CC BY
15
Чувствительность к антибактериальным препаратам изолятов Helicobacter pylori, выделенных от пациентов с предраковыми и онкологическими заболеваниями желудка
Л.Г. Морозова1, О.К. Поздеев1,2, А.О. Поздеева1, Л.В. Кипенская1, Е.В. Муравьева3
1 ГБОУ ДПО «Казанская государственная медицинская академия» Минздрава России, Казань, Россия
2 ГБОУ ВПО «Казанский государственный медицинской университет» Минздрава России, Казань, Россия
3 ГАУЗ «Республиканский клинический онкологический диспансер» Минздрава Республики Татарстан, Казань, Россия
Изучена частота и уровень инфицированно-сти H. pylori слизистой оболочки желудка среди пациентов с предраковыми (аденоматозный и гиперпластический полип, очаговая гипертрофия и эрозия) и онкологическими заболеваниями желудка (аденокарцинома, перстневидно-клеточный рак и карциноид). H. pylori был обнаружен у 75,5±3,1% обследованных, при этом среди пациентов со злокачественными образованиями — у 72,2±7,5%. У этих больных выявлена очень высокая степень обсемененности (104105 КОЕ/биоптат). У пациентов с предраковыми
заболеваниями преобладали средние и высокие степени обсемененности слизистой оболочки антрального отдела желудка. Исследованы уровни чувствительности выделенных штаммов Н. pylori к антибактериальным препаратам. Чувствительными к кларитромицину, амоксицил-лину, метронидазолу, тетрациклину и ципроф-локсацину были 85, 79, 32, 65 и 90% штаммов Н. pylori соответственно.
Ключевые слова: онкологические заболевания желудка, предрак, Helicobacter pylori, анти-биотикорезистентность.
Antimicrobial Susceptibility of Helicobacter pylori Isolates from Patients with Gastric Cancer and Precancer
L.G. Morozova1, О.К. Pozdeev 1<2, А.О. Pozdeeva1, L.V. Kipenskaya1, Е.V. Muravyeva3
1 Kazan State Medical Academy, Kazan, Russia
2 Kazan State Medical University, Kazan, Russia
3 Republican Clinical Oncology Dispensary, Kazan, Russia
This study was aimed to assess incidence and grade of colonization of gastric mucosa with Helicobacter pylori in patients with precancerous conditions (adenomatous polyp, hyperplastic polyp, focal hypertrophy, erosions) and gastric cancer (adenocarcinoma, signet ring cell carcinoma, carcinoid). The incidence of H. pylori infection was 75.5±3.1% in the overall patient population and 72.2±7.5% among patients with gastric cancer. The patients with gastric cancer had a high grade of coloni-
zation (104-105 CFU/biopsy). Most patients with precancerous conditions had intermediate and high grades of antral mucosa colonization with H. pylori. Antimicrobial susceptibility of H. pylori was determined by disk diffusion method. Susceptibility rates of H. pylori to clarithromycin, amoxicillin, metronidazole, tetracycline, and ciprofloxacin were 85%, 79%, 32%, 65%, and 90%, respectively.
Key words: gastric cancer, precancer, Helicobacter pylori, antimicrobial resistance.
Контактный адрес:
Лариса Викторовна Кипенская
Эл.почта: [email protected]
Введение
В 1994 году ВОЗ и Международное агентство по изучению рака (IARC) признали ^l^obacter pylori канцерогеном I порядка [1]. Позднее в ряде исследований было показано, что проведение ранней эра-дикационной терапии существенно снижает частоту развития рака желудка (РЖ) [2, 3]. В то же время были получены сведения, указывающие на отсутствие подобного влияния эрадикационной терапии [4, 5]. Тем не менее, большинство авторов полагают, что проведение эффективной эрадикационной терапии в определенной степени снижает риск развития РЖ, но не способно полностью предотвратить его развитие [6].
В настоящее время не вызывает сомнений этиологическая значимость H. pylori в развитии большинства случаев антрального неатрофического хронического гастрита (типа В), способного приводить к атрофии слизистой желудка и кишечной метаплазии, признанных предраковыми состояниями. Установлена корреляция между степенью развития H. pylori-ассоциированного гастрита и выраженностью кишечной метаплазии [7], показана обратимость кишечной метаплазии после успешной эра-дикационной терапии [8]. Также показано, что элиминация Н. pylori может не только предотвращать развитие и прогрессирование атрофии эпителия [9], но также возможно обратное развитие атрофии слизистой оболочки, хотя этот процесс отмечен не у всех пациентов и лишь через несколько лет после антигеликобактериальной терапии [8, 10, 11].
Цель исследования — изучить частоту инфици-рованности H. pylori слизистой оболочки желудка (СОЖ) среди пациентов с предраковыми и онкологическими заболеваниями желудка и определить чувствительность выделенных штаммов к антибактериальным препаратам.
