестане, число маркеров резистентности у одного фенотипа ( V.cholerae eltor tetr-, lev-, eritr-, kan-, amp, fur-, rif-, pol-) возросло до восьми, а шесть фенотипов из семи выявленных оказались устойчивыми к тетрациклину, при этом четыре из них несли маркер устойчивости к тетрациклину и левомицетину. Доля полирезистентных фенотипов холерного вибриона эльтор с 8 маркерами устойчивости составила 26%, с 3—7 маркерами — 40% (см. табл. 3).

С целью изучения стабильности маркеров устойчивости проанализированы антибиотико-граммы 24 полирезистентных штаммов холерных вибрионов, определённые в год выделения и спустя 17—22 года хранения на искусственных питательных средах. Результаты, представленные в табл. 4, позволяют сделать заключение о том, что первоначалъно резистентные штаммы холерного вибриона при длительном хранении на искусственных питательных средах потеряли от 2 до 8 маркеров устойчивости к антибактериальным препаратам. При этом 19 изолятов, изученных повторно, с интервалом в 17—22 года, сохранили от 3 до 7 маркеров устойчивости, оставшись, по-прежнему, полиантибиотикорезистентными. Утрата отдельных маркеров устойчивости к антибактериальным препаратам не коррелировала с диагностическими признаками штаммов и географическими местами выделения. Утрата связана, скорее всего, с селекцией чувствительных клеток бактериальной культуры, растушей на питательных средах, не содержаших антибиотик.

7. Felsenfeld O. Review of recent trends in research and control of cholera.

WHO, Geneva 1965; 1-73.

8. Kuwahara S. S. et al. Drug sensitivity of eltor Vibrion strains isolated in the Philippines in 1964 and 1965. Bull WHO 1967; 37: 5: 763-771.

9. Prescolt L. M., Datta A., Datta G. C. Pattern of in vitro sensitivity in Calcutta strains of Vibrio cholerae. Ibid 1968; 39: 6: 967—970.

10. Iwanaga M., Toma C., Miyazato T. et al. Antibiotic resistance conferred by a class I integron and SXT constin in Vibrio cholerae O1 strains isolated in Laos. Antimicrob. Agents Chemoter 2004; 48: 2364—2369.

11. Thompson C. C., Thompson F. L., Vandemenlebroecke K. et al. Use of rec as an alternative phylogenetic marker in the family Vibrionaceae. Int J Syst Evol Microbiol 2004; 54: 3: 919—924.

12. Викторов Д. В., Алексеев В. В., Савченко С. Т., Лижицкий А. В. Множественная лекарственная резистентность Vibrio cholerae: генетический анализ и молекулярное типирование штаммов возбудителей. Холера и патогенные для человека вибрионы. Ростов-на-Дону 2006; 19: 71—73.

13. Lenz D. H., Miller M.B., Zhu J. et al. CszA and three redundant small RNAs regulate quorum sensing in Vibrio cholerae. Mol Microbiol 2005; 58: 4: 1186—1202.

14. МУК 4.2.2218-07 Лабораторная диагностика холеры. М.: 2007; 95.

О