Материал и методы
Обследовано 196 пациентов, обратившихся в отделение эндоскопии ГАУЗ «Республиканский клинический онкологический диспансер» Минздрава Республики Татарстан для эндоскопического исследования верхних отделов желудочно-кишечного тракта. Среди них: 83 человека с полипами желудка (у 28 диагностирован аденоматозный, у 55 — гиперпластический полипы), 35 — с очаговой гипертрофией, 42 — с эрозиями (у 34 диагностированы воспалительно-гиперпластические, у 8 — поверхностные). Также было обследовано 36 онкологических больных, среди которых у 30 диагностирована аденокарцинома желудка, у 5 — перстневидно-клеточный рак и у 1 пациента — карциноид.
От каждого больного брали по два биоптата СОЖ по 5 мг: первый — для первичной микроскопии в мазках, второй — для бактериологических исследований. Эту величину учитывали при расчете уровней обсемененности. Биоптаты помещали в 3-5 мл полужидкой тиогликолевой транспортной среды и немедленно доставляли в лабораторию. Для первичной микроскопии один биоптат стерильно разделяли на две части. Из одной части готовили два «раздавленных» мазка, фиксировали над пламенем горелки и окрашивали разведенным фуксином Пфайфера и по Граму. Мазки просматривали в световом микроскопе под иммерсией. Вторую часть биоптата исследовали в Clo-тесте на уреазную активность по методу, предложенному Б.Д. Старостиным и А.В. Петрутиком [12], модифицируя его внесением в пробирки под пробку индикаторных бумажек, пропитанных реактивом Круппа для выявления аммиака. Каждую пробу сопровождали контролем среды на отсутствие неспецифического щелочения. Пробы инкубировали в течение от 30-60 минут до 3-24 часов при 37 °С.
Для выделения H. pylori второй биоптат гомогенизировали в 1 мл физиологического раствора хлорида натрия и высевали на плотные питательные среды в объеме одной капли (0,05 мл). В качестве питательных сред использовали эритрит-кровяной агар с эритроцитами барана с 2 мкг/мл амфотери-цина В (Oxoid Ltd, Великобритания). В исследованиях, проведенных после 2012 года, эритрит-кровяной агар дополняли внесением 5% эмбриональной телячьей сыворотки (Serva, Германия). Посевы инкубировали в течение 5 суток в микроаэрофиль-ных условиях (10% CO2, 5% O2) при 37 оС. Колонии H. pylori имели характерный вид: мелкие прозрачные, диаметром 0,5-1 мм, влажные или суховатые, иногда окруженные небольшой зоной гемолиза. У выделенных культур определяли подвижность в препарате «раздавленная капля» при фазово-контрастной микроскопии с масляной иммерсией. Просматривали не менее 10-12 полей зрения и выявляли бактерии с характерной «винтообразной» подвижностью. Биохимическую идентификацию проводили по наличию оксидазной, каталазной и уреазной активности.
Факт присутствия H. pylori подтверждали по совокупности положительных результатов бактери-оскопического, бактериологического и биохимического исследования. Как положительный результат рассматривали также случаи обнаружения в мазках-отпечатках грамотрицательных палочек характерной морфологии и положительных результатов Clo-теста. Как отсутствие H. pylori рассматривали данные, включающие отрицательные результа-
Таблица 1. Частота обнаружения H. pylori в биоптатах СОЖ у больных в зависимости от патологии
Вид патологии Количество больных, инфицированных H. pylori, n (%)
Рак желудка 26 (72,2: ±7,5)
Аденоматозный полип 22 (78,6: ±7,8)
Гиперпластический полип 34 (61,8: ±6,6)
Эрозия 38 (90,1±4,6)
Очаговая гипертрофия 28 (80±6,8)
Таблица 2. Частота обнаружения H. pylori в биоптатах СОЖ в зависимости от места взятия биоптата
Количество случаев выделения H. pylori, n (%)
Вид патологии -
область патологии прилегающая слизистая
Аденоматозный полип 16 (72,7±9,5) 20 (90,9±6,1)
Гиперпластический полип 24 (72,7±7,75) 31 (93,9±4,2)
Эрозия 34 (89,5±4,98) 34 (94,0±3,9)
Очаговая гипертрофия 22 (78,6±7,8) 27 (96,4±3,5)
Рак желудка 23 (88,5±6,3) 26 (100)
ты бактериоскопии, выделения культур бактерий и положительный Clo-тест с биоптатом, так как Clo-тест достаточно неспецифичен (он может быть положительным в присутствии других микроорганизмов: протеев, стафилококков, кандид и др.).
Степень обсемененности биоптата определяли путем подсчета колоний, выросших на плотных средах. При этом исходили из следующих расчетов: биоптат массой 5 мг растирали в присутствии 1 мл жидкости, т. е. получали разведение 1:200, засевали на питательные среды по 1 капле (0,05 мл) суспензии. Соответственно уровень обсемененности равнялся частному от деления количества выросших колоний на объем гомогената, умноженному на объем физиологического раствора, в котором гомогенизировали биоптат. Обнаружение в мазках до 20 микробных клеток H. pylori рассматривали как слабую обсемененность (+), от 20 до 50 — как умеренную (++), более 50 — высокую степень обсемен-ности (+++).
Определение чувствительности штаммов H. pylori к антибактериальным препаратам проводили диско-диффузионным методом. Следует отметить, что до настоящего времени отсутствует стандартизованный метод определения чувствительности H. pylori к антибиотикам. В своих исследованиях мы руководствовались рекомендациями С. McNulty с соавт. [13]. В работе использовали диски с метро-нидазолом (5 мкг), кларитромицином (2 мкг), эритромицином (5 мкг), тетрациклином (30 мкг), амок-сициллином (10 мкг), ципрофлоксацином (5 мкг)
и фуразолидоном (1 мкг) производства HiMedia Lab (Индия).
После идентификации культуры готовили бактериальную взвесь, соответствующую стандарту мутности по шкале Мак-Фарланда 0,5 (1,5х108 микробных тел/мл). Затем 1 мл взвеси наносили на кровяной агар и равномерно распределяли по чашке Петри. Диски вносили из расчета шести дисков на чашку Петри и культивировали пять суток в микроаэрофильных условиях при 37 °С. Затем с помощью штангенциркуля измеряли диаметры зон задержки роста вокруг дисков и сопоставляли с данными таблиц, содержащих пограничные значения диаметров зон задержки роста для устойчивых, умеренно устойчивых и чувствительных штаммов.
Полученные данные подвергали статистической обработке с вычислением средней ошибки показателя m с использованием программы «Microsoft Office Excel 2007». Статистически значимыми считали результаты при р<0,05.
Результаты
Проведенные исследования показали, что среди 196 обследованных пациентов H. pylori обнаружен у 148 (75,5±3,1%). Частота обнаружения была практически одинаковой у мужчин и женщин и составила соответственно 73,1 ±4,6 и 70,7±3,95%.
Наиболее часто бактерии выявляли у пациентов с эрозиями, наименьшую — у больных с гиперпластическими полипами (табл. 1).
Таблица 3. Уровни обсемененности H. pylori биоптатов СОЖ в зависимости от вида патологии, КОЕ/биоптат
Количество биоптатов
Диагноз Умеренная Высокая Очень высокая
обсемененность обсемененность обсемененность
(101-102) (103-104) (104-105)
Полипы* 23 24 8
Эрозии 12 25 1
Очаговые гипертрофии 11 13 4
Рак желудка 5 7 14
Примечание: * — аденоматозные и гиперпластические полипы
Таблица 4. Распределение выделенных изолятов H. pylori по чувствительности к антибактериальным
препаратам,%
Антибиотик Чувствительные Умеренно устойчивые Устойчивые
Кларитромицин 85,6±11,7 10,4±3,2 3,5±0,7
Амоксициллин 78,5±12,3 21,5±3,6 0
Ципрофлоксацин 91,6±10,9 8,4±2,7 0
Тетрациклин 64,3±8,6 35,7±6,1 0
Фуразолидон 41,7±6,3 58,3±8,3 0
Метронидазол 32,0±5,1 32,3±8,7 35,8±9,2
Также была изучена зависимость частоты выделения бактерий от места забора биоптата. Проведенные исследования выявили определенные различия в частоте выделения H. pylori из очага поражения и области визуально неизмененной СОЖ, но они не достигали границ статистической достоверности (табл. 2)
Определение уровней обсемененности биопта-тов показало, что у больных раком желудка высокая частота обнаружения H. pylori коррелировала с высокой степенью обсемененности (104-105 КОЕ/ биоптат). У пациенов с полипами, эрозиями и очаговыми гипертрофиями СОЖ на фоне высокой частоты выделения Н. руЬп высокие уровни обсе-менности биоптатов наблюдали реже. У большинства больных отмечали средние уровни обсеменен-ности СОЖ (табл. 3).
Изучение чувствительности к антибиотикам у выделенных штаммов Н. руЬп показало, что они чувствительны к кларитромицину, амоксициллину и ципрофлоксацину в 86, 79 и 92% случаев соответственно (табл. 4). Чувствительными к тетрациклину были 65% штаммов. Наименьшую чувствительность бактерии проявляли к метронидазолу (32%).
Заключение
Значение эрадикационной терапии в профилактике рака желудка остается предметом дискуссии. Вполне логично полагать, что элиминация Н. руЬп снижает выраженность воспалительного процесса и, соответственно, атрофического гастрита, что, в свою очередь, снижает риск развития кишечной метаплазии [14]. В пользу этого предположения, впервые выдвинутого P. Correa в 1995 г., говорят результаты ряда исследований, различающихся между собой лишь длительностью наблюдений за пациентами [4, 5, 15]. Кроме того, показано, что проведение эрадикационной терапии пациентам, перенесшим оперативное удаление опухоли, также снижает риск ее рецидива [16]. В то же время, проведенные недавно ретроспективные исследования указывают на отсутствие какого-либо влияния предшествующей эрадикации H. pylori на риск развития рака желудка [17, 18]. Указанные разногласия указывают на необходимость поиска адекватных прогностических маркеров возможного развития рака желудка среди пациентов с целью разработки показаний для проведения эрадикационной терапии.
Литература
1. C Working Group: Schistosomes, liver flukes and Helicobacter pylori. IARC Working Group on the Evaluation of Carcinogenic Risks to Humans. Lyon, 7-14 June 1994. C Monogr Eval Carcinog Risks Hum 1994; 61:1-241.
2. Wu C.Y., Kuo K.N., Wu M.S., et al. Early Helicobacter pylori eradication decreases risk of gastric cancer in patients with peptic ulcer disease. Gastroenterology 2009; 137:1641-8.
3. Ma J.L., Zhang L., Brown L.M., et al. Fifteen-year effects of Helicobacter pylori, garlic, and vitamin treatments on gastric cancer incidence and mortality. J Natl Cancer Inst 2012; 104:488-92.
4. Correa P., Fontham E. T., Bravo J. C., et al. Chemoprevention of gastric dysplasia: randomized trial of antioxidant supplements and anti-Helicobacter pylori therapy. J Natl Cancer Inst 2000; 92:1881-8.
5. Fuccio L., Zagari R.M., Eusebi L.H., et al. Meta-analysis: can Helicobacter pylori eradication treatment reduce the risk for gastric cancer? Ann Intern Med 2009; 151:121-8.
6. Cavaleiro-Pinto M., Peleteiro B., Lunet N., Barros H. Helicobacter pylori infection and gastric cardia cancer: systematic review and meta-analysis. Cancer Causes Control 2011; 22:375-87.
7. Eidt S., Stolte M. Prevalence of intestinal metaplasia in Helicobacter pylori gastritis. Scand J Gastroenterol 1991; 29: 607-10.
8. Kokkola A., Sipponen P., Pautelin. H., et al. The effect of Helicobacter pylory eradication on the natural course of atrophic gastritis with dysplasia. Aliment Pharmacol Ther 2002; 16:515-20.
9. Sakaki N., Kozswa H., Egaea N., et al. Ten-year prospective follow-up study on the relationship between Helicobacter pylori infection and progression of atrophic
gastritis, particularly assessed by endoscopic findings. Aliment Pharmacol Ther 2002; 16:198-203.
10. Fichman S., Niv Y. Histological changes in the gastric mucosa after Helicobacter pylori eradication. Eur J Gastroenterol Hepatol 2004; 16:1183-88.
11. Hojo M., Miwa H., Ohkusa T., et. al. Alteration of histological gastritis after cure of Helicobacter pylori infection. Aliment Pharmacol Ther 2002; 16:1923-32.
12. Старостин Б.Д., Петрутик А.В. Экспресс-метод диагностики инфицированности Campylobacter pylori желудка и двенадцатиперстной кишки. Клиническая медицина 1989; 67:50-2.
13. McNulty C., Owen R., Tompkins D., et al. Helicobacter pylori susceptibility testing by disc diffusion. J Antimicrob Chemother 2002; 49:601-9.
14. Correa P. Helicobacter pylori and gastric carcinogenesis. Am J Surg Pathol 1995; 19 (Suppl 1): S37-S43.
15. Take S., Mizuno M., Ishiki K., et al. The long-term risk of gastric cancer after the successful eradication of Helicobacter pylori. J Gastroenterol 2011; 46:318-24.
16. Fukase K., Kato M., Kikuchi S., et al. Effect of eradication of Helicobacter pylori on incidence of metachronous gastric carcinoma after endoscopic resection of early gastric cancer: an open-label, randomised controlled trial. Lancet 2008; 372:392-7.
17. Maehata Y., Nakamura S., Fujisawa K., et al. Long-term effect of Helicobacter pylori eradication on the development of metachronous gastric cancer after endoscopic resection of early gastric cancer. Gastrointest Endosc 2012; 75:39-46.
18. Kato M., Nishida T., Yamamoto K., et al. Scheduled endoscopic surveillance controls secondary cancer after curative endoscopic resection for early gastric cancer: a multicentre retrospective cohort study by Osaka University ESD study group. Gut 2013; 62:1425-32.
